SAPIENZA Università di Roma
Laurea magistrale in Ingegneria delle
Nanotecnologie
A.A. 2015-2016
Corso di Laboratorio di
Biofotonica
Prof. Francesco Michelotti
SAPIENZA Università di Roma
Facoltà di Ingegneria Civile e Industriale
[email protected]
LABORATORIO 3
Microscopia di Fluorescenza
Wide-Field e Confocale
Istituto Italiano di Tecnologia
Dott. Simone De Panfilis
Dipartimento di Biologia Cellulare e dello Sviluppo
Dott.ssa Angela Cirigliano
Mercolerdì 18 novembre 2015
h9.30-h11.00
Microscopia di Fluorescenza
Schema dell’esercitazione
• Descrizione di un microscopio di fluorescenza in
modalità wide-field e confocale
• Dimostrazione del suo utilizzo
• Esempi di colorazione di lieviti con:
• DAPI
• GFP – Green Fluorescent Protein
• RFP – Red Fluorescent Protein
Richiami di Microscopia ottica
Visione umana diretta
•
Le dimensioni apparenti di un oggetto
dipendono dalle dimensioni
dell’immagine che si forma sulla retina dell’occhio, che sono proporzionali
all’angolo di visione, cioè l’angolo sotteso dall’oggetto a partire dall’occhio.
•
Per vedere i dettagli occorrerebbe portarlo il più vicino possibile all’occhio.
•
Esiste una distanza minima d0 a cui può disporre un oggetto in modo che l’occhio
riesca a metterlo a fuoco sulla retina.
• Bambino di 10 anni
• Uomo adulto
• Uomo anziano
y
d0 = 7 cm
d0 = 25 cm
d0 > 25 cm (presbiopia)
0
d0
•
Angolo massimo nella visione diretta
≈
=
Richiami di Microscopia ottica
Visione umana tramite microscopio semplice (lente d’ ingrandimento)
•
Una lente sottile convergente fornisce un’immagine diritta e virtuale di un
oggetto posto a distanza inferiore della focale f.
•
Si può disporre l’oggetto in una posizione tale da formare l’immagine a distanza
dd0 dall’occhio, che in questo modo opera senza problemi.
y’

y
0
F1
f
d0
•
Angolo massimo nella visione
≈
>
Richiami di Microscopia ottica
Visione umana tramite microscopio semplice (lente d’ ingrandimento)
•
•
Le dimensioni angolari massime dell’immagine di hanno quando l’oggetto è nel piano
focale della lente.
In questo modo l’occhio opera in condizioni di completo rilassamento, ovvero è
accomodato per visione all’ infinito.
’
y
F1
f
•
Angolo massimo nella visione
•
Ingrandimento angolare
•
Tipicamente M = 5 ÷ 10
′ ≈
=
=
=
(
)
Richiami di Microscopia ottica
Visione umana tramite microscopio composto
•
Formato da due sistemi di lenti corrette.
•
Il primo (obiettivo) ha focale f1 molto corta e serve a fornire dell’oggetto un’
immagine reale ingrandita.
•
Il secondo (oculare) ha focale f2 più lunga e serve ad osservare tale immagine con
l’occhio nelle migliori condizioni.
x2
x1
f1 f1
f2
Richiami di Microscopia ottica
Visione umana tramite microscopio composto
•
L’ingrandimento angolare totale del microscopio è il prodotto dell’ingrandimento
lineare m1 dell’obiettivo e dell’ingrandimento angolare M2 dell’ oculare.
•
Ingrandimento lineare dell’obiettivo
=− =−
•
Ingrandimento angolare dell’ oculare
=
x2
x1
f1 f1
f2
(
)
≈−
Richiami di Microscopia ottica
Visione umana tramite microscopio composto
M=−
•
Ingrandimento angolare totale
•
Tipicamente si ha M<1000.
•
Nei microscopi la distanza oculare/obiettivo è fissa, essendo essi montati in un
tubo, e la messa a fuoco si esegue spostando il tubo rispetto all’oggetto da
osservare.
x2
x1
f1 f1
f2
Richiami di Microscopia ottica
Visione umana tramite microscopio composto
• Quasi tutti i fabbricanti disegnano microscopi che utilizzano obiettivi corretti per l’infinito, che proiettano
un’ immagine dell’oggetto all’infinito.
• Per visualizzare l’ immagine, il tubo deve contenere
una lente supplementare, la tube lens.
• La tube lens forma un’ immagine sul piano del diaframma dell’oculare (piano d’ immagine intermedio).
• I sistemi corretti per l’infinito:
-presentano una zona in cui i raggi sono paralleli;
-eliminano le immagini fantasma causate dal
passaggio di fasci convergenti attraverso elementi
ottici piani;
-permettono di inserire tra obiettivo e tube lens dei
sistemi ottici complessi. Ciò è particolarmente utile
in microscopia di epifluorescenza wide-field e
confocale e nelle loro evoluzioni più avanzate.
Microscopia di Fluorescenza
Schema del microscopio di
fluorescenza in riflessione
(Epifluorescenza)
• Sorgenti luminose
• Lampade(Hg, Xe)
• Laser(Ioni Argon)
Microscopia di Fluorescenza
Sorgenti luminose
Righe di emissione del laser a ioni Argon
Microscopia di Fluorescenza
Schema del microscopio di
fluorescenza in riflessione
(Epifluorescenza)
• Sorgenti luminose
• Lampade(Hg, Xe)
• Laser(Ioni Argon)
• Blocco filtri e specchio dicroico
Microscopia di Fluorescenza
Blocco filtri e specchio dicroico
• Filtro di eccitazione
Seleziona una porzione di spettro
della lampada in corrispondenza
dello spettro di eccitazione del
particolare fluoroforo utilizzato
• Specchio dicroico
Riflette la radiazione di eccitazione
e trasmette quella emessa dai
fluorofori
• Filtro di emissione
Seleziona la porzione di spettro
corrispondente allo spettro di
emissione
del
particolare
fluoroforo utilizzato
Microscopia di Fluorescenza
Blocco filtri e beam splitter
• Nei microscopi di fluorescenza commerciali i tre filtri necessari per visualizzare un particolare cromoforo sono
raccolti in un blocchetto.
• I microscopi sono dotati di più
blocchetti che possono essere cambiati mediante un caricatore.
• Quasi tutti i filtri sono di tipo
interferenziale. Sono multistrati periodici costituiti da due materiali ad
alto e basso indice di rifrazione.
Microscopia di Fluorescenza
Blocco filtri e beam splitter
Cromoforo: Green Fluorescent Protein (GFP)
Le caratteristiche principali cui deve soddisfare un filtro sono:
• Valori minimi di autofluorescenza
• Transizioni molto nette tra zone di trasmissione e riflessione
• Trasmittanza massima nella regione di trasmissione
• Rapporto segnale rumore massimo
Microscopia di Fluorescenza
Blocco filtri e beam splitter
Cromoforo: 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)
Microscopia di Fluorescenza
Filtri interferenziali
Microscopia di Fluorescenza
Problemi
• La fluorescenza che proviene dalle
zone del campione fuori dal piano
focale illuminate viene comunque
raccolta dal detector. Ciò causa un
deterioramento del contrasto.
DETECTOR
LAMPADA
• Lo spessore dei campioni è quindi
limitato alla profondità focale dell’
obiettivo da microscopio utilizzato.
• La rivelazione di bassissime concentrazioni di cromofori è limitata dal
rapporto segnale rumore ovvero dal
potere del filtro di emissione di
estinguere completamente i fotoni
del fascio di eccitazione.
Piano focale
Microscopia di Fluorescenza
GFP fusion
Microscopia di Fluorescenza
The rpn11-m1 mutant shows a mitochondrial morphology defect
Wild-type
rpn11-m1
Fluorescence microscopy images; DAPI staining and MitoGfp
Risoluzione laterale di un microscopio wide-field


Schermo
D
x
n
n’
Diffrazione ( Airy)
→
Apertura numerica
→

sin     1.22
D
N.A.  n  sin   n    n 
D
2x
Risoluzione laterale di un microscopio wide-field
Schermo

n
dMIN
Rayleigh
Snell
→
’
n’
→
 'MIN   AIRY

'
n sin  n ' sin
2
2

 1.22
D
 
sin 
2 2
n  n'  '
Risoluzione laterale di un microscopio wide-field

n
’
dMIN
n’
d MIN    x 
Abbe
→
n'
n'
 n' D
 0.61    n ' 0.61    n '
 ' x  x 1.22'MIN AIRY1.22


1.22 
n
n
D n 2
DD
n 
N.A.
d MIN
0.61   n' 0.61 


N . A.
N . A.
essendo n'  1
Risoluzione laterale di un microscopio wide-field
Risoluzione laterale di un microscopio ottico convenzionale.
Obiettivo
N.A.
dMIN
@535nm
dMIN
@670nm
20x
0.5 (aria)
652.7nm
817.4nm
40x
0.75 (aria)
435.1nm
544.9nm
60x
1.4 (olio)
233.1nm
291.9nm
Microscopia confocale
Schema dell’esercitazione
• Dimostrazione del suo utilizzo su:
• Lieviti marcati con DAPI e GFP
• Strutture fotoniche o biologiche studiate
dal laboratorio ospite
Microscopia confocale
DETECTOR
Caratteristiche
• Il microscopio confocale utilizza lo stesso schema del
microscopio di fluorescenza. In particolare il blocco
dei filtri di eccitazione ed emissione e lo specchio
dicroico.
• La sorgente è normalmente un laser a singola linea.
• La novità fondamentale è l’introduzione di un pin-hole
nel punto in cui vengono rinviati i raggi provenienti dal
piano focale (punto coniugato). Il pin-hole:
LASER
• elimina la radiazione proveniente dai piani fuori
fuoco;
• Permette di aumentare la risoluzione laterale
filtrando i massimi secondari della figura di
diffrazione:
d MIN 
0 .4  
N . A.
• Spostando il campione verticalmente si possono
ottenere delle immagini della fluorescenza che
proviene da vari piani all’interno del campione con
risoluzione assiale
d ASS 
1.4    n
( N . A.) 2
Piano focale
Microscopia confocale
Risoluzione laterale ed assiale di un microscopio confocale.
Obiettivo
N.A.
dMIN
dMIN
dASS
dASS
@535nm @670nm @535nm @670nm
20x
0.5 (aria) 428.0nm 536.0nm 4.164mm 5.215mm
40x
0.75
285.3nm 357.3nm 1.850mm 2.318mm
(aria)
1.4 (olio) 152.8nm 191.4nm 0.531mm 0.665mm
60x
Microscopio ottico
Obiettivo
N.A.
dMIN
@535nm
dMIN
@670nm
20x
0.5 (aria)
652.7nm
817.4nm
40x
0.75 (aria)
435.1nm
544.9nm
60x
1.4 (olio)
233.1nm
291.9nm
Microscopia confocale
Caratteristiche dei «sistemi scanning»
Le immagini vengono ottenute spostando il punto in cui viene eccitato il
campione, e da cui viene emessa la fluorescenza, mediante un sistema di due
specchi montati su attuatori galvanometrici (scanner).
Microscopia confocale
Caratteristiche dei «sistemi spinning disk»
• Le immagini vengono ottenute utilizzando un Nipkow disk associato ad un
array di microlenti.
• Tali sistemi possono utilizzare dischi contenenti arrays di circa 20000
microlenti.
• Ogni microlente ha il compito di
focalizzare esattamente nel pinhole
sottostante la luce che arriva,
aumentando
l’intensità
laser
(portandola a circa il 70%) che arriva
sul campione.
• Illuminando anche 1000 punti del
campione alla volta (multi-point
scanner), può raggiungere velocità
di scansione superiori a 2000 fps,
diventando quindi uno strumento
essenziale per studi di live cells in
real-time.
Microscopia confocale
DETECTOR
Problemi
• L’utilizzo del pin-hole riduce molto la
luminosità delle immagini. Occorre
quindi aumentare la sensibilità del
detector
(tubi
fotomoltiplicatori),
l’intensità della sorgente di eccitazione
oppure i tempi di esposizione.
LASER
• In entrambi i due ultimi casi aumenta la
dose di radiazione fornita ai fluorofori
accelerando il processo di photobleaching.
• La microscopia confocale non può
quindi essere utilizzata su fluorofori
che presentano soglie di photobleaching basse, come ad esempio il
DAPI.
Piano focale
Microscopia confocale
DETECTOR
ESERCITAZIONE
• Analisi di lieviti colorati con Green
Fluorescent Protein (GFP). Paragone
tra le immagini ottenute per
microscopia wide-field in luce bianca,
microscopia wide-field di fluorescenza e microscopia confocale.
LASER
• Analisi di strutture fotoniche.
Piano focale