Generalmente si assume che l’area sottesa da ciascun picco sia proporzionale
alla quantità dell’analita corrispondente che è stato eluito
L’area del picco può essere calcolata
misurandone l’altezza (hp) e la sua
larghezza a metà dell’altezza (whA).
Il prodotto di queste due dimensioni si
assume essere pari all’area del picco.
In alternativa, si può ritagliare il picco
dalla carta del registratore e pesarlo,
assumendo che area e peso
siano linearmente correlati.
I calcoli sono più efficacemente
eseguiti da integratori appositi
Matrici utilizzate
SUPPORTO INERTE PER LA
FASE STAZIONARIA
Agarosio Polisaccaride cosituito da residui alternati di D-galattosio e 3,6-anidro-Lgalattosio. Disponibile commercialmente come Sepharose, Superose, Bio-Gel A
Limiti di esclusione 10-40000 kDa
Cellulosa Polimero di unita’ glucosidiche unite da legami -1,4 (legami crociati
tramite epicloridrina)
Destrano Polimero di residui di glucosio uniti da legami -1,6. E’ presente in
commercio con il nome di Sephadex (legami crociati tramite epicloridrina). Limiti di
esclusione 0.7-800 kDa. Il Sephacryl e’ costituito da destrano che forma legami crociati
con N,N’-metilene bisacrilammide. Limiti di esclusione 1-8000 kDa. Il Superdex e’ un gel
composito costituito da destrano covalentemente legato ad agarosio.
Poliacrilammide Polimero di acrilammide e N,N’-metilenbisacrilammide. Disponibile
in commercio come Bio-Gel P, limiti di esclusione tra 0.2 e 400 kDa
Polistirene Polimero di stirene legato con divinilbenzene
Silice Polimero prodotto a partire dall’ acido ortosilicico. I molti gruppi silanolo (SiOH) rendono la matrice altamente idrofilica
IMPACCAMENTO DELLA FASE
STAZIONARIA IN COLONNA
Viene di norma eseguito introducendo con delicatezza in colonna (avendo cura di
tenere chiusa l’uscita) una sospensione della fase stazionaria nella fase mobile
 Nel corso dell’impaccamento è necessario agitare la parte superiore della sospensione
e/o tappare la colonna per assicurare che non rimangano bolle d’aria nella fase
stazionaria
 La sospensione di fase stazionaria è versata in colonna fino a quando non viene
raggiunta l’altezza desiderata
 A tal punto la colonna è messa in flusso con fase mobile aprendone l’uscita sino a
completo impaccamento
 E’ opportuno posizionare sulla superficie della colonna un dispositivo di protezione
adeguato, come un filtro di carta o una garza di nylon
 Nessuna parte della colonna deve essere lasciata andare a secco
 Un impaccamento insufficiente produce un flusso irregolare in colonna (channeling) ed
una minore risoluzione
CARICAMENTO DEL CAMPIONE
 Si rimuove dalla superficie della resina la maggior parte della fase mobile, aspirandola,
e facendo flussare il rimanente in colonna. Il campione è poi applicato con una pipetta
e fatto entrare in colonna. Un volume minimo di fase mobile serve infine a lavare le
pareti della colonna dall’eventuale residuo di campione rimasto. Un volume più cospicuo
di fase mobile è stratificato sulla superficie della colonna.
 In alternativa, la densità del campione può essere incrementata aggiungendovi
saccarosio in concentrazione 1% circa. Quando questa soluzione è stratificata sul liquido
che ricopre il letto della colonna, automaticamente si disporrà sul fondo ed entrerà
rapidamente in colonna. La metodica è valida solo se il saccarosio non interferisce con la
successiva separazione ed analisi del campione.
 Un terzo metodo prevede l’utilizzo di un tubo capillare e/o una siringa, oppure una
pompa peristaltica per portare direttamente il campione sulla superficie della colonna.
SVILUPPO DELLA COLONNA
I componenti contenuti nel campione caricato sono separati l’uno dall’altro
dal passaggio del solvente (fase mobile) nella colonna.
E’ fondamentale che l’eluizione avvenga a velocità costante, ciò che è
facilmente raggiunto eluendo per gravità.
POMPE PERISTALTICHE
Le pompe più comuni utilizzano tubi di silicone, polivinilcloruro o fluoruro che,
compressi a velocità costante da un disco rotante, rilasciano la fase mobile con
la velocità di flusso desiderata.
Le pompe ed i tubi, di diametro noto, devono essere preventivamente tarati per
determinare la velocità di flusso.
ELUIZIONE ISOCRATICA
Sviluppo della colonna con
l’utilizzo di un solo solvente
ELUIZIONE IN GRADIENTE
Si operano variazioni continue di pH, concentrazione
o polarità
SISTEMI DI RIVELAZIONE
La rivelazione può basarsi sull’assorbimento nella zona dell’ultravioletto, sulla
spettroscopia a fluorescenza, su variazioni dell’indice di rifrazione,
sull’emissione di radioattività.
I sistemi di rivelazione più comuni registrano l’assorbimento di luce
nell’ultravioletto. Gli strumenti migliori rivelano le proteine nell’intervallo 190 –
220 nm e 260 – 280 nm.
RACCOGLITORI DI FRAZIONI
Funzionano in modo tale da riempire ogni provetta con una certa quantità di
eluato, prima di passare automaticamente a quella successiva.
La quantità di eluato raccolta in ogni provetta può essere regolata in vario
modo.
Si può utilizzare un sistema di sifoni che convoglia un determinato volume,
oppure un dispositivo elettronico che controlla il numero di gocce di eluato
che cadono nella provetta.
Una possibilità ulteriore di raccolta è quella ad intervalli fissi di tempo.
Se varia la composizione
dell’eluato, varia anche la
tensione superficiale e la
dimensione delle goccioline
Se varia la velocità di flusso
in colonna, varia anche il volume
delle frazioni; in realtà ciò si
verifica di rado e quindi i
raccoglitori a tempo fisso sono i
più utilizzati
CROMATOGRAFIA
Gel-filtrazione
Scambio ionico
Affinità
Fase inversa
FASE STAZIONARIA
solida-porosa
FASE MOBILE
liquida
solidagruppi carichi
liquida
solidaligando immobilizzato
liquida
liquida
liquida/
gassosa

Consente la separazione di molecole in base alle loro dimensioni
 Il termine gel filtrazione è, infatti, impiegato per descrivere la separazione di
molecole di dimensioni diverse utilizzando gel (composti organici polimerici che
possiedono una rete tridimensionale di pori che conferisce loro le proprietà di
un gel)
 FASE STAZIONARIA
FASE MOBILE
solida – porosa
liquida
 Nessuna
interazione chimica tra le particelle di resina e le proteine
 Le particelle di resina fungono da setacci molecolari
SI DISTRIBUIRANNO TRA LA FASE MOBILE
ALL’INTERNO ED ALL’ESTERNO DEL SETACCIO
MOLECOLARE E TRANSITERANNO IN COLONNA
CON UNA VELOCITA’ INFERIORE
SARANNO COMPLETAMENTE ESCLUSE
DAI PORI E QUINDI PASSERANNO ATTRAVERSO GLI
SPAZI INTERSTIZIALI E COMPARIRANNO
PER PRIME NELL’ELUATO
Concentrazione proteica totale
Attività Specifica
N° della frazione
(o volume dell’eluato)
 Se una molecola di analita è grande e perciò completamente esclusa dalla fase
mobile presente all’interno del gel, il suo Kd è pari a 0, mentre se l’analita è
sufficientemente piccolo da avere completo accesso alla fase mobile interna, il suo
Kd è pari a 1
 A causa della variabilità delle dimensioni dei pori tra le particelle di gel, solo una
parte della fase mobile interna sarà accessibile agli analiti di dimensioni intermedie;
quindi i loro valori di Kd variano tra 0 e 1
 Ciò rende possibile la separazione su un determinato gel di analiti in un intervallo di
dimensioni estremamente ristretto
Nome commerciale
Sephadex
Bio-Gel
Sepharose
Polimero
Intervallo di
frazionamento (kDa)
G-10
Destrano
0.05 - 0.7
G-25
Destrano
1-5
G-50
Destrano
1 - 30
G-100
Destrano
4 - 150
G-200
Destrano
5 - 600
P-2
Poliacrilammide
0.1 - 1.8
P-6
Poliacrilammide
1-6
P-10
Poliacrilammide
1.5 - 20
P-30
Poliacrilammide
2.4 - 40
P-100
Poliacrilammide
5 - 100
P-300
Poliacrilammide
60 - 400
6B
Agarosio
10 - 4000
4B
Agarosio
60 - 20000
2B
Agarosio
70 - 40000
logPM
Volume di eluizione
 Le colonne Sephadex G-25 possono essere utilizzate per dissalare
soluzioni di composti ad alto peso molecolare
 Le sostanze ad alto peso molecolare sono escluse dai pori, mentre
i composti a basso peso molecolare si muovono lentamente
 Tale metodo è adoperato per allontanare l’ammonio solfato da
preparazioni proteiche ed i sali dai campioni eluiti dopo
cromatografia a scambio ionico
VANTAGGI
• Semplice nell’esecuzione
• Prevedibile
• Eluizione nel tampone di partenza
SVANTAGGI
• Bassa capacità (piccoli volumi, 1/40
del volume della colonna)
• Sovrapposizione dei picchi
• Diluizione del campione
Cellule di E. coli contenenti la RNasi A
Lisi mediante ultrasuoni
(sonicazione)
Omogenato cellulare
Centrifugazione
(eliminazione detriti cellulari)
Sopranatante dell’omogenato cellulare
contenente la RNasi A
Sopranatante dell’omogenato cellulare
Cromatografia per gel filtrazione
Resina SEPHADEX G-75
capacità di separazione 5-70 KDa
Destrano: polimero di residui di glucosio uniti da legami -1,6
che presenta legami crociati con epicloridrina.
Limiti di esclusione 0.7-800 kDa.
Pompa
peristaltica
Colonna
Collettore di frazioni
CONDIZIONI SPERIMENTALI
Volume della resina: 12 ml
Soluzione tampone: Tris-Acetato 0,1 M, pH 8,4, contenente NaCl 0,3 M
Campione di carico (miscela di 4 proteine):
1. RNasi A (PM = 13.7 kDa)
2. -amilasi (PM = 50 kDa)
3. Emoglobina da plasma bovino (PM = 64 kDa) (4 subunità da 16 kDa)
4. Albumina da siero bovino (PM = 69 kDa)
Volume del campione di carico = 0,3 ml
Volume delle frazioni = 0,4 ml
Determinazione dell’assorbanza nell’ultravioletto (λ = 278 nm)
di tutte le frazioni ottenute
Riportando in grafico i valori di assorbanza in funzione del
numero delle frazioni (o del volume eluito) si ottiene il
cromatogramma
Cromatogramma gruppo PLR
Assorbanza a 278 nm
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
1
3
5
7
9
11
13
15
17
19
21
23
25
27
N° frazioni
Cromatogramma Gaito-Pennacchio -Procentese
Assorbanza a 278 nm
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
-0,1
0
5
10
15
N° frazioni
20
25
30
35
Cromatogramma Capuano
Assorbanza a 278 nm
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
1
3
5
7
9
11
13
15
17
19
20
21
23
25
27
29
31
33
-0,1
N° frazioni
Cromatogramma C.L.
Assorbanza a 278 nm
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
-0,2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29
N° frazioni
Assorbanza a 278 nm
Cromatogramma Corsini
De Marco Fabrizio
1,5
1,3
1,1
0,9
0,7
0,5
0,3
0,1
-0,1
0
5
10
15
20
N° frazioni
25
30
35