Centrifugazione
• Alle sospensioni viene applicato un campo gravitazionale
artificiale attraverso la rotazione ad alta velocità (Campo
centrifugo).
• Viene sfruttata la differenza di densità tra le particelle ed il
mezzo in cui sono sospese
Campo centrifugo
• Il campo centrifugo (G) è dato da:
G   2r
• Dove  è la velocità di rotazione espressa in radianti·s-1
r è la distanza dall’asse di rotazione.
• Per esprimere la velocità di rotazione in giri·min-1 (RPM):
2  RPM

60
• Il campo centrifugo viene quindi definito come:
4 2  ( RPM ) 2
G
r
3600
Campo centrifugo relativo
• In genere il campo centrifugo viene espresso come campo
centrifugo relativo (RCF) come multiplo della costante
gravitazionale (980 cm·s-2):
G 4  ( RPM )
RCF  
r
g
3600  980
2
2
• Che diventa:
5
RCF  1.1110  ( RPM )  r
2
Velocità di sedimentazione
F0  v  6a
4
F    a3  ( p  m )  2r
3
Per F = F0 il moto è rettilineo uniforme
4
3
2
v  6  a    a  (  p   m )   r
3
Velocità di sedimentazione
Velocità di sedimentazione
della particella
Raggio della particella
Densità della particella
Densità del mezzo
2 a  ( p  m ) 2
 
 r
9

2
Campo gravitazionale
Costante per una sfera
Viscosità del mezzo
Velocità di sedimentazione
• Se una particella ha una densità uguale a quella del
mezzo:
 p  m
 p  m  0
 0
non vi è sedimentazione.
Tempo di sedimentazione
• Il tempo di sedimentazione si ottiene attraverso
l’integrazione della legge di Stokes tra due raggi:
– r1 = raggio di rotazione alla superficie e
– r2 = raggio di rotazione al fondo
rb
9

t  2 2
 ln
2   a  (  p  m )
rt
rt
rb
Coefficiente di sedimentazione
2 a  ( p  m ) 2
 
 r
9

2
S
Coefficiente di sedimentazione
1 S (Svedberg) = 10-13
Il principio della centrifugazione
Campo gravitazionale
indotto con la
centrifugazione
Sopranatante
Precipitato (pellet)
Sospensione
Separazione
completata
Centrifughe
• Centrifuga da banco
• Ultracentrifuga
Centrifughe
•
•
•
•
Da banco
Micro
Super
Ultra
RPM
g
4000-6000
max. 16000
~ 25000
~ 80000
3000-7000
max. 22000
~ 60000
~ 600000
Centrifuga analitica
Centrifuga analitica
Centrifuga analitica
(Profilo Schlieren)
Centrifugazione differenziale
Z
Campo centrifugo
A
Solvente
Particelle
piccole
Particelle
medie
Particelle
grandi
Tempo di centrifugazione
• All’inizio le particelle sono distribuite
uniformemente nel mezzo (A), alla fine (Z)
sono sedimentate in funzione delle loro
dimensioni e della loro densità.
Centrifugazione zonale
Z
Campione
Gradiente
di densità
Campo centrifugo
A
Particelle
piccole
Particelle
medie
Particelle
grandi
• All’inizio le particelle sono stratificate al di sopra
del gradiente (A), alla fine (Z) sono sedimentate
in funzione delle loro dimensioni, della loro
densità e della densità del mezzo.
Centrifugazione zonale
(caricamento ed eluizione in moto)
A
B
D
C
E
A. Il rotore, in moto a
bassa velocità, viene
caricato con il
gradiente dalla
periferia.
B. Il gradiente è
formato
C. Viene caricato il
campione dal centro.
D. Il rotore viene
portato in velocità e
avviene la
sedimentazione.
E. Il rotore viene
rallentato e le bande
vengono eluite
usando un solvente
più denso.
Centrifugazione zonale
(con centrifuga apposita)
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Il gradiente è caricato nel
rotore.
il rotore è accelerato
lentamente, il gradiente si
riorienta
Il campione è pompato ad una
estremità del rotare
Il campione sedimenta
radialmente
Alla fine il rotore decelera
lentamente,
Il gradiente si riorienta senza
disturbare le bande di particelle
Le bande vengono estratte
usando una pompa peristaltica.
Centrifugazione isopicnica
Campo centrifugo
A
Z
Particelle
piccole
Particelle medie
che si vogliono
separare
Particelle
grandi
• All’inizio le particelle sono disperse nel mezzo (A) che ha
densità uguale a quella delle particelle che si vogliono
separare, alla fine (Z) le particelle galleggiano alla
densità del mezzo uguale alla loro.
Centrifugazione isopicnica con
gradiente
Campo centrifugo
A
Z
Particelle
piccole
Particelle
medie
Particelle
grandi
• All’inizio le particelle sono disperse nel mezzo (A),
durante la centrifugazione si forma il gradiente, alla fine
(Z) le particelle galleggiano alla densità del gradiente
uguale alla loro.
Gradiente su rotore swing-out
Rotori

I rotori ad angolo fisso hanno piccole
differenze tra rmax e rmin

Il tempo richiesto per la sedimentazione è
minore per rotori ad angolo fisso

I rotori ad angolo fisso sono più pesanti e
necessitano di una maggiore energia per
operare

I rotori a bracci mobili (Swing out) sono da
preferire per centrifugare cellule e particelle

Per sedimentare macromolecole e
particelle fini si usano rotori ad angolo fisso

I rotori a brazzi mobili sono da preferire per
la centrifugazione su gradiente.
Rotore ad angolo fisso
rmax - rmin
Rotore swing-out
rmax - rmin
Rotori
• Rotore ad angolo Fisso
• Rotore zonale
• Rotore swing-out
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