LEGIONELLA
Valorizzazione ed implementazione della
multidisciplinarietà nell’ambito della Legionellosi
Dipartimento di Prevenzione ULSS 20, Verona
Problematiche analitiche correlate al prelievo, al
trasporto, alla consegna e all’analisi dei
campioni.
dr.ssa M. Cristina Mosconi
17 novembre 2015
Problematiche analitiche correlate al prelievo, al
trasporto, alla consegna e all’analisi dei campioni.
NORMATIVA DI RIFERIMENTO
Circolare 400.2/9/5708 del 29/12/1993: linee-guida per la prevenzione e
il controllo della legionellosi
Documento Stato Regioni 04/04/2000: Gazzetta Ufficiale n.103 del
05/05/2000
Provvedimento 15 gennaio 2005: «Linee guida recanti indicazioni ai
laboratori con attività di diagnosi microbiologica e controllo ambientale
della legionellosi»
Documento Stato Regioni: «Linee guida per la prevenzione e il controllo
della Legionellosi» - DGRV n. 1250 del 28 settembre 2015, BUR 98
16/10/2015
dr.ssa M.Cristina Mosconi 17 novembre 2015
La normativa riporta
indicazioni per gli operatori
che operano nella sanità pubblica
- sorveglianza sanitaria
- matrici di campionamento
- modalità di campionamento
Indicazione ai microbiologi laboratoristi
- indicazioni analitiche
Provvedimento 15 gennaio 2005 ha definito i laboratori con
attività diagnostica e di controllo ambientale a tre livelli
gerarchici:
- laboratorio di base
- laboratorio di riferimento regionale
- laboratorio di riferimento nazionale
dr.ssa M.Cristina Mosconi 17 novembre 2015
Documento Stato Regioni: «Linee guida per la
prevenzione e il controllo della Legionellosi» - DGRV n.
1250 del 28 settembre 2015, BUR 98 16/10/2015
Allegato 3
Campionamento di matrici ambientali per la ricerca di
Legionella
Allegato 4
Ricerca e quantificazione di Legionella in campioni
ambientali con tecniche colturali e PCR.
- La tecnica colturale: validata
applicabile per i
controlli ufficiali
- La tecniche PCR: non validata
non applicabile per
i controlli ufficiali
dr.ssa M.Cristina Mosconi 17 novembre 2015
Legionella pneumophila
Vive comunemente in ambienti acquatici naturali
- laghi
- corsi d’acqua
- acque termali
Può contaminare ambienti acquatici artificiali
- reti idriche cittadine
- impianti idrici degli edifici (docce!!!!!)
- piscine
- fontane
- apparecchiature sanitarie (aerosol)
Il genere Legionella comprende 61 specie diverse (sottospecie incluse) e
sono stati riconosciuti circa 70 sierogruppi. Legionella pneumophila è la più
importante per la patologia umana clinico, il sierogruppo 1 è il più importante.
Non vengono comunque trascurati i sierogruppi 2-14.
dr.ssa M.Cristina Mosconi 17 novembre 2015
Decreto Legislativo 81/2008 – Testo unico in
materia di salute e sicurezza
Allegato XLVI
- Legionella pneumophila e le altre specie patogene per
l’uomo (Legionella spp): rientrano tra gli agenti biologici
del gruppo 2.
«agente che può causare malattia in soggetti
umani e costituire rischio per i lavoratori; è poco
probabile che si propaghi nella comunità e nell’ambiente;
sono di norma disponibili efficaci misure profilattiche e
terapeutiche preventive e il rischio di diffusione è
limitato»
dr.ssa M.Cristina Mosconi 17 novembre 2015
MANIPOLAZIONE MATERIALE POTENZIALMENTE
INFETTO - MISURE DI CONTENIMENTO
accettazione
- campioni sigillati e inseriti in involucri protettivi
-i recipienti di vetro contenenti campioni vanno maneggiati e trasportati
con cura
laboratori
-manipolazione di campioni potenzialmente infetti da microrganismi
gruppo 2 : bunsen, e mascherine di protezione individuale per
operazioni poco indaginose, disinfettanti specifici per la pulizia delle
superfici di lavoro, sterilizzazione dei recipienti li lavoro.
-cappa di sicurezza biologica per la manipolazione delle colture
lavaggio
sottoporre contenitori, vetreria... a processi di disinfezione o
sterilizzazione (autoclave) prima delle operazioni di lavaggio
dr.ssa M.Cristina Mosconi 17 novembre 2015
FLUSSO LAMINARE VERTICALE
CAPPE BIOLOGICHE DI SICUREZZA CLASSE II
impiegata per microrganismi a medio rischio
(gruppo 2 e 3)
apertura frontale: passaggio di aria dall’esterno
all’interno
filtro HEPA per l’aria in entrata
flusso laminare verticale nell’area di lavoro
filtro HEPA per l’aria in uscita
protezione operatore: buona
protezione dell’ambiente: ottima
protezione del campione: ottima
dr.ssa M.Cristina Mosconi 17 novembre 2015
CAPPA DI SICUREZZA CLASSE II
Presenta un filtro HEPA in entrata ed uno in uscita
Filtro HEPA: è composto da foglietti filtranti
di microfibre (generalmente in borosilicato)
assemblati in più strati, separati da setti in
alluminio.
I foglietti filtranti in microfibra hanno bloccano
le microparticelle.
L’aria entra nella cappa con un flusso di aspirazione dall’estero
all’interno (si crea barriera di protezione per l’operatore) e si muove
verticalmente dall’alto verso il basso.
dr.ssa M.Cristina Mosconi 17 novembre 2015
AUTOCLAVE
Decontaminazione attrezzature e materiale infetto
attraverso il processo di sterilizzazione determinando
l’uccisione di tutti i microrganismi vitali.
Temperatura di sterilizzazione: 121°C per 15 minuti
dr.ssa M.Cristina Mosconi 17 novembre 2015
Buone pratiche
di esecuzione del campione
QUINDI POTREMMO PARADOSSALMENTE AFFERMARE CHE IL
PRELIEVO È PIÙ IMPORTANTE DELL’ANALISI
dr.ssa M. Cristina Mosconi
17 novembre 2015
Campionamento microbiologico
dr.ssa M. Cristina Mosconi
17 novembre 2015
Materiale e attrezzatura per il campionamento
– Termometro
– Contenitori idonei per il campionamento
– Abbigliamento monouso/ DPI: guanti, soprascarpe, camici, copricapo,
mascherina, ecc
– Verbale o Documento di Accompagnamento (D.A.)
– Sistemi refrigerati per il trasporto al laboratorio
Campione istantaneo: per verificare l’eventuale esposizione immediata
dell’utente.
- Prelevare senza flambare al punto di sbocco, senza far scorrere
l’acqua
- Misurare la temperatura
Campione di acqua all’interno dell’impianto: per monitorare le condizioni
d’igiene
- Far scorrere l’acqua almeno 1 minuto e poi campionare
- Misurare la temperatura
dr.ssa M. Cristina Mosconi
17 novembre 2015
TEMPERATURA DI TRASPORTO
il materiale prelevato deve giungere al laboratorio nelle stesse condizioni
microbiologiche in cui si trova al momento del prelievo
Gli effetti sono particolarmente evidenti nei mesi caldi e soprattutto a carico dei
parametri quantitativi.
Gli aspetti da prendere in considerazione sono i seguenti:
– Tempi di trasporto
– Temperature di trasporto
i campioni devono esser trasportati in laboratorio nel più breve tempo possibile, a
temperatura ambiente, al riparo dalla luce
L’analisi inizia preferibilmente entro 24 ore, trascorse le 24 ore i campioni
vengono conservati in un intervallo di temperatura di 2°C-8°C , non oltre i 4 giorni
dal prelievo
dr.ssa M. Cristina Mosconi
17 novembre 2015
Trasporto e consegna dei campioni
Contenitori utilizzati per il trasporto
• Contenitori coibentati con piastre refrigeranti
• Per trasporti di lunga durata e/o in condizioni particolari i
contenitori coibentati non sono solitamente in grado di
mantenere la temperatura richiesta.
• Frigorifero portatile elettrico o furgone refrigerato.
Devono essere portati alla temperatura di esercizio
prima di eseguire il campionamento.
dr.ssa M. Cristina Mosconi
17 novembre 2015
Procedimento analitico
Metodo colturale
•
Il campione di acqua viene filtrato su membrane strerili di di policarbonato, di nylon o
esteri di cellulosa con porosità pari a 0,22-0,45 microm e collocate sulle rampe di
filtrazione
•
Una aliquota del campione sottoposto a filtrazione viene insemenzata sulla superficie
dei terreni di coltura che devono essere arricchiti di cisteina
Una seconda aliquota del campione viene sottoposto al trattamento alla temperatura
di 50°C per 30 minuti per eliminare la flora ambientale interferente e poi distribuita sul
terreno di coltura,
•
•
•
La piastra con il terreno di coltura insemenzato viene incubata a 36°C per 10 giorni
Le colonie sospette vengono sottoposte a prove
sierologiche di conferma o di immunofluorescenza
Procedimento analitico
Metodo PCR
•PCR: Plymerase Chain Reaction ( reazione a catena della polimerasi)
• La tecnica consiste nel ricercare della presenza del DNA genomico della Legionella
•Rispetto alla PCR classica si può applicare anche la Real-Time PCR che fornisce
informazioni quantitative. E’ denominata anche q-PCR.
•Il metodo non è validato
•E’ dimostrato che questa tecnica fornisce un numero più elevato di campioni positivi e
valori più alti rispetto alla tecnica colturale.
•Vengono rilevati anche le cellule morte , danneggiate o vitali non coltivabili. I risultati
positivi devono essere confermati con il metodo colturale.
•La tecnica colturale esprime il risultato in «Unità Formante Colonie/L», la PCR in «Unità
genomica»/l. I due risultati non sono confrontabili
dr.ssa M. Cristina Mosconi
17 novembre 2015
norme per i
campionamenti
Sistemi di controllo della temperatura
Sistemi di controllo della temperatura del contenitore di
trasporto
dr.ssa M. Cristina Mosconi
17 novembre 2015
Controllo ambientale
Campionamento microbiologico delle superfici
TECNICA DEL TAMPONE
Il risultato viene espreso in ugc/cm2
dr.ssa M. Cristina Mosconi
17 novembre 2015
Controllo ambientale
Campionamento microbiologico delle superfici
TECNICA DELLA SPUGNETTA
dr.ssa M. Cristina Mosconi
17 novembre 2015
CAMPIONAMENTO MICROBIOLOGICO
DELLE SUPERFICI
TECNICA DELLE PIASTRE A CONTATTO
•
•
•
•
•
•
Si impiegano piastre dette RODAC
Hanno una superficie di 24cm2 , Il fondo è solitamente quadrettato con quadrati
di 1x1 cm per facilitare il conteggio
Il tempo di contatto terreno/superficie dovrà essere di circa 10 secondi
Il tempo di contatto tra piastra e superficie e la pressione esercitata sulla
piastra costituiscono le due variabili principali che devono essere standardizzate
Dopo incubazione si contano le colonie che si sono sviluppate esprimendo il
risultato in UFC/cm2 o in UFC/24cm2
Un conteggio accurato può essere effettuato solo sulle piastre nelle quali non
siano cresciute più di 200 colonie
dr.ssa M. Cristina Mosconi
17 novembre 2015
Controllo ambientale
Campionamento microbiologico
TECNICA DELLE PIASTRE ESPOSTE
ufc/tempo di esposizione
dell’aria
TECNICA SAS
ufc/m3
dr.ssa M. Cristina Mosconi
17 novembre 2015
SISTEMA QUALITÀ DEL LABORATORIO
• Qualificazioni del personale
- PO02DL Tecniche di qualificazione del personale
• Procedure di verifica dei metodi applicati
- PG03DL Validazione metodi microbiologici
• Modalità di calcolo ed espressione
dell’incertezza del dato analitico
- PG04DL Modalità di calcolo, espressione dei
risultati e stima dell’incertezza di misura per le
prove microbiologiche
dr.ssa M. Cristina Mosconi
17 novembre 2015
GRAZIE PER L’ATTENZIONE
dr.ssa M. Cristina Mosconi
17 novembre 2015