Tipizzazione dei ceppi virali mediante PCR La rabbia: una zoonosi da combattere Classe IV C Brocca, prof.ssa Roberta Predonzan Abstract Within the IZSV-edu 2011-12 project, the Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie gave high school students the opportunity to have a meaningful experience of scientific research. The aim of the initiative was to promote students’ knowledge of lab science and encourage their approach to research. Our class dealt with the biotechnology unit, in order to proceed to the molecular typification of the viral strain of rabies via RNA extraction from a fox’s brain. Typification within the virological field is an important tool to get essential information for the study of the spread of pathogens. The PCR technique allows to identify the pathogen rapidly and cheaply; hence it is the best method to initiate processes for disease containment to preserve human and animal health, if test results are positive. The process consists of three steps (developed in our school in two days): nucleic acid extraction extraction, amplification via Polymerase Chain Reaction (PCR) (PCR), electrophoresis on agarose gel. In the case we took into consideration the results were negative. On the other hand, our judgment of the experience was positive, because the project let us use modern lab research equipment and techniques, and come into close contact with specialized professional roles working in the field of public health protection and research. Introduzione L’istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie è un ente sanitario di diritto pubblico che collabora con i Servizi veterinari delle Aziende Unità Locali Socio Sanitarie riguardo l’igiene e la Sanità Pubblica Veterinaria. Il compito dell’Istituto è quello di ricercare particolari zoonosi, diffonderne l’informazione e cercare di evitare epidemie, riducendo il rapporto tra uomo e animale infetto, o controllando gli alimenti in commercio. L’indagine ha preso in considerazione la Rabbia, malattia virale che colpisce sia animali selvatici sia domestici e può essere trasmessa all’uomo (zoonosi) attraverso morsi e lambiture di animali infetti. L’animale serbatoio in Europa è la volpe. La rabbia è una zoonosi poco conosciuta ma assai pericolosa poiché colpisce il sistema nervoso centrale con esiti mortali. mortali L’esperienza L esperienza vissuta ha avuto uno scopo orientativo grazie all’incontro all incontro con le diverse figure professionali coinvolte nel campo della ricerca scientifica; ci ha permesso, inoltre, di utilizzare strumentazioni e tecniche specifiche della biologia molecolare, non presenti nei normali laboratori scolastici. Pertanto, gli obiettivi principali che il progetto didattico si prefiggeva, si possono ritenere ampiamente raggiunti: rapportarsi in modo corretto con la scienza e la ricerca; acquisire conoscenze e comportamenti adeguati circa i rischi sanitari; incoraggiare scelte formative e professionali sostenendo l’orientamento alle scelte universitarie. Materiali Risultati • Micro pipette a volume variabile (P 1000 µL, P 200 µL, P 100 µL ecc.) • Rack porta provette (per provette da 1,5 ml) • Porta provette da 200 µL • Kit: nucleospin RNA II macherey nagel - marker • Materiale monouso: guanti, guanti camice, camice micro provette (tipo Eppendorf volume 1,5-2 ml e 200 µL) • Puntali anche capillari, piastre da 96 pozzetti • Centrifuga per micro provette (tipo Eppendorf volume 1,5-2 ml) • Cella per elettroforesi con gel di agarosio • Strumentazione per PCR (Termociclatore) • Pennarello indelebile per identificazione dei campioni La PCR consente di amplificare specifiche sequenze di acidi nucleici (target) che sono poi visualizzati con l’elettroforesi. Abbiamo così reso visibile il gene che codifica la proteina N del virus della rabbia. La rilevazione dei prodotti di reazione è stata eseguita con elettroforesi su gel di agarosio. La migrazione dei prodotti avviene grazie alla differenza di potenziale elettrico, in quanto gli acidi nucleici portano cariche elettriche negative e sono attratti dal polo positivo positivo. La matrice di agarosio funziona da “setaccio molecolare” e tutti i frammenti di identica lunghezza si muovono alla stessa velocità formando bande. Per l’identificazione degli amplificati si procede alla valutazione delle bande, confrontando la dimensione del prodotto di PCR con un marcatore di peso molecolare noto. Il campione è positivo se la banda del prodotto di PCR ha le stesse dimensioni del controllo positivo. Metodi Fasi del processo di estrazione dell’RNA Preparazione della mix di reazione Il procedimento analitico basato su PCR, per tipizzare ceppi virali, si compone di tre fasi. È stato utilizzato un protocollo messo a punto dalla sezione di biologia molecolare dell’Istituto. I campioni da analizzare sono stati divisi in 5 gruppi di 5 alunni. 2. PCR REAZIONE A CATENA POLIMERASI - condotta dai tecnici in Istituto È una tecnica di biologia molecolare che consente la moltiplicazione (amplificazione) di frammenti di acidi nucleici dei quali si conoscano le sequenze nucleotidiche iniziali e terminali. Tale metodica fu ideata nel 1983 da Kary B. Mullis che ottenne, per questo, il premio Nobel per la chimica (1993). Lo strumento utilizzato è un termociclatore. 3. RIVELAZIONE DEL PRODOTTO DI AMPLIFICAZIONE (corsa elettroforetica) – condotta a scuola Preparazione dei campioni da sottoporre a corsa elettroforetica miscelando, all’interno della piastra da 96 pezzi, 5 µL di amplificato con 1 µL di addensante blu Preparazione dello schema di caricamento gel Servendosi di puntali capillari, caricamento dei campioni all’ interno dei pozzetti del gel Chiusura della camera elettroforetica, collegamento degli elettrodi all’alimentatore e programmazione della corsa (60 v, per 20 minuti) A corsa ultimata, visualizzazione dei prodotti di amplificazione servendosi di transilluminatore a UV Interpretazione dei profili ottenuti. Preparazione della cella elettroforetica Visualizzazione UV dei prodotti con trans- illuninatore Discussione e conclusioni Nel caso preso da noi in esame, i campioni sono risultati negativi perché la banda del prodotto di PRC aveva le stesse dimensioni ed era in linea con quella del controllo negativo. Sarebbe interessante poter ampliare la ricerca analizzando altri campioni e collaborare con l’Istituto per mappare la diffusione della rabbia nel nostro territorio. La PCR permette un’interpretazione qualitativa della presenza del patogeno ma non ci permette di sapere se è vitale; in caso di positività devono essere condotte altre indagini cliniche quali, ad esempio, l’isolamento virale. C Considerata id l’l’elevata l sensibilità ibili à d della ll metodica, di lla b buona riuscita i i d della ll stessa richiede i hi d una particolare precisione, allestendo opportuni controlli di processo per evitare contaminazioni esterne. ISTOGRAMMA DI GRADIMENTO Ad esperienza conclusa la classe, composta da 23 alunni, ha elaborato e compilato un questionario di gradimento; ad ogni indicatore dell’istogramma ottenuto è stato attribuito un valore min 1 - max 5. I valori manifestano il giudizio di positività verso l’esperienza vissuta. punteggio in % 1. ESTRAZIONE DEGLI ACIDI NUCLEICI – condotta a scuola Preparazione del campione tramite omogenizzazione (mortaio e pestello) Lisi cellulare con buffer appositi (lysir buffer) Concentrazione dell’acido nucleico (membrane di silice) Purificazione da altri componenti cellulari aspecifici (buffer di lavaggio) Eluizione dell’RNA virale procedimento si ottengono g 60 – 200 µ µL di RNA. L’estrazione è stata Alla fine del p effettuata con l’utilizzo del kit nucleospin RNA II macherey nagel. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Bibliografia g Materiale didattico fornito dall’Istituto Appunti di lezione INDICATORI DI GRADIMENTO Ringraziamenti La classe IV C Brocca ringrazia l’IZSVe nelle persone del suo Direttore prof. Igino Andrighetto, del dott. Claudio Mantovani (Ufficio relazioni esterne e comunicazione istituzionale) e di tutti i ricercatori, che ci hanno permesso di vivere questa bella esperienza. http://www.giuseppeveronese.it/
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