COLLEGIO ITALIANO DI FLEBOLOGIA (C.I.F.)
BORSA DI STUDIO “M. GEORGIEV”
Per il miglior Progetto di Ricerca in
“INNOVAZIONE E BIOTECNOLOGIE IN FLEBOLINFOLOGIA”
Titolo del Progetto
“Impianto di cellule staminali mesenchimali autologhe nel trattamento del linfedema dell’arto superiore
secondario a linfoadenectomia ascellare agli stadi C.E.A.P.-L. C3-C4”
Nome, Cognome, Ruolo ed eventuale indicazione dell’Ente di appartenenza del Ricercatore principale,
responsabile della conduzione del progetto, recapiti telefonici ed indirizzo di posta elettronica.
Ricercatore principale
Dott. Luca Boschetti
Medico in formazione specialistica in Chirurgia Vascolare, Dipartimento di Scienze Chirurgiche, Anestesiologiche
e Radiologiche dell’Università di Ferrara
Tel. 347-6998758
Mail: [email protected]
Responsabile della conduzione del progetto:
Prof. Vincenzo Gasbarro;
Chirurgia Vascolare, Dipartimento di Scienze Chirurgiche, Anestesiologiche e
Radiologiche dell’Università di Ferrara
Dipartimento di Studi Biomedici Università di San Marino
Mail: [email protected]
Prof. Carlo Ventura
Area tematica nella quale si colloca il progetto
Patologie dei linfatici; Biotecnologie.
Razionale scientifico del progetto
I dati pubblicati dall’OMS nel 1994 riportano un'incidenza del linfedema nel mondo stimata intorno ai 140 milioni
di casi (circa 1:2000). 20 milioni sono attribuibili a condizioni post-chirurgiche secondarie al trattamento chirurgico
del carcinoma mammario. Attualmente il trattamento dei linfedemi secondari dell’arto superiore si avvale
prevalentemente della terapia elastocompressiva associata all’alternanza di cicli, intensivi e di mantenimento, di
terapia fisica combinata. In Italia il peso economico di tali trattamenti, non essendo il linfedema classificato come
malattia vascolare, è totalmente a carico del paziente. La continua ricerca di nuove strategie terapeutiche e i
crescenti successi ottenuti mediante l’utilizzo delle cellule staminali nella terapia delle malattie cardiovascolari, ci
hanno indotti a ipotizzarne l’applicabilità anche in campo linfatico. Le esperienze a riguardo, ricavabili dalla
letteratura, sono numericamente esigue e si riferiscono prevalentemente a sperimentazioni in vitro o su modelli
murini che hanno prodotto però risultati incoraggianti.
L’idea di questo studio nasce dal bisogno di colmare le lacune che ancora oggi affliggono la patologia linfatica,
attraverso le potenzialità che la terapia con cellule staminali può offrire.
Con queste premesse proponiamo un trattamento clinico mediante l’utilizzo di cellule staminali mesenchimali
autologhe derivate da tessuto adiposo (ADhMSCs) commissionate ex vivo, per migliorare la riparazione vascolare
sfruttando mezzi fisici e fattori paracrini per il differenziamento.
Il nostro progetto ha lo scopo di sperimentare in vivo sull’uomo una terapia basata sull’autotrapianto di cellule
mesenchimali ottenute dal tessuto adiposo addominale, finalizzata al miglioramento clinico dei pazienti affetti da
linfedema dell’arto superiore secondario a mastectomia e linfoadenectomia ascellare per carcinoma della
mammella.
Background
Identificazione di una fonte idonea di hMSCs per terapia cardiovascolare nell’uomo
Idealmente una cellula staminale utilizzabile per applicazioni mediche rigenerative dovrebbe avere le seguenti
proprietà:
1.
2.
3.
4.
5.
Essere presente in abbondanti quantità (milioni o bilioni);
Essere reperibile con procedura minimamente invasiva;
Essere ottenibile lungo molteplici vie differenziative, in modo regolabile e riproducibile;
Essere sicura ed effettivamente trapiantabile, sia in ospite autologo che allogenico;
Essere in accordo con il corrente “good manufacturing practice” (GMP).
Negli ultimi anni è stato dimostrato che il tessuto adiposo possiede al suo interno una popolazione di cellule
multipotenti alle quali abbiamo assegnato la nomenclatura di ADSC (Adipose Derived Stem Cells).
Approssimativamente vengono eseguiti 400.000 interventi di liposuzione ogni anno. Queste procedure prevedono il
prelievo di tessuto adiposo in quantità che vanno dai 100 mL ai 3 L, che spesso viene scartato. Alla luce di queste
osservazioni abbiamo isolato hMSCS altamente purificate da tessuto adiposo con l’aiuto di procedure mini invasive
usando 10-20 ml di lipoaspirato sottocutaneo. Il grasso è stato poi incubato con collagenasi e una volta scisso è
stato centrifugato e quindi sono state separate la popolazione sovranatante di adipociti maturi e la componente
stromale vascolare. L’ultimo passaggio del processo di isolamento prevedeva la selezione della popolazione
adesiva dalla frazione stromale vascolare ( SVF) e le ADhMSCs. Queste sono state mantenute in DMEM 10 %
FBS e usate per esperimenti in 5 passaggi. I saggi di differenziazione (adipogenico, osteogenico, condrogenico) e le
analisi citofluorometriche hanno confermato l’appartenenza alla linea mesenchimale di queste cellule.
Coltura ed espansione di ADhMSC in accordo con GMP: valutazione del potenziale differenziamento
cardiovascolare delle GMP-ADhMSCSs precondizionate con HBR
Dopo l’isolamento di ADhMSCs da piccole quote di lipoaspirato, tutti i passaggi successivi riguardanti lo sviluppo
di colture cellulari in vitro e l’espansione cellulare, verranno eseguite presso la “Cell Factory”, sottostando alle
richieste delle GMP ottenendo così la specifica autorizzazione necessaria alla realizzazione del nostro studio
(Bioscience Institute,via Rovereta 42, 47891 Falciano, San Marino)
La Bioscience Institute è conforme alle norme UNI EN ISO 1466- 1 e 1444- 2.
E’ interessante notare che le GMP ADhMSCs hanno risposto agli HBR con un significativo aumento di espressione
sia dei geni cardiogenici GATA1, Nkx 2.5 che vasculogenici VEGF, KDR, HGF.
Il trattamento con HBR inoltre ha aumentato l’espressione di geni di sopravvivenza come Pim 1, Akt e la
secrezione di mediatori trofici con risposte antiapoptotiche, angiogenetiche e antifibrotiche.
Tessuto linfatico e sua riparazione
I sistemi vascolare e linfatico sono connessi tra loro, infatti il liquido extracellulare fluisce dai vasi venosi per
entrare nei microvasi linfatici e poi, grazie al dotto toracico, torna nel distretto venoso.
A fronte di numerose conoscenze nella biologia dei vasi sanguigni, molti aspetti della biologia dei vasi linfatici
sono ancora sconosciuti. In passato gli strumenti in possesso della biologia molecolare che permettessero di
distinguere le diversità tra i vasi linfatici e i sanguigni erano limitati. Negli ultimi anni invece i ricercatori sono
riusciti quasi definitivamente a distinguere, a livello molecolare, le differenze tra i tessuti vascolari e linfatici.
Questa possibilità di discriminare tra tipi cellulari ci ha permesso di isolare più facilmente colture cellulari
linfatiche pure e di studiarne più dettagliatamente il comportamento biologico.
Dal punto di vista evolutivo, l’endotelio linfatico o cellule linfatiche endoteliali (LECs) origina da una
sottopopolazione dell’endotelio embrionale venoso o dalle cellule endoteliali del sangue (BECs) che esprimono il
fattore di trascrizione specifico del tessuto linfatico prox-1. Le LECs originano dalle popolazioni dell’endotelio
venoso che commissiona le linee linfatiche.
È ancora oggetto di dibattito se le LECs originino direttamente dal preesistente endotelio venoso o dalle cellule
linfoblastiche precursori, così come gli angioblasti derivano dai somiti mesodermici. In entrambi i casi, BECs e
LECs, sono relativamente connesse in termini di origine, funzione e struttura.
Tra i geni espressi in modo differente tra BECs e LECs ci sono i geni specifici conosciuti come VEGFR 3, LYVE
1, podopaina b, chemochine receptor D6, prox-1, così come una serie di citochine proinfiammatorie, chemochine e
i loro recettori, caderine e integrine.
Una sovraespressione indotta del gene prox-1 nelle BECs permette la up-regulation di molti geni LEC- specifici e
sopprime l’espressione di un numero rimarchevole di geni BEC- specifici. Questo suggerisce che le BECs possono
rappresentare una linea default sulla quale prox-1 induce la linfoangiogenesi durante lo sviluppo.
Aims
Sulla base delle acquisizioni in vitro e in vivo sopra riportate, proponiamo lo sviluppo di un approccio clinico a un
numero di pazienti con patologia linfatica mediante lo sviluppo dei seguenti obiettivi:
1.
2.
Implementare secondo i criteri della GMP una popolazione di ADhMSCs ottenuta dal tessuto adiposo. Ottenere
il differenziamento della popolazione cellulare di ADhMSCs implementata mediante la sola esposizione a
fattori paracrini.
Valutare la concordanza dei risultati clinici con le indagini strumentali utilizzate: ecografia e linfoscintigrafia.
End-points del progetto
L’obiettivo principale dello studio è quello di verificare l’applicabilità nella cura del linfedema secondario, del
trapianto di ADhMSCS autologhe, valutando gli effetti della terapia dal punto di vista clinico e strumentale a 12
mesi dalla data di impianto.
Le conclusioni ed i risultati ottenuti dall’elaborazione dei dati ottenuti saranno oggetto di pubblicazione e
condivisione con la comunità scientifica.
Metodologia utilizzata per condurre la ricerca
Reclutamento
Criteri di inclusione:
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Diagnosi di linfedema cronico dell’arto superiore allo stadio C.E.A.P.-L. C3-C4, secondario a
linfoadenectomia ascellare, con linfoscintigrafia positiva, in trattamento con terapia fisica combinata da
almeno un anno;
Aspettativa di vita superiore ai 3 anni;
Età: maggiore di 18 e inferiore a 75;
I partecipanti devono avere i requisiti psichici e fisici necessari per dare il consenso informato scritto
all’arruolamento nello studio e alla pubblicazione dei dati da esso derivati;
Forte motivazione personale;
Devono essere trascorsi almeno 4 mesi dall’ultima seduta di radioterapia e/o chemioterapia.
Criteri di esclusione:
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Linfedema acuto dell’arto superiore;
Linfangite o trombosi venosa superficiale o profonda in atto;
Ernia ombelicale e laparocele;
Patologie reumatologiche e del tessuto connettivo;
Gravidanza e allattamento;
Disturbi della coagulazione; terapia anticoagulante in atto;
Immunodepressione e infezione da HIV;
Infezioni dei siti di prelievo/impianto;
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Situazione locale dei siti di prelievo/impianto compromessa da neoplasie e/o metastasi;
Stati o terapie particolarmente debilitanti;
Pannicolo adiposo scarsamente rappresentato;
Cardiopatia grave o incompatibilità all’assunzione di adrenalina;
Chemioterapia e radioterapia in atto;
Diabete mellito;
Allergie ai componenti della soluzione di Klein: Carbocaina; Sodio bicarbonato; Adrenalina.
Diagnostica e stadiazione preoperatoria
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Anamnesi
Esame obiettivo: in particolare misurazione delle circonferenze di polso,
avambraccio, gomito, braccio alla radice; misurazione della
lunghezza dell’arto; documentazione fotografica.
Linfoscintigrafia
RM arto superiore e torace
Ecografia tessuti molli
Ecocolordoppler
Prelievo: tecnica di prelievo di tessuto adiposo
Il tessuto adiposo viene prelevato in anestesia locale con tecnica di liposuzione dai quadranti addominali inferiori,
mediante l’utilizzo di cannula di Coleman introdotta nel compartimento sottocutaneo attraverso una microincisione
ombelicale, previa infusione di soluzione di Klein.
Selezione e amplificazione di ADhMSCs.
Dal tessuto prelevato saranno isolate le ADhMSCs che verranno successivamente sottoposte ai processi di
amplificazione, conservazione e controllo presso la cell factory (Bioscience Institute, via Rovereta 42, 47891
Falciano, San Marino), secondo le norme della Good Manifacturing Practice (GMP), dopo specifica autorizzazione.
Impianto: Impianto di cellule staminali mesenchimali differenziate in linea linfatica nel cavo ascellare trattato con
linfoadenectomia radicale.
L’impianto della soluzione contenente le ADhMSCs provenienti dalla cell factory viene condotto in anestesia
locale a livello del cavo ascellare interessato dopo mappatura ed accurato studio del fascio vascolo-nervoso. Viene
praticata microincisione al centro della cupola ascellare attraverso la quale si introduce cannula di Coleman curva.
La scelta di una struttura ricurva favorisce iniezione sottocutanea a raggiera dal punto di incisione in una superficie
concava come quella del cavo ascellare. L’impianto prevede l’iniezione di piccoli ponfi di soluzione con
movimento retrogrado a raggiera dal braccio e dalla parete toracica verso la cupola ascella ove è stata praticata
l’incisione. L’utilizzo di questa particolare metodica ha lo scopo di distribuire la soluzione contente le cellule
staminali, in un’area il più possibile corrispondente a quella nella quale è stato praticato lo svuotamento linfonodale
rappresentata come regione di “blocco” linfatico alla linfoscintigrafia preoperatoria.
Controlli post-operatori e follow-up
1 mese:
Anamnesi
Esame obiettivo: in particolare misurazione delle circonferenze di polso, avambraccio,
gomito, braccio alla radice; misurazione della lunghezza dell’arto;
documentazione fotografica.
Ecografia tessuti molli
Ecocolordoppler
6 mesi:
Anamnesi
Esame obiettivo: in particolare misurazione delle circonferenze di polso, avambraccio,
gomito, braccio alla radice; misurazione della lunghezza dell’arto;
documentazione fotografica.
Ecografia tessuti molli
Ecocolordoppler
12 mesi:
Anamnesi
Esame obiettivo: in particolare misurazione delle circonferenze di polso, avambraccio,
gomito, braccio alla radice; misurazione della lunghezza dell’arto;
documentazione fotografica.
Ecografia tessuti molli
Ecocolordoppler
Linfoscintigrafia
Raccolta dati
Su apposita cartella informatizzata.
Riferimenti bibliografici
1.
Conrad C, Niess H, Huss R, Huber S, von Luettichau I, Nelson PJ, Ott HC, Jauch KW and Bruns CJ.
Multipotent Mesenchymal Stem Cells Acquire a Lymphendothelial Phenotype and Enhance Lymphatic
Regeneration In Vivo. Circulation 2009; 119;281-289.
2.
Suematsu S, Watanabe T. Generation of a synthetic lymphoid tissue-like organoid in mice. Nature
Biotechnology. 2004; 22; 12: 1539-1545.
3.
Ventura C, Maioli M, Asara Y, Santoni D, Scarlata I, Cantoni S and Perbellini A. Butyric and retinoic mixed
ester of hyaluronan. A novel differentiating glycoconjugate affording a high throughput of cardiogenesis in
embryonic stem cells. J. Biol. Chem. 2004; 279, 23574–23579
4.
Ventura C, Cavallini C, Bianchi F and Cantoni S. Stem cells and cardiovascular repair: a role for natural and
synthetic molecules harboring differentiating and paracrine logics. Cardiovasc Hematol. Agents Med.
Chem.2008; 6,60-68.
5.
Lionetti V, Bianchi G, Recchia F.A. and Ventura C. Control of autocrine and paracrine myocardial signals: an
emerging therapeutic strategy in heart failure. Heart Fail.2010; Rev. 15, 531-542
6.
Lionetti V, Cantoni S, Cavallini C, Bianchi F, Valente S, Frascari I, Olivi E, Aquaro G.D., Bonavita F, Scarlata
I, Maioli M, Vaccari V, Tassinari R, Bartoli A, Recchia F.A., Pasquinelli G and Ventura C. Hyaluronan mixed
esters of butyric and retinoic acid affording myocardial survival and repair without stem cell transplantation. J.
Biol. Chem.2010; 285, 9949-61
7.
Kono T, et al. Differentiation of lymphatic endothelial cells from embryonic stem cells on OP9 stromal cells.
Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol.2006; 26, 2070–2076
8.
Rennekampff HO, Reimers K, Gabka CJ, Germann G, Giunta RE, Knobloch K, Machens HG, Pallua N,
Ueberreiter K, Heimburg D and Vogt PM. Current perspective and limitations of autologous fat
transplantation--"consensus meeting" of the German Society of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgeons
at Hannover; September 2009. Handchir Mikrochir Plast Chir. 2010; 42(2):137-42
9.
Rigotti G, Marchi A, Stringhini P, Baroni G, Galiè M, Molino AM, Mercanti A, Micciolo R and Sbarbati A.
Determining the oncological risk of autologous lipoaspirate grafting for post-mastectomy breast
reconstruction. Aesthetic Plast Surg. 2010; 34(4):475-80.
10. Rigotti G, Marchi A, Galiè M, Baroni G, Benati D, Krampera M, Pasini A, Sbarbati A.Veikkola T, Karkkainen
M, Claesson-Welsh L, Alitalo K. Regulation of angiogenesis via vascular endothelial growth factor receptors.
CancerRes. 2000; 60:203–212.
Parametri utilizzati per l’analisi dei risultati della ricerca
Tutti i dati ricavati dallo studio saranno vagliati dal Centro Interdipartimentale "MathTechMed: Mathematics
for Technology, Medicine and Biosciences” dell’Università degli Studi di Ferrara
Risorse economiche necessarie per lo svolgimento della ricerca
Materiale di laboratorio: 2.000 euro;
Materiale di consumo: 500 euro.
Durata del progetto
Da ottobre 2011 a ottobre 2013.
Strategie per la divulgazione dei risultati
Pubblicazione su rivista impattata del settore.
Dichiarazione di assunzione di responsabilità degli obblighi di legge relativi alla conduzione di progetti di ricerca
da parte del Ricercatore principale
Il Ricercatore principale si assume la piena responsabilità nei confronti dell’integrità dei dati e degli obblighi
di legge.
Il Ricercatore principale dichiara inoltre di aver letto e di avvallare il presente manoscritto in tutte le sue parti.
Il Ricercatore principale non ha interessi finanziari da dichiarare.