Mercodia
Adiponectin ELISA
Instruzioni per l’uso 10-1193-01
REAGENTI PER 96 RILEVAZIONI
Per uso diagnostico in vitro
Prodotto da
Mercodia AB, Sylveniusgatan 8A,
SE-754 50 Uppsala,
Svezia
SPIEGAZIONE DEI SIMBOLI USATI SULLE ETICHETTE
Reagenti per 96 rilevazioni
∑ = 96
Data di scadenza
Conservare tra 2 e 8ºC
Lotto n.
Per uso diagnostico in vitro
© Mercodia 2009 - 2015
USO PROPOSTO
Mercodia Adiponectin ELISA fornisce un metodo per la determinazione quantitativa di adiponectina umana nel siero o nel plasma.
RIASSUNTO E SPIEGAZIONE DEL TEST
L'adiponectina è chiamata anche Acrp30 (30kDa adipocyte complement-related protein), GBP28
(Gelatin-binding protein), adipoQ, apM1 (Adipose most abundant gene transcript 1) [1, 2].
L'adiponectina è un ormone secreto dagli adipociti, costituito da 244 amminoacidi con un
peso molecolare di circa 30kDa (28-30kDa). È una delle proteine più abbondanti nel sangue
umano, con concentrazioni in circolo di 0.5-30 μg/mL, che significa circa lo 0.01% delle proteine
totali nel plasma [2].
La proteina si divide in quattro domini: un dominio C-terminale globulare, un dominio Nterminale simil-collagene, un dominio peptide segnale e un dominio ipervariabile. Il dominio
globulare ha significative similitudini di sequenza e strutturali con il fattore complementare C1q
[2,3]. Il dominio globulare ha anche similitudini strutturali con TNF-α [3-5].
La concentrazione di adiponectina è inversamente associata al diabete tipo 2, alla malattia
coronarica e all'obesità, definiti sindrome metabolica se presenti insieme. L'adiponectina riduce
il glucosio nel sangue e le concentrazioni di acidi grassi liberi nel siero e aumenta la sensibilità
all'insulina [7]. È stato anche dimostrato che l'adiponectina ha effetti anti-infiammatori [2].
È stata suggerita l'esistenza dell'adiponectina in diverse forme in circolo: monomeri, forme
globulari isolate (i domini globulari), trimeri, esameri e oligomeri più grandi [8-11]. Si pensa che
i monomeri si associano in circolo ai trimeri attraverso i domini globulari. I trimeri sono associati
a oligomeri più grandi attraverso il dominio simil-collagene [7].
Tuttavia, studi recenti indicano che l'adiponectina potrebbe non essere presente in circolo in
monomeri o forme globulari isolate, ma piuttosto in strutture multimeriche. Gli studi hanno mostrato che le forme dominanti di adiponectina che circola nel sangue umano sono esameri (LMW)
e oligomeri più grandi (HMW) [6, 12-14]. I livelli di adiponectina LMW non sembrano differire tra i
soggetti sensibili all'insulina e quelli resistenti all'insulina, né differire tra uomini e donne. I livelli aumentati di adiponectina totale in soggetti sensibili all'insulina e nelle donne erano causati dall'aumento del livello di adiponectina HMW. Sia l'adiponectina totale che l'adiponectina HMW hanno
mostrato differenze significative tra i soggetti sensibili all'insulina e quelli resistenti all'insulina
secondo Lara-Castro et al. 2006 [6].
Nel sangue circolano varie isoforme di adiponectina. È ancora da determinare se tutte le
isoforme siano secrete dagli adipociti, se ci sia un assemblaggio post-trascrizionale dell'adiponectina HMW nel sangue o se la forma HMW sia secreta e degradata nel sangue. Non è chiaro
ancora l'importanza metabolica individuale di ciascuna isoforma di adiponectina [6].
3
PRINCIPIO DI PROCEDURA
Mercodia Adiponectin ELISA è un immunodosaggio enzimatico a due siti in fase solida. Si basa
sulla tecnica del sandwich diretto nella quale due anticorpi monoclonali sono diretti contro
determinanti antigenici separati sulla molecola di adiponectina. Durante l’incubazione, l'adiponectina nel campione reagisce con anticorpi anti-adiponectina coniugati a pozzetti di microtitolazione. Dopo il lavaggio, sono aggiunti gli anticorpi anti-adiponectina coniugati a perossidasi
e dopo la seconda incubazione e un semplice lavaggio che rimuove gli anticorpi marcati degli
enzimi non legati, il legame coniugato è rilevato tramite reazione con la 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina (TMB). La reazione è fermata mediante aggiunta di acido per dare un punto finale
colorimetrico che è letto tramite spettrofotometria.
PRECAUZIONI E AVVISI
•
•
•
•
•
Per uso diagnostico in vitro.
I contenuti di questo kit e i suoi residui non devono essere ammessi al contatto con
animali ruminanti o suini.
La Soluzione Stop in questo kit contiene 0.5 M H2SO4. Seguire le precauzioni di routine
per la manipolazione di sostanze chimiche pericolose.
Tutti i campioni dei pazienti devono essere manipolati come capaci di trasmettere
infezioni.
Ciascun pozzetto può essere usato una sola volta.
MATERIALI RICHIESTI MA NON INCLUSI
• Pipette con volumi adeguati (riutilizza le pipette in dotazione per l’aggiunta
della Assay Buffer, soluzione enzima coniugato 1X , Substrate TMB e Stop Solution)
• Provette, becher e cilindri per la preparazione di reagenti
• Acqua ridistillata
• Agitatore magnetico
• Miscelatore di vortice
• Lettore micro piastra (450 nm filtro)
• Piastra dello shaker (700-900 giri/minuto, movimiento orbital)
• Micro piastra piano di lavaggio con la funzione traboccare-lavare (consigliato ma non
obbligatorio)
4
REAGENTI
Ogni kit Mercodia Adiponectin ELISA (10-1193-01) contiene reagenti per 96 pozzetti, sufficienti
per 42 campioni e una curva di calibrazione in duplicato. Per serie di analisi più ampie, usare reagenti provenienti da confezioni portanti identici numeri di lotto. La data di scadenza del kit completo è indicata sull'etichetta esterna. Si raccomanda di conservare a una temperatura di 2-8ºC.
Coated Plate 1 piastra 96 pozzetti Pronto all’uso
Anticorpo monoclonale anti-adiponectina umana strisce da 8 pozzetti
Per le strisce di microtitolazione non utilizzate, sigillare nuovamente la confezione con nastro
adesivo e conservare a 2-8ºC e utilizzare entro 2 mesi.
Calibrators 1, 2, 3, 4, 5 5 fiale Adiponectina umana ricombinante
Codificato con colore giallo Concentrazione indicata sull’etichetta della fiala.
1000 µL
Pronto all’uso
Calibrator 0 Codificato con colore giallo
1 fiala 5 mL Pronto all’uso
Assay Buffer
Codificato con colore rosso
1 fiala
12 mL
Pronto all’uso
Sample Buffer 2X
1 bottiglia
50 mL
Codificato con colore giallo Conservazione dopo la diluizione:
2-8ºC per 2 mesi.
Enzyme Conjugate 11X 1 fiala 1.3 mL
Anticorpo monoclonale murino anti-adiponectina i
umana coniugato a perossidas
Enzyme Conjugate Buffer
Codificato con colore blu.
1 fiala 13 mL Diluire con 50 mL
acqua ridistillata per preparare la soluzione di sample
buffer 1X
Preparazione,
vedi sotto
Pronto all’uso
Wash Buffer 21X 1 bottiglia 50 mL mL Conservazione dopo la diluizione: per 2-8ºC per 2 mesi.
Diluire con 1000
acqua ridistillata
preparare soluzione
wash buffer 1X.
Substrate TMB
Soluzione incolore
Nota! Sensibile alla luce!
1 bottiglia 22 mL Pronto all’uso
Stop Solution
0.5 M H2SO4
1 fiala 7 mL
Pronto all’uso
5
Preparazione della soluzione enzyme conjugate 1X
Preparare la quantità necessaria della soluzione enzyme conjugate 1X con la diluizione
dell’Enzyme Conjugate 11X (1+10) nell’Enzyme Conjugate Buffer in base alla tabella sottostante. Mescolare lievemente. Quando si prepara la soluzione enzyme conjugate 1X per tutta
la piastra o se i reagenti devono essere usati entro 2 mesi, versare tutto il tampone Enzyme
Conjugate Buffer nella fiala dell’Enzyme Conjugate 11X.
Numero di strisce
Enzyme
Conjugate 11X
Enzyme
Conjugate Buffer
12 strisce
6 strisce
4 strisce
1 fiala
600 μL
400 μL
1 fiala
6.0 mL
4.0 mL
Conservazione dopo la diluizione: 2-8ºC per 2 mesi.
RACCOLTA E MANIPOLAZIONE DEI CAMPIONI
Siero
Prelevare il sangue mediante puntura endovenosa, lasciare coagulare. Separare il siero mediante
centrifugazione a 4 300 g per 15 minuti a 2-8ºC. I campioni possono essere conservati a 2-8ºC
fino a 2 settimane. Per periodi più lunghi, conservare i campioni a -20ºC. Evitare di ripetere il
congelamento e lo scongelamento.
Plasma
Prelevare il sangue mediante puntura endovenosa in provette contenenti eparina, citrato o EDTA
come anticoagulante e separare la frazione del plasma mediante centrifugazione. I campioni
possono essere conservati a 2-8ºC fino a 2 settimane. Per periodi più lunghi, conservare i campioni a -20ºC. Evitare di ripetere il congelamento e lo scongelamento.
PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
I campioni devono essere diluiti 1/101 v/v con sample buffer (20 μL campione + 2.0 mL della
soluzione sample buffer 1X). I campioni diluiti possono essere conservati a 2-8ºC fino a 2 settimane.
Nota! Buffer contenenti azoturo di sodio (NaN3) non possono essere usati per la diluizione del
campione.
6
PROCEDURA DEL TEST
Tutti i reagenti e i campioni devono essere portati a temperatura ambiente prima dell’uso.
Preparare una curva di calibrazione per ciascuna sessione analitica.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Preparare la soluzione enzyme conjugate 1X (secondo la tabella sulla pagina anteriore),
soluzione sample buffer 1X, soluzione wash buffer 1X e campioni.
Preparare un numero sufficiente di pozzetti di micro piastre per alloggiare i Calibrators,
controlli e campioni in duplicato.
Pipettare 25 µL di ogni Calibrator, controlli e campione negli appositi pozzetti.
Aggiungere 100 µL di Assay Buffer ad ogni pozzetto.
Incubare in un agitatore di piastre (700-900 rpm) per 1 ora a temperatura ambiente
(18-25°C).
Lavare 6 volte con 700 μL di soluzione wash buffer 1X a pozzetto utilizzando un lavapiastre automatico con funzione lavaggio overflow, dopo il lavaggio finale capovolgere
e colpire la piastra con decisione sulla carta assorbente. Nella procedura di lavaggio
non utilizzare la funzione immersione.
Oppure manualmente,
Eliminare il volume di reazione capovolgendo la micropiastra su un lavabo. Aggiungere
350 μL di soluzione wash buffer 1X a ogni pozzetto. Eliminare la soluzione wash buffer
1X, picchiettare con decisione più volte contro carta assorbente per rimuovere l'eccesso
di liquido. Ripetere 5 volte. Evitare immersioni prolungate durante la procedura di
lavaggio.
Aggiungere 100 µL di soluzione enzyme conjugate 1X a ogni pozzetto.
Incubare in un agitatore di piastre (700-900 rpm) per 1 ora a temperatura ambiente
(18-25°C).
Lavare come descritto al punto 6.
Aggiungere 200 µL di Substrate TMB a ogni pozzetto.
Incubare in panchina per 15 minuti a temperature ambiente (18-25ºC).
Aggiungere 50 µL di Soluzione Stop a ogni pozzetto. Mettere la piastra nell'agitatore
per circa 5 secondi per garantire la miscelazione.
Leggere la densità ottica a 450 nm e calcolare i risultati. Effettuare la lettura entro 30
minuti.
Nota! Fare particolare attenzione a non contaminare il substrato TMB con la soluzione dell’enzima coniugato.
CONTROLLO DI QUALITÀ INTERNO
I controlli commerciali come Mercodia Obesity Control kit (10-1241-01) e/o i pool di plasma/
siero interni con concentrazioni di adiponectina basse, intermedie e alte devono essere analizzati periodicamente come campioni, e i risultati tracciati di giorno in giorno. È buona norma di
laboratorio registrare i seguenti dati per ciascuna analisi: numero di lotto del kit, date di diluizione e/o ricostituzione dei componenti del kit, valori di DO per bianco, Calibrators e Controlli.
I laboratori dovrebbero seguire le norme governative o i requisiti di accreditamento per la
frequenza dei controlli di qualità.
7
CALCOLO DEI RISULTATI
Calcolo computerizzato
La concentrazione di adiponectina è ottenuta da riduzione dei dati computerizzati dell'assorbanza per i Calibrators 1-5, in contrapposizione alla concentrazione utilizzando una regressione
spline cubica.
Calcolo manuale
1.
Tracciare i valori di assorbanza ottenuti per i Calibrators 1-5, contro la concentrazione di
adiponectina su carta log-log e costruire una curva di calibrazione.
2.
Leggere la concentrazione dei campioni dalla curva di calibrazione.
3.
Moltiplicare la concentrazione per il fattore di diluizione.
Esempio di risultati
Pozzetti
Identità
A450
1A–B
1C–D
1E–F
1G–H
2A–B
2C–D
2E–F
2G–H
3A–B
Calibrator 0
Calibrator 1*
Calibrator 2*
Calibrator 3*
Calibrator 4*
Calibrator 5*
Campione 1
Campione 2
Campione 3
0.059/0.056
0.106/0.102
0.207/0.216
0.563/0.559
1.477/1.567
2.602/2.681
0.374/0.367
0.754/0.758
1.385/1.373
Conc. media ngL/
mL
x101 μg/mL
29.825
67.178
133.340
3.012
6.785
13.467
*Concentrazione precisa indicata sull’etichetta della fiala.
Esempio di curva di calibrazione
La curva qui mostrata è una curva di calibrazione tipica. Non usare questa curva per determinare i risultati delle analisi reali.
10
(450 nm)
ODOD(450
nm)
1
0,1
0,01
1
10
100
Concentration (ng/ml)
Concentrazione
(ng/mL)
8
1000
LIMITI DELLA PROCEDURA
Come tutti i test diagnostici, una diagnosi clinica definitiva non deve essere basata sui risultati
di un singolo test, ma dovrebbe essere effettuata da un medico in seguito alla valutazione di
tutti i risultati clinici.
I campioni lipemici, itterici o emolizzati non interferiscono con l’analisi.
VALORI PREVISTI
La buona pratica prevede che ogni laboratorio stabilisca il proprio intervallo di valori previsti.
Mercodia Adiponectin ELISA rileva adiponectina LMW(Esamero 230kDa) e HMW(Oligomero
>420 kDa), come determinata dalla cromatografia per esclusione su gel.
Le diverse forme multimeriche di adiponectina endogene sono state studiate e separate in
siero da un individuo sano con un metodo a tre fasi; precipitazione con solfato di ammonio
seguita da scambio ionico e cromatografia di filtrazione su gel.
Con la cromatografia a scambio ionico, le proteine si legano alla matrice con forze elettrostatiche causando separazione in quanto diverse proteine/isoforme hanno diverse cariche nette o
punti isoelettrici totali. La colonna di scambio ionico usata è Mono Q 10/100GL (GE Healthcare).
È stato usato tampone di trietanolammina per l'eluizione delle proteine.
Si è osservato che le isoforme di adiponectina hanno diversi punti isoelettrici e schemi posttraslazionali [15]. L'idrossilazione della prolina e l'idrossilazione/glicossilazione della lisina sono
ritenute di grande importanza per l'assemblaggio degli oligomeri [12,15].
Sono stati visualizzati cinque picchi chiaramente distinti quando l'adiponectina sierica è stata
separata tramite cromatografia a scambio ionico, a indicazione che l'adiponectina analizzata
presenta almeno cinque diversi schemi post-traslazionali, che portano a diversi punti isoelettrici,
vedi figura 1 sotto. I pool A-E sono stati ulteriormente analizzati tramite cromatografia per esclusione su gel per determinare le dimensioni apparenti delle forme di adiponectina multimeriche.
450
Measured concentration of Adiponectin (ng/ml)
Concentrazione di adiponectina misurata (ng/mL)
500
400
350
300
250
200
150
100
50
0
0
5
10
15
Pool
20
A
25
B
30
C
35
D
40
-
45
50
55
60
E
Fraction
number
Numero
frazione
Figura 1. Profilo di eluizione dell'adiponectina sierica da cromatografia a scambio ionico e come identificato dal
Mercodia Adiponectin ELISA. Le frazioni di picco sono stati combinati a A, B, C, D, E.
9
La cromatografia di filtrazione per esclusione su gel separa le proteine in base alla dimensione
globulare apparente. È stata usata la colonna di filtrazione su gel HiLoad 16/60 Superdex 200
prep grade (GE Healthcare). È stato usato PBS per l'eluizione delle proteine.
Sono stati visualizzate tre forme multimeriche dominanti quando l'adiponectina sierica è stata
separata tramite cromatografia per esclusione su gel, con dimensioni apparenti di 230 kDa, 420
kDa e > 600 kDa rispettivamente, e interpretate come LMW (esamero 230 kDa) e HMW (420
kDa e >600 kDA), vedi figura 2 sotto.
Concentrazione
di adiponectina
misurata
(ng/mL)
Measured concentration
of Adiponectin
(ng/ml)
900
420kDa
800
700
D
600
C
500
E
400
Pool
>600kDa
300
230kDa
200
B
100
A
0
1
4
7
10
13
16
19
22
25
28
31
34
37
Fraction
number
Numero
frazione
Figura 2. Profilo di eluizione dell'adiponectina sierica da cromatografia di filtrazione per esclusione su gel e
come identificato dal Mercodia Adiponectin ELISA. Tutti i pool (A, B, C, D, E) sono stati analizzati separatamente
e combinati in un pool (Pool).
In conclusione, l'adiponectina sierica analizzata ha mostrato tre forme multimeriche dominanti in base alle dimensioni, e cinque diverse forme in base ai punti isoelettrici, o cariche
nette totali.
10
CARATTERISTICHE DEL RENDIMENTO
Limite di rilevabilità
Il limite di rivelabilità è definito come la Capacità di Rivelazione in base alla ISO11843-Parte 1.
La Capacità di Rivelazione deve essere considerata parte di un metodo di verifica, piuttosto
che la concentrazione minima misurabile. Il limite di rilevabilità è 1.25 (ng/mL) come determinato dalla metodologia descritta nella ISO11843- Parte 4.
La concentrazione dei campioni con assorbanza inferiore al Calibrator 1 non devono essere calcolati,
maespresse come minori o uguali (≤) rispetto alla concentrazione indicata sulla fiala per il Calibrator 1.
Recupero
Il recupero all’aggiunta è 92 -109% (media 101%).
Il recupero alla diluizione è 89 – 111% (media 98%).
Effetto gancio
Non esiste alcun effetto gancio.
Precisione 1,2
Ogni campione è stato analizzato in 4 repliche in 39 momenti diversi. Le analisi sono state
fatte in un laboratorio con un lotto di kit e da 4 tecnici.
Coefficiente di variazione
Campione
Valore medio
ng/mL
1
29.7
2
65.9
3
130
1
ISO 5725-1,2 EP-5A
% durante
l’analisi
% tra analisi
% totale analisi
3.0
2.7
3.0
5.3
5.0
5.8
5.5
5.2
6.0
Riproducibilità 1,2
Ogni campione è stato analizzato in 4 repliche in 90 momenti diversi. Le analisi sono state
fatte in due laboratori con 5 lotti di kit e da 9 tecnici.
Coefficiente di variazione
Campione
Valore medio
ng/mL
1
30.2
2
67.3
3
139
1
ISO 5725-1,2 EP-5A
% durante
l’analisi
% tra analisi
% totale analisi
2.3
2.2
2.2
5.4
6.0
6.0
5.5
6.1
6.1
11
Specificità
Sono state riscontrate le seguenti reazioni crociate:
C1q ≤ 0.007%
TNF-α n.d.
n.d.=not detected (non rilevato)
CALIBRAZIONE
L'Adiponectin ELISA è calibrato in base a una preparazione di adiponectina commerciale, validata, altamente purificata.
GARANZIA
I dati sul rendimento presentati qui sono stati ottenuti usando le procedure indicate. Qualsiasi
cambiamento o modifica nella procedura non raccomandata da Mercodia AB può avere effetti
sui risultati, in tale caso Mercodia rinuncia a tutte le garanzie espresse, implicite o legali, inclusa
la garanzia implicita di commerciabilità o idoneità per l’uso.
Mercodia AB e i suoi distributori autorizzati, in tal caso, non saranno responsabili dei danni
indiretti o consequenziali.
RIFERIMENTI
[1] PDB, Protein Data Bank: www.expasy.org, adiponectin: Q 15848 (21 oct.2005)
[2] Meier U and Gressner AM (2004) Endocrine Regulation of Energy Metabolism: Review
of Pathobiochemical and Clinical Aspects of Leptin, Ghrelin, Adiponectin, and Resistin. Clin
Chem 50:1511-1525
[3] Tsao TS, Lodish HF and Fruebis J (2002) ACRP30, a new hormone controlling fat and glucose
metabolism. Eur J Pharmacol 440:213-221
[4] Shapiro L and Scherer PE (1998) The crystal structure of a complement-1q family protein
suggests an evolutionary link to tumor necrosis factor. Curr Biol 12:335-338
[5] Bobbert T, Rochlitz H, Wegewitz U, Akpulat S, Mai K, Weickert MO, Mohlig M, Pfeiffer AF and
Spranger J (2005) Changes of adiponectin oligomer composition by moderate weight reduction.
Diabetes 54:2712-2719
[6] Lara-Castro C, Luo N, Wallace P, Klein RL and Garvey T (2006) Adiponectin Multimeric
Complexes and the Metabolic Syndrome Trait Cluster. Diabetes 55: 249-259
[7] Duntas LH, Popovic V and Panotopoulos G (2004) Adiponectin: Novelties in Metabolism and
Hormonal Regulation. Nutr Neurosci 7:195-200
[8] Tsao TS, Lodish HF and Fruebis J (2002) ACRP30, a new hormone controlling fat and glucose
metabolism. J Biol Chem 50:50810-50817
[9] Nakashima R, Kamei N, Yamane K, Nakanishi S, Nakashima A and Kohno N (2006) Decreased
Total and High Molecular Weight Adiponectin Are Independent Risk Factors for the Development
of Type 2 Diabetes in Japanese-Americans. Clin Endocrinol Metab 91:3873-3877
12
[10] Hara K, Horikoshi M, Yamauchi T, Yago H, Miyazaki O, Ebinuma H, Imai Y, Nagai R,
and Kadowaki T (2006) Measurement of the High-Molecular Weight Form of Adiponectin in
Plasma Is Useful for the Prediction of Insulin Resistance and Metabolic Syndrome. Diabetes
Care 29:1357-1362
[11] Nakano Y, Tobe T, Choi-Miura NH, Mazda T and Tomita M (1996) Isolation and Charactrization of GBP28, a Novel Gelatin-Binding Protein Purified from Human Plasma. J Biol Chem
120:803-812
[12] Bodles AM, Banga A, Rasouli N, Ono F, Kern PA and Owens RJ (2006) Pioglitazone increases
secretion of high-molecular-weight adiponectin from adipocytes. Am J Physiol Endocrinol Metab
291:E1100-E1105
[13] Halperin F, Beckman JA, Patti ME, Trujillo ME, Garvin M, Creager MA, Scherer PE and Goldfine AB (2005) The role of total and high-molecular-weight complex of adiponectin in vascular
function in offspring whose partents both had type 2 diabetes. Diabetologia 48:2147-2154
[14] Fisher FF, Trujillo ME, Hanif W, Barnett AH, McTernan PG, Scherer PE, and Kumar S (2005)
Serum high molecular weight complex of adiponectin correlates better with glucose tolerance
than total serum adiponectin in Indo-Asian males. Diabetologia 48:1084-1087
[15] Wang Y, Lu G, Wong WP, Vliegenthart JF, Gerwig GJ, Lam KS, Cooper GJ and Xu A (2004)
Proteomic and functional characterization of endogenous adiponectin purified from fetal bovine
Ulteriori riferimenti sono disponibili sulla nostra pagina web: www.mercodia.com
13
X-O Graf Tryckeri AB
SOMMARIO DEL PROTOCOLLO
Mercodia Adiponectin ELISA
Aggiungere Calibrators, controlli* e
campioni
25 μL
Aggiungere Assay Buffer
100 μL
Incubare
Lavare piastra con soluzione wash
buffer 1X
Aggiungere soluzione enzyme conjugate
1X
Incubare
Lavare piastra con soluzione wash
buffer 1X
Aggiungere Substrate TMB
Incubare
Aggiungere Soluzione Stop
Misurare A450
*Non forniti
1 ora a 18-25ºC in agitatore di piastre
700-900 rpm
700 µL, 6 volte
100 μL
1 ora a 18-25ºC in agitatore di piastre
700-900 rpm
700 µL , 6 volte
200 μL
15 minuti a 18-25°C
50 μL
Agitare per 5 secondi per garantire la
miscelazione
Valutare i risultati
Per tutti i dettagli vedere a pagina 7
31-3157
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