SAMENVATTING
AGGREGRATIE- EIGENSCHAPPEN VAN AMFIFIELE
DNA TRANSPORTMIDDELEN IN GENTHERAPIE
Genen zijn DNA segmenten welke de code bevatten die nodig is voor de biosynthese van
eiwitten (de ‘expressie’ van het gen), macromoleculen die een belangrijke rol hebben in een
groot aantal biologische structuren en essentieel zijn voor de levensfuncties. Fouten in deze
codes kunnen aanleiding geven tot de productie van eiwitten welke niet in staat zijn hun
normale functies te vervullen en aldus aanleiding kunnen geven tot het ontstaan van
genetisch bepaalde afwijkingen en ziektes. Gentherapie, als een mogelijke oplossing voor dit
probleem, berust op de introductie van een correcte copie van het defecte gen in de celkern
als vervanging van het incorrecte exemplaar. Daar veel eiwitten ook als medicijn worden
aangewend, wordt gentherapie ook gezien als een veelbelovende aanpak van afwijkingen
waarvoor geen (geschikte) medicatie bestaat.
Er is een groot aantal technieken ontwikkeld om een therapeutisch gen in de cellulaire
kern te introduceren, met name op virus gebaseerde methodes hebben een enorme vlucht
genomen maar, mede gezien de lage transfectiedoeltreffendheid en zwaarwegende risico’s
inzake de veiligheid, heeft gen- therapie (nog) niet de ontwikkeling doorgemaakt welke
verwacht was. Het werk dat in dit proefschrift gepresenteerd wordt levert een bijdrage aan
de wereldwijde pogingen (nieuwe) transportmethodologiën te ontwikkelen welke in staat
zijn deze bezwaren weg te nemen.
Amfifielen zijn moleculen die zijn opgebouwd uit een polaire (hydrofiele of
waterminnende) kopgroep en een apolaire (hydrofobe of vetminnende) staart, meestal een
lange alkylketen. Amfifiele moleculen zijn in staat om in water via een proces van zelfassemblage een grote varieteit aan macromoleculaire structuren te vormen. De
macromoleculare structuur, de morfologie, zal voor een groot deel worden bepaald door de
moleculaire geometrie van het amfifiel.
SAMENVATTING
Synthetische, kationische amfifielen worden algemeen gezien als veelbelovende
transportmiddelen voor de introductie van genetisch materiaal in de cellulaire kern. Ze
kunnen genen transfecteren en, na complexatie met het DNA (lipoplexvorming),
introduceren in de cel, hetgeen uiteindelijk tot de expressie van het gen kan leiden. Over het
algemeen worden ze gekenmerkt door een lage cytotoxiciteit en een relatief lage
doeltreffendheid van transfectie. Voor klinische toepassing zijn verbeteringen dus zeker
noodzakelijk.
A
B
C
D
E
F
Figuur 1 Schematische weergave van enkele aggregaten van amfifielen: bolvormige (A) en worm-vormige
(B) micellen; lamellaire fases in een vlakke bilaag (C) en een vesiicle (D); een kubische fase (E)
en een geïnverteerde hexagonale fase (F).
Lipoplexen worden gevormd door DNA aan een vesiculaire oplossing van het kationische
amfifiel toe te voegen, dikwijls in combinatie met een electrisch neutraal (zwitterionisch)
‘helper’ lipide zoals bijvoorbeeld het fosfolipide dioleylfosfatidylethanolamine (DOPE). De
160
SAMENVATTING
relevantie van de aggregatie-eigenschappen van de amfifiel-DNA complexen voor een
efficiente transfectie is reeds vroegtijdig gesignaleerd. Met name lipoplexen die een
geïnverteerde hexagonale morfologie (HII) onder fysiologisch relevante condities kunnen
vormen geven dikwijls aanleiding tot goede transfectieresultaten. Het helperlipide DOPE
beïnvloedt de doelmatigheid van de transfectie zeer waarschijnlijk door zijn eigen
moleculaire geometrie, welke de vorming van geïnverteerde hexagonale fases bevordert.
Het doel van de gepresenteerde studie is tevens inzage te verkrijgen in de correlaties
tussen de moleculaire transporterstructuur, de aggregatie-eigenschappen en de transfectieefficienties in het door de amfifielen gemedieerde gentransport en, uiteindelijk, de cellulaire
introductie van voornoemd gen. Een schematische weergave van het voorgestelde
mechanisme is gegeven in Figuur 2. Algemeen wordt verondersteld dat de vorming van een
geïnverteerde hexagonale fase een positieve invloed heeft op de transfectie omdat het de
endosomale ontsnapping van het gen bevordert, hetgeen de degradatie in een lysosoom
voorkomt.
Nucleic
acid
Cationic
liposome
-
-
+
+
+
+
+
Lipoplex at
physiological conditions
(NaCl(aq) 150 mM)
Lipoplex formation
in H2O
1
2
+
3
+
7
Interaction with
the cell surface
6
4
Endocytosis
Nucleus:
transgene
expression
Early endosome
5
Lysosome:
hydrolytic
degradation
Figuur 2 Schematische weergave van de kritische stappen in het transfectieproces: 1) vorming van het
lipoplex bij lage ionsterkte; 2) de oplossingscondities (pH, ionogene concentratie, etc) worden
aangepast tot fysiologisch relevante waarden; 3) het lipoplex treedt in interactie met het
celmembraan; 4) het lipoplex wordt opgenomen door de cel (dmv endocytose); 5) indien het
lipoplex blijft steken in het endosoom zal degradatie in een lysosoom plaatsvinden; 6) enkele
lipoplexen ontsnappen aan het endosoom en het DNA wordt afgegegeven aan het cytosol; 7)
het vrije DNA beweegt zich naar de celkern en wordt tot expressie gebracht na opname in de
celkern.
161
SAMENVATTING
Een vergelijkende studie naar de gedragingen van twee SAINT amfifielen (Figuur 3A,
SAINT-2 en SAINT-5), welke slechts verschillen in de mate van onverzadiging in de
alkylketens, wordt gepresenteerd in hoofdstuk 2. De aanwezigheid van een cis-dubbele
binding in de alkylketens van SAINT-2, dat een hogere transfectie efficientie geeft in
vergelijking met SAINT-5 en dan met name bij gebruik van DOPE als helper- lipide,
verhoogt de vloeibaarheid van de bilaag (door verstoring van de ketenpakking) en geeft
tevens aanleiding tot een volledig homogene menging met het helperlipide. Door deze
menging worden stabiele HII fases gevormd bij fysiologisch relevante ionsterkte.
A
d Suga
N
Alkyl chain
N
+
Alkyl Chain
B
Spacer
Reduc
e
Alkyl chain
N
Alkyl Chain
+
d Suga
N
e
Reduc
Alkyl chain
r
r
C
Alkyl chain
Figuur 3 Schematische weergave van de moleculaire structuren van de drie klassen van kationische
amfifielen welke zijn bestudeerd: SAINT (A); Sunfish (B) en suiker- gebaseerde gemini
amfifielen (C).
De verkregen resultaten bieden een éénduidige verklaring voor de positieve invloed van
het gebruik van DOPE als helperlipide in de transfecties m.b.v. SAINT-2 in vergelijking met
SAINT-5. Deze conclusies zijn gebaseerd op gedetaileerde NMR studies; de combinatie van
2H
en 31P NMR ‘broad-line’ experimenten, niet eerder gebruikt in een transfectie gerelateerde
context, boden de mogelijkheid om onafhankelijk het aggregatiegedrag van de Nmethylgedeutereerde kationische amfifilelen te bestuderen naast de gedragingen van het
helperlipide in de mengsels.
In hoofdstuk 3 worden de aggregatie eigenschappen van zes Sunfishamfifielen met
verschillende alkyl- ketens vergeleken. De afhankelijkheid van de menging met het
helperlipide en de neiging om HII fases te vormen als functie van de lipideketens zijn in
162
SAMENVATTING
overeenstemming met de resultaten gevonden voor de SAINT amfifilielen, ondanks de
significante verschillen in de moleculaire structuur. Bovendien blijkt dat ook de eerste
cruciale stap in het transfectie proces, de vorming van het lipoplex (Figuur 2) sterk
afhankelijk is van de aard van de alkylketens (lengte, aanwezigheid van onverzadiging etc).
Door de resultaten van de Langmuir-Blodgett film balans, gel retardatie electroforese, DSC
en DLS experimenten te combineren, bleek het mogelijk om te concluderen dat de optimale
lipolexvorming
alleen
maar
kan
worden
bereikt
met
amfifielen
die
vloeibare
bilaagmorfologieën vormen in water. Dit is een sterke indicatie dat lange, verzadigde ketens
niet geschikt zijn als structuurelement in het ontwerp van efficiente transfectie- systemen. De
resultaten verkregen met de Sunfishamfifielen zijn aldus grotendeels in overeenstemming
met gegevens voor de SAINT amfifielen en literatuurdata, waar gesuggereerd wordt dat
genen in lipoplexen welke een HII morfologie kunnen aannemen onder fysiologische
condities betere transfectie-agentia zijn.
De op suiker gebaseerde gemini amfifielen welke het onderwerp van studie zijn in de
hoofdstukken 4 en 5, zijn een interessant voorbeeld van ‘smart-design’ moleculen, waarbij
een unieke combinatie van structuurelementen in één molecuul zijn samengebracht om
bepaalde/gewenste zelf-assemblerende eigenschappen te verkrijgen. De tertiaire amines in
de kopgroep van het molecuul induceren een sterk pH-afhankelijk morfologisch gedrag,
hetgeen endosomale ontsnapping van DNA fragmenten kan bevorderen (Figuur 2). De
suikergroepen hebben een tweeledige functie. Ten eerste verhogen ze de oplosbaarheid van
de amfifielen in water door de polariteit van de kopgroep te vergroten door hydratatie en
waterstofbrugvorming. Bij afwezigheid van een suikergroep of bij gebruik van zeer kleine
suiker- eenheden gedragen de moleculen zich als olie in plaats van dat ze het morfologisch
gedrag van een amfifiel vertonen (Hoofdstuk 5). Ten tweede worden suikers dikwijls
gebruikt in biomoleculaire herkenningsprocessen, hetgeen tot een hernieuwde interesse in
de fysisch-chemische eigenschappen van dit soort moleculen heeft geleid. Tot slot kunnen
variaties in de verbindingseenheid, de ’spacer’, aanleiding geven tot sterke veranderingen in
de aard van de aggregatie-eigenschappen door de beïnvloeding van de gemiddelde
doorsnede van het kopgroepoppervlak, het volume van het hydrofobe deel en de hydratatieeigenschappen in de nabijheid van de kopgroepen. In de Hoofdstukken 4 en 5 wordt ook het
zeer interessante pH-afhankelijke fasegedrag getoond en de wijze waarop dit gedrag kan
worden beïnvloed door verschillende externe condities zoals de ionsterkte, de toevoeging
van surfactanten met verschillende moleculaire geometrieën (Hoofdstuk 4),
structurele
modificaties in de suikereenheden en de eigenschappen en de lengte van de spacereenheid
163
SAMENVATTING
(Hoofdstuk 5). Het onverwachte inhiberende effect van het helperlipide DOPE op de GS-1
geïnduceerde transfectie kan worden verklaard door recente resultaten waarbij een HI
morfologie (in plaats de HII morfologie) van het GS-1 lipoplex onder zwak zure condities
gevonden is. Deze resultaten suggeren dat de neiging om wormvormige micellen te vormen
afneemt in de aanwezigheid van DOPE. De waarneming dat lyso-PC en OTAC geen
positieve invloed hebben op de transfectie eigenschappen is eveneens in overeenstemming
met de resultaten welke gepresenteerd zijn in Hoofdstuk 4, daar deze micelvormende
additieven geen significante overgang naar wormvormige micellen bewerkstelligen. Zonder
de medische implicaties te kort te willen doen, is dit fasegedrag op zichzelf al interessant en
fascinerend. Uitzonderlijk intrigerend is de onverwachte ladings-omkering van de vesicles
onder basische condities, hetgeen een onderzoek waard was ondanks het gegeven dat de
condities verre van fysiologisch relevant zijn. De waarnemingen, verzameld in Hoofdstuk 5,
onderbouwen de hypothese dat het mechanisme van de OH- ion binding aan de GS vesicles
analoog is aan de OH- ion binding aan hydrofobe oppervlakken, namelijk dat het haar
oorsprong vindt in de preferentiële oriëntatie van de water moleculen in de eerste twee
hydratatielagen aan het oppervlak. Het gegeven dat de orientatie van de watermoleculen in
de nabijheid van een hydrofoob oppervlak overeenkomt met de situatie in de nabijheid van
een GS vesicle is echter contra-intuïtief, vanwege de aanwezigheid van polaire groepen op
het vesiculaire oppervlak. Een mogelijke verklaring is dat de preferentiële oriëntatie van
watermoleculen aan een oppervlak, benodigd voor OH- binding, aanwezig is als de
onderlinge interacties tussen water- moleculen sterk genoeg zijn in vergelijking met de
interacties van watermoleculen met de polaire delen aan het oppervlak. Als een gevolg
hiervan blokkeert de substantiële hydratatie Gibbsenergie van zwitterionische fosfolipiden
de OH- binding aan liposomen zoals experimenteel waargenomen. Het moet echter worden
opgemerkt dat moleculaire dynamica simulaties en verder experimenteel werk noodzakelijk
zijn om een definitief en gedetaileerd beeld te vormen van het preciese mechanisme van de
pH-geïnduceerde ladings- omkering van de suiker-gebaseerde GS vesicles.
Een interessant fenomeen dat sommige materialen uit de drie klassen van amfifielen
vertonen en, dat niet is waargenomen in eerdere studies, betreft de ongebruikelijke vorming
van kubische fasen in de aanwezigheid van een overmaat aan water. Door de hoge
biocompatibiliteit van de SAINT, Sunfish en suiker-gebaseerde gemini surfactanten, kan
verder onderzoek naar de vorming van stabiele dispersies van deze kubische fases
aanleiding geven tot belangrijke toepassingen van deze verbindingen op het gebied van de
gecontroleerde medicijnafgifte.
164
RIASSUNTO
PROPRIETÁ DI AGGREGAZIONE DI VETTORI
ANFIFILICI DI DNA PER LA TERAPIA GENICA
I geni sono segmenti di DNA che codificano le informazioni necessarie agli organismi
viventi per la biosintesi di proteine (‘’espressione’’ del gene), macromolecole che svolgono
un ruolo essenziale in una varietá di strutture biologiche e in funzioni vitali fondamentali.
Errori in questi codici possono portare alla produzione di proteine che sono incapaci di
svolgere la loro normale funzione e causare malattie genetiche. Il principio della terapia
genica consiste nell’introduzione nel nucleo cellulare di una copia corretta del gene difettivo,
al fine di eradicare le cause della malattia genetica. Inoltre, dal momento che molte proteine
possono agire come farmaci, la terapia genica é considerata un vantaggioso e promettente
approccio anche per la cura di malattie acquisite.
Nonostante siano state sviluppate diverse tecnologie (in particolare basate su vettori virali)
atte all’introduzione di un gene terapeutico nel nucleo cellulare, i requisiti di efficienza e
sicurezza necessari per fare della terapia genica un potente strumento medico non sono stati
ancora raggiunti. Il lavoro presentato in questa tesi é un contributo allo sforzo globale che
mira alla realizzazione di tecnologie di trasferimento genico che soddisfino questi requisiti.
Le molecole anfifiliche (o surfattanti) contengono una parte polare (idrofilica), chiamata
‘’testa’’, e una apolare (idrofobica), che generalmente é costitutita da lunghe catene alchiliche.
Le molecole anfifiliche si aggregano in acqua per formare una varietá di strutture (Figura 1),
con morfologie che dipendono dalla geometria molecolare complessiva.
Surfattanti cationici sintetici sono considerati promettenti candidati per il trasferimento di
geni in applicazioni biomediche, dal momento che sono in grado di indurre trasfezione del
gene, i.e. una volta che il complesso surfattante-DNA (lipoplesso) é formato, sono in grado di
trasferire i geni all’interno delle cellule e di indurne l’espressione. Spesso i lipoplessi
RIASSUNTO
presentano basse citotossicitá. Tuttavia, l’efficienza di questi sistemi é, a tuttoggi,
insoddisfacente.
A
B
C
D
E
F
Figura 1 Rappresentazione schematica di aggregati anfifilici: micella sferica (A) e cilindrica (B); fase
lamellare nella forma di un doppio strato (C) e di una vescicola (D); una fase cubica (E); e una
fase esagonale inversa (F).
I lipoplessi sono in genere preparati aggiungendo DNA ad una dispersione vescicolare del
surfattante cationico, spesso in combinazione con un ‘’lipide ausiliario’’ elettricamente
neutro (come, ad esempio, il fosfolipide zwitterionico DOPE). L’importanza delle proprietá
di aggregazione dei vettori anfifilici di DNA per un’efficiente trasferimento di geni é nota da
tempo. In particolare, geni in lipoplessi che possono assumere una morfologia esagonale
inversa (HII) in condizioni fisiologiche presentano efficienze di trasfezione piu’elevate.
Probabilmente, il ‘’lipide ausiliario’’ DOPE migliora l’efficienza di trasfezione poiché, a cause
della sua geometria molecolare, favorisce la fomazione di fasi esagonali inverse.
166
RIASSUNTO
Scopo del presente studio é stato la determinazione di ulteriori correlazioni tra le strutture
molecolari dei vettori anfifilici, le loro proprietá di aggregazione e le rispettive efficienze di
trasfezione.
In Figura 2 é riportata una rappresentazione schematica del meccanismo di trasferimento
di geni mediato da molecole anfifiliche. É stato ipotizzato che la formazione di fasi esagonali
inverse favorisca la trasfezione del gene in quanto questa morfologia faciliterebbe il suo
rilascio dall’ endosoma, prevenedone la degradazione nel lisosoma.
Nucleic
acid
Cationic
liposome
-
-
+
+
+
+
+
Lipoplex at
physiological conditions
(NaCl(aq) 150 mM)
Lipoplex formation
in H2O
1
2
+
3
+
7
Interaction with
the cell surface
6
4
Endocytosis
Nucleus:
transgene
expression
Early endosome
5
Lysosome:
hydrolytic
degradation
Figura 2 Rappresentazione schematica dei passaggi critici nel processo di trasfezione: (1) il lipoplesso é
preparato in condizioni di bassa forza ionica; (2) pH e forza ionica sono aggiustati a valori
fisiologici; (3) il lipoplesso interagisce con la membrana cellulare; (4) il lipoplesso entra nella
cellula, generalmente via endocitosi; (5) quando rimane intappolato nell’endosoma, il lipoplesso
viene degradato nel lisosoma; (6) alcuni lipoplessi vengono rilasciati dall’ endosoma; (7) il DNA
raggiunge il nucleo dove puo’essere espresso.
Nel Capitolo 2 é descritto uno studio comparativo condotto su due molecole anfifiliche
appartenenti alla famiglia dei SAINT (Figura 3A), SAINT-2 e SAINT-5, che differiscono
solamente per il grado di insaturazione delle catene alchiliche.
I risultati dimostrano che la presenza di un doppio legame cis nelle catene alchiliche di
SAINT-2, che presenta una maggiore efficienza di trasfezione rispetto a SAINT-5, in
particolare in combinazione con il lipide ausiliario DOPE, non solo aumenta la fluiditá del
167
RIASSUNTO
doppio-strato lipidico (perturbando l’impaccamento delle catene), ma ne favorisce anche il
mescolamento omogeneo con DOPE. Inoltre, il mescolamento omogeneo di SAINT-2 con il
‘’lipide ausiliario’’ porta alla formazione di un fase esagonale inversa, stabile in condizioni
fisiologiche di forza ionica.
A
+
Alkyl chain
r
N
Alkyl chain
N
+
Alkyl Chain
B
Spacer
Reduc
ed Sug
a
N
N
Alkyl Chain
Alkyl chain
ar
ed Sug
Reduc
C
Alkyl chain
Figura 3 Rappresentazione schematica delle strutture molecolari delle tre classi di surfattanti oggetto di
questo studio: SAINT (A); Sunfish (B); surfattanti gemini a base di zucchero (C)
I risultati ottenuti forniscono una chiara spiegazione del maggiore effetto di DOPE nel
trasferimento di geni mediato da SAINT-2, rispetto a quello mediato da SAINT-5. Queste
conclusioni sono state raggiunte mediante un dettagliato studio di NMR. La combinazione di
esperimenti di 2H- e 31P- broad-line NMR, mai usata prima in un contesto di trasfezione, ha
fornito la possibilitá di monitorare indipendentemente il comportamento di aggregazione
del composto cationico anfifilico N-metil-deuterato e del ‘’lipide ausiliario’’, rispettivamente,
nelle loro misture.
Nel Capitolo 3 sono state confrontate le proprietá di aggregazione di sei molecole
anfifiliche Sunfish (Figura 3B), caratterizzate da diverse catene alchiliche. La dipendenza del
mescolamento con il ‘’lipide ausiliario’’ dalla struttura delle catene alchiliche e della
tendenza a formare fasi esagonali inverse é stata confermata dai dati ottenuti su questa
seconda classe di vettori anfifilici. Inoltre, i risultati provano che anche il primo passaggio
critico del pocesso di trasfezione, la formazione del lipoplesso (Figura 2), dipende in maniera
critica dalla natura delle catene alchiliche. Combinando i risultati da misure di LangmuirBlodgett film balance, gel-elettroforesi, DSC e DLS, abbiamo potuto concludere che la
168
RIASSUNTO
formazione ottimale di lipoplessi avviene esclusivamente se le molecole anfifiliche sono in
grado di formare doppi-strati fluidi in acqua. Lunghe catene alchiliche insature non sono
quindi elementi strutturali addatti per ottenere alte efficienze di trasfezione. In accordo con i
risultati ottenuti per le molecole SAINT e con dati di letteratura, lo studio condotto sulle
molecole Sunfish ha confermato che geni in lipoplessi che possono assumere un morfologia
HII in condizioni fisiologiche presentano efficienze di trasfezione piu’elevate.
I surfattanti gemini a base di zucchero (Figura 3C), descritti nei Capitoli 4 e 5, sono un
esempio particolarmente interessante di design molecolare ‘’intelligente’’, nel quale una
combinazione unica di elementi strutturali viene utilizzata per ottenere aggregati con le
proprietá desiderate. I gruppi amminici terziari nella testa del surfattante conferiscono un
comportamento di aggregazione che dipende dal pH, caratteristica che dovrebbe favorire il
rilascio del materiale genetico dall’endosoma (Figura 3). Gli zuccheri hanno una duplice
funzione. In primo luogo aumentano la solubilitá della molecola anfifilica in acqua,
aumentando la polaritá della testa e favorendone l’idratazione via legami ponte idrogeno. In
fatti, in assenza di zucchero o in presenza di zuccheri corti nella molecola, i composti
elettricamente neutri si comportano come olii e non come molecole anfifiliche (vedi Capitolo
5). Inoltre, l’importanza dei carboidrati in processi di riconoscimento biomolecolare é stata
riconosciuta e ha stimolato un rinnovato interesse nello studio della chimica fisica-organica
di questi composti. In fine, variazioni nello spaziatore consentono di modificare le
caratteristiche di aggregazione variando l’area effettiva della testa e l’idratazione in
prossimitá della testa. I Capitoli 4 e 5 mostrano come il ricco comportamento di fase di
surfattanti gemini a base di zucchero possa essere modificato variando le condizioni di forza
ionica, aggiungendo surfattanti caratterizzati da diverse geometrie molecolari (Capitolo 4) o
apportando variazioni agli zuccheri o alla natura o lunghezza dello spaziatore (Capitolo 5).
L’inattesa inibizione della trasfezione mediata da surfattanti gemini a base di zucchero ad
opera del ‘’lipide ausiliario’’ DOPE puo’essere spiegata alla luce di recenti scoperte
riguardanti la morfologia HI (invece di HII) del lipoplesso formato da GS1 in condizioni
leggermente acide. In fatti, i risultati presentati nel Capitolo 4 dimostrano che la tendenza
alla formazione di micelle cilindriche é diminuta in presenza di DOPE. Inoltre, anche l’
osservazione che lyso-PC e OTAC non favoriscono la trasfezione é consistente con i dati
presentati
nel
Capitolo
4,
poiché
l’aggiunta
di
questi
additivi
non
favorisce
significativamente la transizione verso micelle cilindriche.
Anche senza considerare le applicazioni biomediche, le transizioni di fase dei surfattanti
gemini a base di zucchero sono estremamente interessanti e affascinanti per se.
169
RIASSUNTO
Particolarmenti intrigante é l’inaspettata inversione di carica osservata per le vescicole in
condizioni basiche, fenomeno che abbiamo voluto studiare ulteriormente, nonstante avvenga
in condizioni che non sono immediatamente rilevanti per il processo di trasfezione. Le
osservazioni raccolte nel Capitolo 5 supportano l’ipotesi che il meccansimo con il quale gli
ioni OH- si legano a vescicole di GS sia analogo a quello con il quale ioni OH- si legano a
superfici idrofobiche, i.e. che il fenomeno derivi dall’orientazione preferenziale delle
molecole d’acqua nei primi due strati di idratazione della superficie. Il fatto che
l’orientazione delle molecole d’acqua in prossimitá di una superficie idrofobica e in
prossimitá della superficie di una vescicola di GS siano simili é contro-intuitivo, a causa della
presenza di gruppi polari sulla superficie vescicolare. Una possibile spiegazione per questa
analogia é che l’orientazione preferenziale dell’acqua richiesta per l’adsorbimento di ioni
OH- sia presente quando le interazioni tra le molecole d’acqua sono sufficientemente forti
rispetto alle interazioni delle molecole d’acqua con i siti polari presenti sulla superficie.
Consistentemente, la sostanziale energia di Gibbs per l’idratazione di fosfolipidi
zwitterionici impedisce l’adsorbimento di ioni OH-. Tuttavia, per ottenere un’immagine
dettagliata e definitiva del meccanismo di inversione di carica indotto dal pH in vescicole di
GS a base di zucchero, simulazioni di dinamica molecolare e ulteriore lavoro sperimentale
sembrano necessari.
Un’interessante caratteristica di alcuni membri delle tre classi di composti anfifilici
descritte in questa tesi, che non era stata notata in studi precedenti, consiste nella inusuale
formazione di fasi cubiche in presenza di acqua in eccesso. A causa dell’elevata
biocompatibilitá dei composti SAINT, Sunfish e dei surfattanti gemini a base di zucchereo,
ulteriore ricerca sulla possibilitá di ottenere dispersioni stabili di queste fasi cubiche potrebbe
portare a importanti applicazioni di questi composti nel campo della somministrazione
controllata di farmaci.
170