Progetto VATUB
Italiano
Nome del progetto
Approccio biotecnologico alla progettazione razionale di vaccini:
nuovo vaccino anti TB. Acronimo: VATUB
Keywords
Glicoproteine; Tubercolosi; Vaccini
Ente finanziatore
Regione Lombardia
BANDO
PER LA REALIZZAZIONE DI INIZIATIVE FINALIZZATE AD
INCREMENTARE L’ATTRATTIVITÀ DEL TERRITORIO LOMBARDO, LA
VALORIZZAZIONE DEL CAPITALE UMANO E LA COOPERAZIONE SCIENTIFICA
Persona di riferimento
Importo euro
Periodo
Enti IBC coinvolti
Abstract scientifico
Prof Marco Terreni. Dipartimento di Chimica Farmaceutica; Università
Degli Studi di Pavia.
893.360 Euro
2010-2012
Università Degli Studi di Pavia: Dipartimento di Chimica
Farmaceutica; Dipartimento di Malattie Infettive.
Università Degli Studi di Milano: Dipartimento di Chimica Organica
e Industriale
In collaborazione con
Università Dell’Insubria: Dipartimento Di Biotecnologie E Scienze
Molecolari
Ruolo del Consorzio IBC: Coordinanzione scientifica, divulgazione e
formazione
Italiano
L'obiettivo di questo progetto di ricerca è la semi-sintesi e la
caratterizzazione analitica di glicopeptidi e glicoproteine semisintetiche (neo-glicoproteine) progettati sulla base della struttura
chimica di ben definiti determinanti antigenici del Mycobacterium
tuberculosis (MTB), e la loro valutazione biologica come potenziali
agenti immunogenici. In particolare, verranno studiati vaccini ottenuti
mediante coniugazione di componenti antigeniche di natura
oligosaccaridica a struttura correlata a quella del lipoarabinomannano
(LAM), il principale antigene di membrana di MTB, con proteine
selezionate non solo per la funzione di semplici carriers, ma anche
perché caratterizzate da attività immunogenica in quanto potenti epitopi
nei confronti delle cellule-T. Questo approccio dovrebbe portare ad un
potenziale vaccino antitubercolare che possieda una attività
immunogenica in grado di stimolare sia una risposta anticorpale che
cellulomediata.
Per raggiungere tali obbiettivi, verranno ad esempio preparati diversi
tetrasaccaridi chimicamente correlati al LAM. A causa della loro scarsa
immunogenicità, gli oligosaccaridi necessitano di essere coniugati ad
un carrier immunogenico (generalmente peptidi o proteine) per evocare
una risposta immunitaria. Quindi gli oligosaccaridi sintetizzati e
correlati a porzioni immunogeniche di MTB, verranno legati a peptidi e
proteine. I glicopeptidi e le neo-glicoproteine così ottenute, dovrebbero
stimolare il sistema immunitario a produrre anticorpi specifici contro
l’agente patogeno che esprime gli stessi oligosaccaridi sulla superficie
esterna.
In particolare verranno anche considerate proteine (quali Rv125 5,
Rv1767, Rv3425) selezionate in quanto iper-espresse dal micobatterio
durante l'infezione e caratterizzate da attività immunogenica. Sarà
quindi necessario produrre queste proteine antigeniche del MTB in
forma ricombinante. Tali proteine saranno poi coniugate agli
oligosaccaridi correlati alla struttura del LAM al fine di ottenere neoglicoproteine in grado di mimare diverse componenti immunogeniche
naturalmente esposte sulla parete cellulare del MTB.
Tuttavia, la sintesi e lo sviluppo di nuovi farmaci a struttura complessa,
quale quella di oligosaccaridi e dei loro derivati di coniugazione, è
fortemente condizionata dalla mancanza di strategie chimiche semplici
ed efficienti per la loro sintesi. Per questo motivo, la prima fase del
progetto sarà rivolta allo studio e allo sviluppo di metodi preparativi
efficienti per la sintesi di oligosaccaridi, mediante un approccio
integrato tra chimica e biotecnologia. Questa strategia consentirà di
superare alcuni steps limitanti propri della sintesi chimica accelerando,
di conseguenza, la preparazione di potenziali nuovi leads.
La sintesi degli oligosaccaridi di interesse sarà effettuata mediante
tecniche chemo-enzimatiche basate sull'utilizzo di enzimi
ingegnerizzati. In particolare verranno impiegate idrolasi (lipasi ed
esterasi) opportunamente immobilizzate per catalizzare l'idrolisi
regioselettiva nelle posizioni C-2 e C-6 di piranosi peracetilati. Tali
intermedi saranno poi utilizzati per la sintesi degli oligosaccaridi di
interesse.
Tutte le attività sperimentali proposte saranno monitorate mediante
metodi analitici appositamente sviluppati che consentiranno la
completa caratterizzazione dei glicoconiugati. In particolare, per le
neo-glicoproteine, l'immobilizzazione su colonna analitica di proteasi
aspecifiche (pronasi) consentirà di effettuare la digestione della
proteina e, contemporaneamente, di separare e analizzare on-line,
mediante spettroscopia di massa, i glicani e i glicopeptidi ottenuti.
Questo metodo potrà fornire dati strutturali completi, nonché
informazioni sui siti di glicosilazione delle proteine.
Le diverse neo-glicoproteine saranno poi fornite al Dipartimento di
Malattie Infettive dell’Università di Pavia, che le saggerà mediante
opportuni test biologici in vitro (ex-vivo). Questi studi saranno condotti
su siero di pazienti con tubercolosi attiva, pazienti con infezione
tubercolare latente (LTBI), oltre che su soggetti controllo vaccinati con
Bacilli Calmette and Guerin (BCG) e non vaccinati con BCG.
Parallelamente, i controlli non vaccinati con BCG dovranno
comprendere operatori sanitari esposti al rischio tubercolare e con
infezione tubercolare latente. In particolare, allo scopo di valutare se gli
anticorpi riconoscono le neo-glicoproteine studiate nel progetto di
ricerca, queste saranno saggiate per valutare la loro immunogenicità
con un test ELISA, per determinare la risposta anticorpale, oltre che
con il test ELISPOT e con la citometria di flusso per misurare la
risposta immunitaria cellulomediata da parte dei linfociti T.