Misurazione e uso di anticorpi
Misurazione delle funzioni dei
linfociti T
Misurazione e uso di Abs
•
•
•
•
•
•
Saggio ELISA
ELISPOT
Cromatografia d’affinità
Western Blotting
Microscopia ad immunofluorescenza
Citometria a flusso
Citometria a flusso
Basi della Citometria a Flusso
Fluidica
• Cellule in sospensione
• passano in singola fila attraverso
• un volume illuminato dove esse
Ottica
• riflettono/rifrattono la luce ed
emettono fluorescenza
• che viene raccolta, filtrata e
• convertita ad un valore digitale
Elettronica
• che viene inviato al computer
Fluorocromi utilizzati più comunemente
Linee
Laser
Comuni
350
300 nm
457 488 514
400 nm
500 nm
610 632
600 nm
700 nm
Coniugato PE-TR
Texas Red
Ioduro di Propidio
Etidio Bromuro
PE (ficoeritrina)
FITC (fluoresceina)
Acido cisParinarico
Schema generale della camera di flusso
di un citofluorimetro
Cella di
Flusso
Iniettore
Fluido di
rivestimento
Granulocito
Segnale di
Fluorescenza
Linfocito
Raggio laser
focalizzato
Monocito
Rilevamento dei parametri fisici
Filtro Dicroico/Specchio a 45 gradi
Sorgente luminosa
Luce Riflessa
Luce trasmessa
Scatter frontale
(Forward Angle Light Scatter, FALS)
Granulocito
Laser
Sensore per il
FALS
Linfocito
Monocito
• Quando viene utilizzata una sorgente
laser, la quantità di luce “scatterata”
nella direzione frontale (ovvero lungo
lo stesso asse attraverso cui viaggia la
luce laser) viene raccolta nel canale del
forward scatter
• L’ intensità del forward scatter è
proporzionale alla dimensione, forma
ed omogeneità ottica delle cellule (o
delle altre particelle analizzate)
Scatter laterale
(90 Degree Light Scatter)
Granulocito
Linfocito
Laser
Sensore FALS
Monocito
Sensore per il 90°LS
• Quando si utilizza una sorgente laser, la
quantità di luce “scatterata”
lateralmente (perpendicolare all’asse
attraverso cui viaggia la luce laser)
viene raccolta nel canale del side
oppure 90°scatter
• Anche l’ intensità del side scatter è
proporzionale alla dimensione, forma
ed omogeneità ottica delle cellule (o
delle altre particelle analizzate)
• Il Forward Scatter tende ad essere più
sensibile alle proprietà della superficie
cellulare delle particelle del Side Scatter
– può essere usato per distinguere cellule
vive da cellule morte
• Il Side Scatter tende ad essere più
sensibie alle inclusioni presenti all’interno
della cellula del forward scatter
– può essere usato per distinguere cellule
granulate da cellule non-granulate
Esempio di analisi dei leucociti e “gating” elettronico
GRANULOCITI
MONOCITI
LINFOCITI
Nuclei di linfociti normali o apoptotici
Complex or Boolean Gating
With two overlapping regions, several
options are available:
R1
R2
Boolean Gating
Region 1 and Region 2:
R2
Espressione di molecole
CD86 (B7.2)
3%
Un-treated
M1
93%
M1
LPS 10 µg/ml
Cecilia 2
(exp. M) - 1 3 febbraio 20 04
D1 : batteri = 1:75
sp in
90 m in. inc ubazione
Borde tella Pertus si s
Borde tella Para-pertus si s
B7.2
MHC II
CD 40
Analisi citofluorimetrica
DC
CD11c+
CD11b+
pDC
FL2-H
CD11c+
CD11b-
Macrophages
CD11cCD11b+
T cells
CD11cCD11b-
B cells
FL1-H
FL1-H : CD11b
FL2-H : CD11c
Analisi del ciclo cellulare
QuickTime™ e un
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…
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apoptosi
analisi al citofluorimetro
singole
Il “sorting” cellulare
488 nm laser
FACS:
Fluorescence
Activated
Cell
Sorting
Cellule singole
separate dentro
diverse provette
FALS Sensor
Fluorescence
detector
-
+
Piastre cariche
elettricamente
Jet-in-Air
Crystal
Electrode
Nozzle
Freq. (Hz)
Laser
Optics
Electronic
Amp. (v)
Jet-in-Air
Electrode
Crystal
Nozzle
Freq. (Hz)
Amp. (v)
Laser
Optics
Electronic
Jet-in-Air
+/- 190 V
Electrode
Crystal
Nozzle
Freq. (Hz)
Amp. (v)
Laser
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Fluorescence
Optics
Electronic
Delay Time
Break-off Point
Jet-in-Air
+
- 3000 V
+
_
_ + 3000 V
Analisi pre-sorter
Macrofagi peritoneali CD11b positivi
Gating
Macrofagi peritoneali CD11b positivi
Sorted
CD11b HIGH sorted
CD11b INT. sorted
Misurazione e uso di Abs
•
•
•
•
•
•
Saggio ELISA
ELISPOT
Cromatografia d’affinità
Western Blotting
Microscopia ad immunofluorescenza
Citometria a flusso
ELISA
•Legame diretto con l’Ag
•Sandwich
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ELISA
sandwich
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ELISPOT
Western blotting
Cromatografia d’affinità
Magnetic sorting
miniMACS
Microscopia ad immunofluorescenza
.
.
.
.
.
.
Immuno Staining (anti-occludina)
COLORAZIONE
polilisina/vetrino
conc. finale di Poli-L. 0,5 mg/ml, in H2O
20 min. RT
2 lavaggi con H2O
asciugare bene
Aspirare il PBS
Permeare, 0,05%TRITON X-100 in PBS, 5 min on
ice.
Washing 3X con PBS
Blocking con 3%BSA in PBS, 15 min RT
Washing 3x con PBS
PREPARZIONE DEI CAMPIONI
Seminare 1,5 x 105 cells/vetrino, in 70 µl di
terreno NO siero
Incubazione, 15 min 37ｰC (incubatore)
Controllare al microscopio
Primary Ab, anti-occludina (rabbit, 1 mg/ml,
ZYMED, cat. N. 71.1500), usare 10 µg/ml finale in
BSA 0,5% in PBS. Centrifugare 3 min a 3000 rpm.
70 µl/vetrino
1 h on ice
Washing 3x con PBS
FISSARE LE CELLS
Aspirare il surnatante
Aggiungere 70 µl di PFA1%, 60 min a 4ｰC
Lavare tre volte con PBS 1X (RT)
A questo passaggio posso conservare i
campioni (in PBS, 4ｰC)
Secondary Ab, a-rabbit, IgG, Cy3-conjugated
(donkey Jackson Cod. n. 711.166.152). Suggested
dilution 1:700, in BSA 0,5% in PBS. Centrifugare 3
min a 3000 rpm. 70 µl/vetrino.
30 min on ice, al buio.
Washing 3x con PBS
Montare il vetrino (coverslip) su portaoggetti usando
5-6 µl di moviol
30 min RT, buio
Vetrino a – 20ｰC.
2
1
Misurazione delle funzioni dei
linfociti T
A differenza della misurazione della risposta
anticorpale umorale, l’immunità mediata
dalle cells T è tecnicamente più difficile da
misurare.
Le cells T non secernono prodotti in grado
di legare l’antigene, per cui non esiste per
questo tipo di risposta nessun semplice
saggio di legame
Studio di funzioni linfocitarie
Le funzioni del linfociti T possono
essere misurate in 3 modi:
1. Uccisione del bersaglio cellulare
2. Attivazione delle cellule APC
3. Produzione di citochine
Metodiche
1. saggio di citotossicità
2. saggio di proliferazione
3. misurazione di citochine
Attività citotossica:
Rilascio di cromo da cellule bersaglio
Proliferazione antigene-specifica delle
cellule T
Misura citochine prodotte:
intracellular staining
Intracellular staining
1- cellule in piastra a concentrazione molto alta
(5x105cells/ml)
8- lavare con 2 ml di PBS-FCS 5%
2- aggiungere Brefaldine (BFA) 10 µg/ml
9- permeare: risospendere le cells in 500 l
PB (PBS+FCS 5%+0.5% saponina). 10 min RT
3- raccogliere le cellule e suddividerle nei tubi
(1-1,5x106cells/ml/sample)
10- aggiungere 1 ml PB e centrifugare 1200
rpm x 5 min
4- blocking: incubare 100 l di PBS-FCS 5%
10 min RT
11- risospendere in 100 l di PB+siero per
blocking (1:25)
5- aggiungere anticorpo di superficie
12- aggiungere anticorpo intracellulare
6- lavare 4 volte con 2 ml PBS-FCS 5%
13- incubare 30 min RT al buio
7- fissare con 500 l/tubo di paraformaldeide
2% e incubare 10 minuti RT
14- lavare 2 volte con PB
15- lavare 2 volte con PBS-FCS 5%
Misura citochine prodotte:
cytokine capture
CFSE
5- or 6-(N-Succiimidyloxycarbonyl)-3',6'-O,O'-diacethylfluorescein
CFSE is cell membrane permeable and readily accumulates inside of viable cells
where
it covalently attaches to intracellular proteins. Hydrolyzed CFSE emits
fluorescence and
covalently-attached fluorescein molecules seldom leak from cells.
CFSE-labeled cells can be monitored over several weeks in vivo.
Therefore, CFSE is utilized for viable cell detection as well as for the long-term
observation
of cell activities by fluorescent microscopy. The excitation and emission
wavelengths of
CFSE-labeled cells are 500 nm and 520 nm, respectively.
Qui ckTime™ e un
decompressore TIFF (Non compresso)
sono ne cessari per visuali zzare quest'immag ine.
T cell proliferation
CFSE staining
QuickTime™ e un
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sono necessari per visualizzare quest'immagine.
Allogeneic CD8 T cell proliferation
CD8
No DCs
WT
IL-2-/-
CFSE
48 h
72 h
FSC