TBC, "the reemergent killer"
aumento della tubercolosi
nei paesi industrializzati
crescente diffusione dei
ceppi di M. tuberculosis
multiresistenti (MRMT)
la diagnostica tradizionale
esame microscopico
esame colturale
identificazione
antibiogramma
esame microscopico
colorazione di Ziehl-Neelsen
fluorescenza
tecnica scarsamente sensibile e non specie-specifica
Ziehl-Neelsen
1000x
fluorescenza
400x
metodi colturali "alternativi"
metodo radiometrico
terreno bifasico
terreno con indicatore fluorescente
terreno Redox
il metodo radiometrico
flaconcini sigillati di terreno liquido
contenente un substrato (ac. palmitico)
marcato con 14C
miscela di antibiotici (PANTA) per il
contenimento delle contaminazioni
liberazione di CO2 radiomarcata ad
opera del metabolismo batterico
rilevamento di radioattività nella fase
gassosa come spia di batteri
metabolicamente attivi
notevole accorciamento dei tempi di crescita
maggior sensibilità
il terreno bifasico
flacone di terreno liquido per
micobatteri
miscela di antibiotici (PANTA) per il
contenimento delle contaminazioni
slide con vari tipi di terreni solidi
(all'uovo, agarizzato, agar
cioccolato)
arricchimento nel brodo e sviluppo
di colonie isolate sul terreno solido
moderato accorciamento dei tempi di crescita
maggior sensibilità
medium con indicatore fluorescente
provetta di terreno liquido per micobatteri
miscela di antibiotici (PANTA) per il contenimento
delle contaminazioni
fluorocromo, incorporato in un film di silicone sul
fondo della provetta, sensibile alle variazioni del
contenuto di ossigeno
comparsa di fluorescenza per effetto del consumo
di ossigeno operato dal metabolismo batterico
rilevamento della fluorescenza


visivo, sotto una lampada UV
automatizzato
accorciamento dei tempi di crescita
maggior sensibilità
il terreno Redox
i micobatteri crescono nel terreno
liquido di Kirchner formando piccoli
fiocchi o intorbidamento uniforme
i sali di tetrazolio presenti nel
terreno vengono ridotti a
formazzano dai micobatteri in
crescita
il formazzano, rosa-violetto ed
insolubile, si fissa alla superficie
delle colonie micobatteriche
permettendone il riconoscimento
automazione nella coltura dei
micobatteri
metodo radiometrico

la produzione di CO2 radiomarcata viene rilevata da un
-counter
metodo pressometrico

l’aumento di pressione, dovuto a produzione di CO2,
viene rilevato da un manometro
metodo fluorimetrico

la fluorescenza di un indicatore, inibita dalla presenza di
ossigeno nel terreno, viene ripristinata per effetto del
consumo di ossigeno
metodo refrattometrico

la produzione di CO2 fa virare un sensore che a sua
volta modifica l’intensità di un raggio di luce riflessa
l’emocoltura per micobatteri 1
la ricerca dei micobatteri nel sangue è
giustificata per i pazienti immunodepressi nei
quali può essere richiesta anche la
mielocoltura
la bassa sensibilità rende inutile l’esecuzione
dell’esame microscopico
un tipo particolare di emocoltura è quello che
si esegue sul sangue mestruale quando si
sospettano forme tubercolari a carico
dell’apparato genitale
l’emocoltura per micobatteri 2
semina diretta del sangue



nei flaconi Bactec 13A
nei flaconi BacT ALERT MB blood
nelle bottiglie Bactec MYCO/F Lytic
semina dopo lisi-centrifugazione
(sistema Isolator)



su tutti i terreni solidi (a base di uovo o
sintetici)
in tutti i terreni liquidi compresi quelli, non
dedicati alle emocolture, impiegati dai
sistemi automatizzati
nel terreno bifasico
l’emocoltura per micobatteri 3
la sensibilità dei terreni solidi è notevolmente
inferiore a quella dei terreni liquidi
tempi di incubazione inferiori alle otto
settimane sono sconsigliati anche per i terreni
liquidi
le specie appartenenti al MAC sono di gran
lunga quelle di più frequente reperimento
lo sviluppo di micobatteri in terreno liquido
che non crescono nelle subcolture su terreno
solido deve far pensare alla presenza della
specie M. genavense
identificazione tradizionale,
test biochimici
accumulo di niacina
riduzione dei nitrati
catalasi


quantitativa
termoresistente
idrolisi del Tween 80
ureasi
arilsolfatasi
riduzione del tellurito
identificazione tradizionale,
test colturali
velocità di crescita
aspetto delle colonie




rugose lisce
fotocromogene
scotocromogene
non pigmentate
crescita a varie temperature
test di inibizione selettiva
NAP test
il p-nitro-acetil-amino-idrossi-propriofenone
(NAP), aggiunto al terreno di coltura,
inibisce lo sviluppo dei micobatteri
appartenenti al M. tuberculosis complex ma
non quello dei micobatteri non tubercolari
risultati accettabili solo in terreno liquido
test di screening rapido (4-7 gg)
metodi di identificazione “alternativi”
DNA probe
HPLC degli acidi micolici
sequenziamento genico
 16S
rDNA
 SOD
 HSP65
il sistema AccuProbe
lisi delle cellule batteriche e liberazione del rRNA
probe marcato costituito da un frammento di DNA a
filamento singolo contenente una sequenza speciespecifica presente in una regione ipervariabile del
rRNA
ibridizzazione in presenza di complementarità fra
rRNA e probe
rimozione della marcatura dal DNA non ibridizzato
eccitazione della molecola marcatrice
chemioluminescente
rilevamento della luce prodotta in presenza di
molecole ibride di acidi nucleici
metodo rapido (2 h) altamente specifico
HPA (hybridization protection assay)
gli esteri di acridinio utilizzati come marcatori
emettono luce se eccitati chimicamente
nel DNA a catena singola la molecola marcatrice
è esposta all'azione di eventuali agenti inattivanti
la struttura assunta dall'acido nucleico a catena
doppia protegge la molecola marcatrice
dall'azione di eventuali agenti inattivanti
l'aggiunta di agenti inattivanti elimina ogni
possibilità di emissione di segnale da parte di
molecole non ibridizzate, l'emissione di luce è
pertanto indice di avvenuta ibridizzazione
Line Probe Assay (LiPA)
LiPA, interpretazione
gli acidi micolici
acidi grassi, ramificati in posizione 
presenti nella parete batterica dei generi:






Corynebacterium: 22-38 atomi di C
Rhodococcus: 34-52 atomi di C
Nocardia: 44-60 atomi di C
Gordona: 48-66 atomi di C
Tsukamurella: 64-78 atomi di C
Mycobacterium: 60-90 atomi di C
presenza di numerosi gruppi funzionali che
differenziano 7 tipi di acidi micolici
micobatterici

alfa-, alfa'-, metossi-, keto-, epossi-, cere, omega' metossi-
HPLC degli acidi micolici
saponificazione, estrazione e
derivatizzazione degli acidi micolici presenti
nella parete dei micobatteri
frazionamento mediante HPLC
individuazione dei picchi presenti nel
tracciato cromatografico e identificazione per
confronto con profili di riferimento
profilo HPLC del M. tuberculosis
complex
ad eccezione del M. bovis BCG
SI
esempi di profili HPLC
SI
SI
TLC degli acidi micolici



  



   
  
  
  
gas-cromatografia
RNA ribosomiale 16S
antibiogramma
i farmaci antitubercolari maggiori
il principio del metodo delle
proporzioni
l’antibiogramma manuale
l’antibiogramma automatizzato
l’antibiogramma sui
micobatteri non tubercolari
antibiogramma radiometrico
inoculo di una serie di flaconcini radiometrici,
addizionati con antibiotici, con una sospensione
micobatterica standardizzata
inoculo di un flaconcino di controllo con una diluizione
1/100 della sospensione precedente
lettura radiometrica giornaliera fino al raggiungimento,
da parte del controllo, di una soglia prefissata
sensibilità
flaconcini con incremento giornaliero inferiore a quello
del controllo
resistenza
flaconcini con incremento giornaliero superiore a quello del
controllo
metodica di riferimento, durata 5-10 gg
le fasi della
Polymerase Chain Reaction
pretrattamento del materiale e
liberazione dell'acido nucleico
–
–
–
fluidificazione ed eventuale
decontaminazione
lavaggio
lisi delle cellule
amplificazione dell'acido nucleico
rilevamento dell'amplificato
componenti principali della
miscela di amplificazione
NUCLEOTIDI
PRIMER: oligonucleotidi
complementari di sequenze
presenti alle due estremità della
regione da amplificare
POLIMERASI: enzima che
determina l'allungamento dei
primer utilizzando i nucleotidi
presenti nella miscela di reazione
i componenti della Mastermix del
sistema Amplicor M. tuberculosis
NUCLEOTIDI
assenza di nucleotidi contenenti timina
(sostituiti da quelli contenenti uracile)
PRIMER
complementari di sequenze che delimitano
una regione del genoma specifica del
genere Mycobacterium
marcati con biotina
POLIMERASI
Taq polimerasi
il sistema AmpErase per la
prevenzione delle contaminazioni
il DNA-target non contiene uracile
il DNA-amplificato contiene uracile al
posto della timina
l'aggiunta di uracil-N-glicosilasi al
materiale da amplificare determina la
distruzione di qualsiasi traccia di DNA
contaminante (frutto di precedenti
amplificazioni); l'enzima è invece del
tutto inattivo sul DNA-target
i cicli termici della reazione di
amplificazione
20 sec a 94°C: la doppia elica del DNA si
separa ed i filamenti singoli costituiscono lo
stampo per successive amplificazioni
20 sec a 62°C: i primer si legano alle sequenze
complementari presenti sul DNA-target
(annealing)
45 sec a 72°C: la polimerasi determina
l'allungamento dei primer utilizzando i nucleotidi
presenti nella miscela di reazione
30 cicli (ne sono previsti 35) determinano la formazione
di un miliardo di copie del DNA originale
il rilevamento dell'amplificato
trasferimento dell'amplificato in un pozzetto di una piastra
microtiter, coated con probe complementari di una
sequenza dell'amplicone specifica per il M. tuberculosis
incubazione (ibridizzazione)
lavaggi (eliminazione dell'amplificato non ibridizzato)
aggiunta del coniugato avidina-enzima
incubazione (legame avidina-amplicone biotinilato)
lavaggi (eliminazione del coniugato non legato)
aggiunta del substrato
incubazione (reazione enzimatica)
bloccaggio della reazione enzimatica
lettura fotometrica a 450 nm
le fasi della
Transcriptase Mediated Amplification
fluidificazione e decontaminazione del campione
lisi (ultrasuoni) delle cellule
trasferimento del lisato in provette contenenti la
miscela di amplificazione e breve incubazione a
95°C
aggiunta della miscela enzimatica e amplificazione
isotermica (2 h a 42°C) di una regione del rRNA
specifica del genere Mycobacterium
blocco dell'amplificazione ed ibridizzazione
dell'eventuale amplificato con un DNA-probe
specifico per il M. tuberculosis complex
rilevamento HPA dell'eventuale ibridizzazione
il principio della TMA
annealing dei primer, presenti nella miscela di
reazione, con il rRNA liberato mediante lisi
cellulare
sintesi di DNA a partire da RNA grazie alla
transcriptasi inversa
separazione dell'ibrido DNA-RNA ad opera
della RNasi
utilizzo del DNA come stampo per la sintesi di
molte copie di RNA ad opera della polimerasi
ulteriore annealing del RNA sintetizzato con
nuovi primer
non occorrono cicli termici perché manca la fase di denaturazione
formazione di 10 miliardi di copie in 2 ore
la Strand Displacement Amplification
TARGET: IS6110
PRINCIPALI COMPONENTI DELLA MISCELA DI AMPLIFICAZIONE:




bamper
primer
polimerasi
enzima di restrizione
sito di restrizione
bamper
5’
primer
target
3’
non occorrono cicli termici perché manca la fase di denaturazione
SDA: amplificazione esponenziale
il rilevamento dell’amplificato nella SDA
il rilevamento dell’amplificato nella SDA
il rilevamento dell’amplificato nella SDA
il rilevamento dell’amplificato nella SDA
il rilevamento dell’amplificato nella SDA
il rilevamento dell’amplificato nella SDA
il rilevamento dell’amplificato nella SDA
il rilevamento dell’amplificato nella SDA
il rilevamento dell’amplificato nella SDA
il rilevamento dell’amplificato nella SDA
il rilevamento dell’amplificato nella SDA
ricerca del M. tuberculosis mediante
amplificazione, pro e contro
rapidità
metodiche in-house



elevata sensibilità
manualità complessa
alto rischio di contaminazioni
metodiche commerciali




sensibilità non superiore a quella della coltura
parzialmente automatizzabili
minimo rischio di contaminazioni
standardizzate solo per i materiali respiratori
indicazioni delle tecniche di
amplificazione
utilizzabili per la ricerca di nuovi
casi
non utilizzabili per il monitoraggio
della terapia
interpretazione del risultato
dell’amplificazione
1
Microscopia POS
Amplificazione POS
M. tuberculosis
Microscopia NEG
Amplificazione NEG
probabile NEG
Microscopia NEG
Amplificazione POS
probabile M. tuberculosis
Microscopia POS
Amplificazione NEG
probabile MOTT
interpretazione del risultato
dell’amplificazione
2
Coltura POS
Amplificazione POS
M. tuberculosis
Coltura NEG
Amplificazione NEG
NEG
Coltura NEG
Amplificazione POS
???
Coltura POS
Amplificazione NEG
M. tuberculosis o MOTT