Cromatografia liquida ad ultra alte prestazioni (UHPLC)
A cura di
da sinistra Anastasia Khvataeva,
éstelle Riche, Stephane Mabic
Business field Lab Water
Merck Millipore,
St.-Quentin-en-Yvelines, Francia
Acqua ad elevata purezza
per soddisfare le esigenze dell’UHPLC
IN PRIMO PIANO
La cromatografia liquida ad ultra alte prestazioni (UHPLC) sta acquistando sempre maggiore popolarità.¹
Grazie alla combinazione di particelle con granulometria inferiore ai 2 μm e di una strumentazione capace
di sopportare pressioni elevate e di mantenere costante la forma dei picchi, questa tecnica offre sensibilità,
risoluzione e velocità superiori rispetto all’HPLC tradizionale. Consentendo di effettuare le analisi molto
più velocemente, i sistemi UHPLC garantiscono un significativo aumento di produttività, oltre ad un minor
consumo di solventi, il che rappresenta un vantaggio sia dal punto di vista economico, che ambientale.
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Negli ultimi anni, l’avvento della cromatografia
liquida ad ultra alte prestazioni (UHPLC)
ha permesso di ampliare l’orizzonte delle
applicazioni di laboratorio, consentendo di
raggiungere limiti di rilevazione estremamente
bassi. Tuttavia, quando si lavora con queste
tecniche analitiche così sensibili, è necessario
soddisfare alcuni requisiti: per approfittare
appieno dell’UHPLC ed ottenere risultati
analitici rappresentativi, acqua, solventi
e reagenti ad elevata purezza sono
indispensabili. In particolare, si deve prestare
un’attenzione speciale all’acqua, perché essa
viene utilizzata nell’arco dell’intera analisi,
dalla preparazione dei campioni, dei tamponi
e delle fasi mobili, fino al risciacquo delle
colonne ed al lavaggio del sistema.
In quest’articolo, sono stati presi in esame
una serie di esperimenti realizzati utilizzando
acqua ultrapura prodotta da un sistema
Milli-Q® (di Merck Millipore) ed è stato
dimostrato che l’acqua ultrapura appena
prodotta è indicata per le analisi UHPLC.
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Dicembre 2012
Milli-Q® Integral System
La tecnologia d’avanguardia dei sistemi UHPLC è ancora più sofisticata
dell’HPLC convenzionale e per il raggiungimento di prestazioni ottimali,
richiede una maggiore cura nella preparazione dei campioni e nel trattamento dei solventi. L’importanza dell’impiego delle buone pratiche di
laboratorio risulta fondamentale. Può succedere che le impurezze in tracce
(apportate dai solventi, dalla vetreria o dai filtri) che potrebbero non essere rilevate da un HPLC, vengano invece identificate da un UHPLC, vista
la maggiore sensibilità di questa tecnica analitica. L’utilizzo delle buone
pratiche di laboratorio è ancora più importante se il cromatografo è accoppiato ad uno spettrometro di massa (MS).
Oltre alla purezza chimica,2 bisognerà anche verificare che i solventi utilizzati per questa tecnica siano esenti da particelle o batteri che potrebbero far aumentare la contropressione del
sistema, danneggiare le teste della pompa o ostruire i frit della colonna. L’impiego di solventi
ad elevata purezza esenti da particelle può contribuire a garantire lunga vita alle colonne ed
ai cromatografi per UHPLC. Si consiglia, al momento dell’acquisto di solventi organici e di
additivi, di scegliere la purezza massima disponibile (grado HPLC o LC-MS).
Nella maggior parte dei casi, questi solventi sono filtrati dal produttore e pertanto possono
essere utilizzati senza ulteriori trattamenti. Parlando del solvente ”acqua” invece, i ricercatori
possono scegliere tra i vari tipi d’acqua purificata in bottiglia, disponibili sul mercato e, l’acqua purificata in laboratorio, utilizzando un sistema di purificazione. Operare una scelta tra
tutti i gradi d’acqua disponibili può essere difficile. Per preparare le fasi mobili per le analisi
HPLC, solitamente si utilizza acqua ultrapura prodotta con un sistema di purificazione ed è
noto che essa genera buoni risultati.3 Merck Millipore ha realizzato uno studio per verificare
che l’acqua purificata da un sistema Milli-Q® è adatta anche per UHPLC e produce buoni
risultati. A tal fine, è stata studiata l’influenza della qualità dell’acqua sulle analisi UHPLC e
sulla contropressione del sistema ed è stata valutata l’idoneità dell’acqua ultrapura appena
prodotta per questo tipo di analisi.
Materiali e metodi
In tutti gli esperimenti è stato utilizzato un sistema ACQUITY UPLC® I-Class Waters (Waters Corp., Milford, Massachusetts, USA) dotato di rivelatore a serie di
fotodiodi e acqua ultrapura appena prodotta da un sistema Milli-Q® Integral (Merck Millipore, Billerica, Massachusetts, USA), con filtro Millipak® da 0,22 µm al
punto d’uso finale. Come indicato dal sistema, la resistività dell’acqua era di 18,2 MOhm.cm ed i livelli di carbonio ossidabile totale (TOC) erano pari o inferiori
a 5 ppb. I reagenti chimici utilizzati erano della massima purezza disponibile. Per l’eluizione su gradiente è stato usato acetonitrile di grado ULC/MS (Biosolve
BV, Paesi Bassi). L’acido formico era J.T. Baker (Avantor Performance Materials, Center Valley, PA, USA).
a.Contropressione del sistema durante 10 ore di flusso isocratico in continuo
Una colonna Acquity UPLC® BEH C18 (1,7 μm, 2,1 x 50 mm) è stata eluita per 10 ore a 0,45 mL/min. con una miscela d’acqua ultrapura ed acetonitrile 50:50 con acido formico allo 0,1%.ed è stata registrata la contropressione del sistema.
b.Tracciato del gradiente preparato con acqua ultrapura
è stata utilizzata una colonna ACQUITY UPLC® BEH Shield RP18 (1,7 μm, 2,1 x 50 mm) che è stata mantenuta a 35 °C. Il gradiente è andatodallo 0%
al 100% di acetonitrile in 5 min. ed è stato poi mantenuto per 1 min. al 100% di acetonitrile. La velocità di flusso era 0,60 mL/min. La linea di base è
stata registrata a 254 nm.
c.Idoneità dell’acqua ultrapura per analisi UHPLC
Una miscela di sette composti è stata analizzata 600 volte consecutivamente, tenendo monitorata la contropressione del sistema. In ogni corsa sono
stati iniettati 2 µL della seguente miscela: 2-acetilfurano, acetanilide, acetofenone, propiofenone, butilparabene, benzofenone e valerofenone (4 µg/mL di
ciascuna molecola). è stata utilizzata una colonna UPLC® BEH Shield RP18 ACQUITY (1,7 μm, 2,1 x 50 mm) mantenuta a 35°C. Per l’eluizione è strato
usato un gradiente di 3 minuti dal 20% al 90% di acetonitrile, seguito da, 1 minuto di isocratica e poi si è tornati nelle condizioni iniziali. La velocità di
flusso era dello 0,6 mL/min. e la separazione è stata monitorata a 254 nm.
Contropressione del sistema durante 10 ore di eluizione isocratica in continuo Utilizzando come fase stazionaria particelle di granulometria
inferiore ai 2 µm, le colonne da UHPLC utilizzano frit di porosità molto inferiore (solitamente di 0,2 µm) rispetto alle colonne da HPLC convenzionali. Anche il diametro
interno ed i raccordi più piccoli di queste colonne contribuiscono a renderle particolarmente sensibili al materiale particolato. Le particelle possono infatti generare
contropressione che, a sua volta, può danneggiare le colonne e causare un temporaneo fermo del sistema.
Quando si lavora con acqua o con fasi mobili acquose, una preoccupazione comune è la contaminazione batterica, che può esercitare gli stessi effetti delle particelle
sullo strumento e sulle colonne. Inoltre, i batteri liberano sottoprodotti (organici e ionici) che possono interferire con i risultati analitici. Per proteggere i sistemi UHPLC
dai danni causati dalle particelle, alcuni produttori di solventi attualmente offrono acqua e solventi organici filtrati con filtri da 0,1 µm.
Poiché i sistemi di purificazione dell’acqua sono solitamente dotati di un filtro finale da 0,22 µm, con questo studio si è voluto verificare se tale soluzione sia sufficiente
o se non sia invece necessaria un’ulteriore filtrazione.
La Figura 1 mostra la contropressione di un sistema monitorato per 10 ore di eluizione con una fase mobile costituita da 50% di acqua ultrapura e 50% di
acetonitrile. Si è osservato che la contropressione si è mantenuta stabile (ΔP = 24-27 psi) per tutto il periodo e cio’ indica che l’acqua ultrapura appena prodotta da
un sistema dotato di filtro finale da 0,22 µm è adatta per l’impiego con sistemi da UHPLC. 7Non c’è alcun bisogno di un’ulteriore filtrazione, soprattutto perché essa
virtualmente potrebbe essere causa di contaminazione se non venisse utilizzato il filtro adeguato 4
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Nell’UHPLC l’acqua riveste un ruolo importante, poiché essa può essere utilizzata
per preparare non solo le fasi mobili, ma anche i campioni, gli standard ed i bianchi.
Qualunque contaminante presente nell’acqua può influire sui risultati analitici
e sul funzionamento dello strumento. Per ottenere risultati accurati e riproducibili,
l’acqua impiegata dev’essere della migliore qualità.
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Tracciato del gradiente preparato con acqua ultrapura Le molecole organiche presenti in tracce nell’acqua utilizzata per preparare gli eluenti pos-
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sono influire negativamente sulle analisi UHPLC, potendo alterare le linee di base e la sensibilità del metodo analitico. Inoltre, durante l’equilibrazione, potrebbero
concentrarsi nelle colonne a fase inversa, per essere poi eluite, generando picchi fantasma.
Il grado di contaminazione organica dell’acqua può essere valutato esaminando il tracciato di un suo gradiente. A tal fine, senza iniettare alcun campione, si
eluisce utilizzando un gradiente che va da un elevato livello di eluente acquoso ad un’alta concentrazione di eluente organico.
Se nell’acqua sono presenti contaminanti organici, si suppone che essi si accumulino nella colonna durante l’equilibrazione con l’eluente acquoso e che poi vengano eluiti durante la corsa del gradiente. In questo studio, è stata utilizzata acqua ultrapura e si è ottenuta una buona linea di base (Figura 2), il che ne dimostra
l’idoneità per applicazioni di UHPLC.
Idoneità dell’acqua ultrapura appena prodotta per le analisi UHPLC Ad ulteriore dimostrazione dell’idoneità dell’acqua ultrapura per le analisi UHPLC,
in questo studio è stata analizzata ripetutamente una miscela di sette sostanze mediante eluizione su gradiente. La contropressione e la qualità della
separazione sono state monitorate nell’arco di 600 analisi successive (60 ore di impiego continuo).
La Figura 3 mostra che la contropressione del sistema è rimasta perfettamente stabile nel corso di queste iniezioni ripetute. Inoltre, le prestazioni cromatografiche sono risultate essere buone e si sono mantenute identiche durante tutte le numerose analisi effettuate nell’ambito dell’esperimento.
Per illustrare questi risultati, in Figura 4 sono illustrati i cromatogrammi della 1° e della 600° corsa. Questi risultati confermano che l’acqua ultrapura
appena prodotta è adatta per gli studi che utilizzano l’UHPLC. Se al punto d’uso del sistema è installato un filtro finale da 0,22 µm non è necessaria
alcun’altra fase di filtrazione, soprattutto perché, se non si utilizza il filtro adeguato, essa potrebbe divenire fonte di contaminazione.
Figura 1: Contropressione del sistema durante un periodo di 10 ore in condizioni di eluizione isocratica
della colonna con acqua: acetonitrile, 50: 50.
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Figura 2: Tracciato UHPLC che mostra la linea di base di una corsa su gradiente
registrata a 254 nm ed ottenuta utilizzando acqua ultrapura appena purificata.
Figura 3: Contropressione del sistema UHPLC misurata per ognuna delle 600
corse su gradiente a 0,50 minuti dall’inizio della corsa. Gli eluenti che sono stati
utilizzati erano acqua ultrapura appena prodotta ed acetonitrile.
Figura 4: Cromatogrammi UHPLC di una miscela di sette molecole registrati a 54 nm.
Cromatogramma in basso: prima corsa; Cromatogramma in alto: 600° corsa.
(1: 2-acetilfurano, 2: acetanilide, 3: acetofenone, 4: propiofenone, 5: butilparabene, 6: benzofenone e 7: valerofenone)
Sede Millipore di Molsheim In Francia dove vengono prodotti i sistemi
per la purificazione dell'acqua
Conclusioni
Nel momento in cui si sostituiscono i sistemi HPLC convenzionali con sistemi UHPLC, sorge la domanda su quali siano i solventi migliori da utilizzare. Questo
studio ha dimostrato che l’acqua ultrapura appena prodotta è adatta per i sistemi UHPLC e che contribuisce a generare linee di base stabili e prestazioni cromatografiche ottimali. Il filtro a schermo da 0,22 µm collocato sull’uscita dei sistemi per la purificazione dell’acqua garantisce che le particelle o i batteri che potrebbero
interferire con il corretto funzionamento dello strumento siano rimossi, come dimostrato dal fatto che la contropressione non aumenta. Tuttavia, è importante
accertarsi che il sistema per la purificazione dell’acqua sia mantenuto in ottime condizioni e produca acqua con una ridotta contaminazione ionica (resistività
di 18,2 MOhm.cm) ed organica complessiva (TOC pari o inferiore a 5 ppb). Inoltre, poiché la qualità dell’acqua può degradarsi nel tempo, è preferibile non
conservare l’acqua ultrapura per più di un giorno, ma produrre ogni mattina un nuovo volume d’acqua ultrapura fresca per le analisi UHPLC.
Ringraziamenti: Gli autori sono grati al Dr. Jean-Michel Plankeele (Waters Corp.) e Dr. Marijn Van Hulle (Waters Corp.) per il loro contributo e supporto.
Riferimenti Bibliografici
1.D. Guillarme, J. Schappler, S. Rudaz, J.L. Veuthey, “Coupling ultra-high-pressure liquid chromatography with mass spectrometry,” Trends in Analytical Chemistry, 2010, 29(1), 15-27.
2.S. Liu, “Quality Evaluation of HPLC-Grade Acetonitrile,” Am. Laboratory, 2008, 40, 22-29.
3.M. Tarun, C. Monferran, C. Devaux and S. Mabic. “Improving chromatographic performance by using freshly delivered ultrapure water in the mobile phase,”
LCGC, The Peak, 2009, June, 7-14.
4.S. Kulkarni, J. George and V. Joshi, “Mobile Phase Preparation for UHPLC: Impact of Filtration Through 0.2-μm Membranes on System Performance,” American Biotechnology Laboratory, 2008, 26(10), 14-15.
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