SAPIENZA
UNIVERSITA’ DI ROMA
Facoltà di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali
Corso di Laurea in Fisica
Imaging Vibrazionale Coerente
Relatore
Candidato
Tullio Scopigno
Vittorio Cecconi
Anno Accademico 2012-2013
Introduzione
Si sono confrontate tre tecniche spettroscopiche applicate alla microscopia
• CARS
• SRS
• RIKES
(Coherent anti-Stokes Raman Scattering)
(Stimulted Raman Scattering)
(Raman Inducted Kerr Effect Spectroscopy)
Tutte queste tecniche
nascono dall’ effetto
Raman. La spettroscopia
Raman è una tecnica in cui
si fa incidere una radiazione
elettromagnetica iniziale
nota e viene misurata la
radiazione diffusa tramite
rivelatore
Lo scopo
ricavare una impronta di molecole con la migliore risoluzione
Principi Teorici Raman Spontaneo
L’ effetto Raman è un processo di scattering anelastico
𝑷 = 𝑷(ω𝒍 ) + 𝑷(ω𝒍 − ω𝒌 ) + 𝑷(ω𝒍 + ω𝒌 )
La radiazione può essere diffusa in tre modi: Stokes, anti-Stokes e Rayleigh
Vantaggi:
• chemical selective tool
• sia molecole polari che non-polari possono manifestare Raman
Svantaggi: • segnale debole
• incoerenza
Il Raman spontaneo non adatto nell’ambito della microscopia
CRS
Principi Teorici Raman Coerente
La tecnica CRS può essere considerata un processo a due step:
• set di multiple pulsazioni laser sono centrati a differenti frequenze, la cui
combinazione deve coincidere con quella vibrazionale della molecola
stessa
• un’altra pulsazione laser, chiamata di probe, interagisce con la materiacampione e modula la coerenza vibrazionale generata nel primo step
In CRS almeno due laser
iniziali sono usati chiamati
Pump (ω𝒑 ) e Stokes (ω𝒔 )
(ω𝟏 - ω𝟐 + ω𝟑 ≡ ω𝟒 )
CRS è un processo FWM (Four-Wave Mixing)
Coherent Anti-Stokes Raman Scattering
CARS appartiene ad un processo FWM, costituito da due fotoni, pump e Stokes, i
quali portano alla generazione di un fotone alla frequenza anti-Stokes.
Descrizione Qualitativa
𝜕𝐴𝑎𝑠 (𝑟,𝑡)
𝜕𝑧
= −𝑖 𝛼𝑎𝑠 𝜒
3
𝐿
𝐿
𝑑𝐴𝑎𝑠 𝑟, 𝑡 = − 𝑖 𝛼𝑎𝑠 𝜒
0
𝛥k= 𝑘𝑎𝑠 + 𝑘𝑠 − 2𝑘𝑝
𝐴𝑝 𝐴′𝑠 𝐴𝑝 𝑒 𝑖𝛥𝑘𝑧
3
𝐴𝑝 𝐴′ 𝑠 𝐴𝑝
𝑒 𝑖𝛥𝑘𝑧 𝑑𝑧
0
𝐼𝑎𝑠 𝐿, 𝑡 = 𝛼 2 𝑎𝑠 |𝜒 (3) |2 𝐼𝑝 2 𝐼𝑠 𝐿2 𝑠𝑖𝑛𝑐 2 (𝛥𝑘 𝐿 2)
Non-resonant signals in CARS
Four wave mixing
process: χnr
W
wstokes wpump
Input spectra
wp
wp
ws
W
was
Coherent Anti-Stoke Raman Scattering
(CARS) Tecnica di soppressione NRB
(3)
𝑃𝑥𝑁𝑅 = 3𝜒1111 𝐸𝑝2 𝐸𝑠∗ cos 𝜙
(3)
𝑃𝑦𝑁𝑅 = 3𝜒1221 𝐸𝑝2 𝐸𝑠∗ sin 𝜙
(3)
𝑃𝑥𝑅 = 3𝜒1111 𝐸𝑝2 𝐸𝑠∗ cos 𝜙
(3)
𝑃𝑦𝑅 = 3𝜒1221 𝐸𝑝2 𝐸𝑠∗ sin 𝜙
(𝟑)
𝑷′𝑹 = 𝟑𝜒𝟏𝟏𝟏𝟏 𝑬𝟐𝒑 𝑬∗𝒔 𝒄𝒐𝒔𝜙 𝒔𝒊𝒏𝜗 (𝟏 − 𝜚𝑹 /𝜚𝑵𝑹 )
La microscopia P-CARS soffre di una riduzione del segnale risonante
Coherent Anti-Stoke Raman Scattering
(CARS) Laser-scanning CARS microscope
CARS imaging di tessuti organici ex-vivo in entrambi F-CARS E-CARS
E-CARS
Omentum majus
F-CARS
E-CARS
Bovine retina
Adipocyte-covered kidney
Stimulated Raman Scattering (SRS)
Un’altra tecnica di spettroscopia Raman coerente è lo Stimulated Raman Scattering
(SRS) il quale «probe» la popolazione degli stati eccitati per identificare le molecole
Digitare l'equazione qui.
Amplificazione del fascio Stokes e simultanea attenuazione del pump (SRL) (SRG)
𝛥𝒌 ≡ 𝒌𝒔 +𝒌𝒑 −𝒌𝒑 − 𝒌𝒔 = 𝟎
Phase-mismatch
𝐿
𝑑𝐴𝑠
0
𝑟, 𝑡 =
𝐿
[−
0
SRG= 2 𝛼𝒔 [ 𝜒𝑰𝒎
𝟑 𝑹]
𝑖 𝛼𝑠 𝜒
𝑰𝒑 L
3
𝐴𝑝 𝐴′ 𝑝 𝐴𝑠 ] dz
𝐴𝑠 𝐿, 𝑡 = 𝐴 0, 𝑡 𝑒
−𝑖𝛼𝑠 𝜒 3 |𝐴𝑝 |2 𝐿
SRS/CARS the basic layout
Imaging SRS
Scansione 3-D
Diverse scansioni strati epiderma
stratum corneum (4 𝜇m)
sebaceous gland (42 𝜇m)
CARS vs SRS
Risonanza vibrazionale on-off
Stratum corneum
Imaging
CARS & SRS 𝐻2 𝑂
CARS vs SRS background issue
CARS
SRS
Caenorhabditis elegans
Raman shift set to the lipid band at 2845 𝑐𝑚−1
Raman Induced Kerr Effect (RIKE)
Spectroscopy
Centrale nel processo RIKES è l’ Optical Kerr Effect (OKE) indotto dal processo
Raman all’interno del materiale. Il RIKE cambia la polarizzazione del fascio
dovuta all’effetto della birifrangenza nel campione
La risposta del materiale può essere ricavata dall’espressione della 𝑷(𝟑)
𝑷(𝟑)(𝜔𝟒 ) ∝ 𝜒𝒊𝒋𝒌𝒍 (𝟑) 𝑬𝒋 𝜔𝟏 𝑬𝒌 (𝜔𝟐 ) 𝑬𝒍 (𝜔𝟑 )
In generale ci sono due polarizzazioni usate in questa tecnica spettroscopica
Linear RIKE
Circular RIKE
Raman Induced Kerr Effect (RIKE)
Spectroscopy Linear RIKES
Espressione cartesiana dei fasci pump e Stokes
𝑨𝒑 = 𝑨𝒑 𝒙 + 𝑨𝒑 𝒚
𝑨𝒔 = 𝑨𝒔 𝒙
𝝏𝑨𝒔 𝒚
= −𝐢 𝛼𝒔 𝜒𝒆𝒇𝒇
𝝏𝒛
𝒚
𝟑 𝒍𝒊𝒏𝒆𝒂𝒓
𝟑 𝒍𝒊𝒏𝒆𝒂𝒓 𝒙
𝑨𝒑
𝑨𝒔 𝑳, 𝒕 = −𝒊 𝜶𝒔 𝝌𝒆𝒇𝒇
Digitare l'equazione qui.
′
𝑨𝒑 𝒙 𝑨𝒑 𝒚 𝑨𝒔 𝒙
𝒚 ′
𝑨𝒑 𝑨𝒙𝒔 𝑳
𝛥𝒌 = 𝟎
Raman Induced Kerr Effect (RIKE)
Spectroscopy Circular RIKES
Nella configurazione di Circular RIKE il fascio pump è circolarmente polarizzato
mentre il fascio Stokes è linearmente polarizzato
Rappresentazione cartesiana dei fasci input
𝝏𝑨𝒔 𝒚
= −𝐢 𝛼𝒔 𝜒𝒆𝒇𝒇
𝝏𝒛
𝒚
𝟑 𝒄𝒊𝒓𝒄𝒖𝒍𝒂𝒓
𝟑 𝒄𝒊𝒓𝒄𝒖𝒍𝒂𝒓 𝒙
𝑨𝒑
𝑨𝒔 𝑳, 𝒕 = −𝒊 𝜶𝒔 𝝌𝒆𝒇𝒇
′
𝑨𝒑 𝒙 𝑨𝒑 𝒚 𝑨𝒔 𝒙
𝒚 ′
𝑨𝒑 𝑨𝒙𝒔 𝑳
𝑨𝒑 = 𝑨𝒑 𝒙 + 𝒊𝑨𝒑 𝒚
𝑨𝒔 = 𝑨𝒔 𝒚
Raman Induced Kerr Effect (RIKE)
Spectroscopy Crossed polarizers RIKE
Il più semplice modo per misurare il segnale RIKE è usare due crossed polarizers
𝑰𝑳𝒊𝒏𝒆𝒂𝒓 𝑹𝑰𝑲𝑬 ∝ 𝛼𝒔𝟐 |𝜒
𝑰𝑪𝒊𝒓𝒄𝒖𝒍𝒂𝒓 𝑹𝑰𝑲𝑬 ∝ 𝛼𝒔𝟐 |𝜒
𝟑 𝒍𝒊𝒏𝒆𝒂𝒓 𝟐 𝟐
| 𝑰𝒑 𝑰 𝒔
𝟑 𝒄𝒊𝒓𝒄𝒖𝒍𝒂𝒓 𝟐 𝟐
| 𝑰𝒑 𝑰𝒔
𝑳𝟐
𝑳𝟐
RIKES/SRS Imaging
Polystyrene (PS)
Poly(methylmethacrylate)
(PMMA)
Conclusioni
Imaging Vibrazionale Coerente:
•
•
•
•
LABEL-FREE selettività chimica
Segnale intenso
Capacità 3-D
Facile cambiamento da un setup ad un altro
Future Applicazioni nell’ambito della CRS
Endoscopia