Cromatografia
Tecniche cromatografiche
• Basate sulla ripartizione
• Basate sull’adsorbimento
Metodi di ripartizione

S A
KR 
S B
[S]B = 0.91
[S]
[S]AA==0.09
1
0.09
KR 
 0.1
0.91
EQUILIBRIO
FASE MOBILE
A
A
FASE STAZIONARIA
EQUILIBRIO
FASE MOBILE
A
A
FASE STAZIONARIA
EQUILIBRIO
FASE MOBILE
S
S
S
S
FASE STAZIONARIA
100
50
25
12.5
6
50
50
37.5
25
25
37.5
38
12.5
25
6
100
10
1
0
0
90
18
2.7
0
81
24
5
73
29
66
100
90
81
73
66
10
18
24
29
1
3
5
0
0
0
100
30
Concentrazione
25
20
15
10
5
0
0
2
4
6
Segmento di colonna
8
10
30
25
Concentrazione
20
15
10
5
0
0
20
40
60
Segmento di colonna
80
100
Cromatografia su colonna
Volume di ritenzione
VR  t R  FC  VM  K R VS
Rapporto di ripartizione
C S  VS
VS
k'
 KR
C M  VM
VM
β
VR  VM t R  t M
k'

VM
tM
30
25
Concentrazione
20
15
10
5
0
0
20
40
60
tempo di ritenzione
Per una specie non ritenuta: VR = VM e k’ = 1
80
100
Risoluzione
2  (t R 2  t R1 )
RS 
w1  w2
A metà altezza: wh = 1.1775 w
Risoluzione
Piatti teorici e larghezza dei picchi,
capacità di picchi
 tR 
N  16  

 2 w 
2
2  tR
w
N
30
25
Concentrazione
20
V
N
n  1
 ln
16 V
15
10
5
0
0
20
40
60
80
100
120
tempo di ritenzione
140
160
180
200
Cromatografia su carta
Tipi di matrici utilizzate
•
Agarosio Polisaccaride derivante da particolari alghe rosse cosituito
da residui alternati di D-galattoso e 3,6-anidro-L-galattoso. Disponibile
commercialmente come Sepharose, Sepharose CL (cross-linking con
2,3-dibromopropanolo), Superose, Bio-Gel A. Limiti di esclusione 1040000 kD.
•
Cellulosa Polimero di unità glucosidiche unite da legami -1,4.
Tramite epicloridrina vengono ottenuti i legami crociati essenziali per
l’utilizzo come matrice in cromatografia, il numero dei quali determina la
dimensione dei pori.
•
Destrano Polimero di residui di glucosio uniti da legami -1,6 prodotto
dal batterio Leuconostoc mesenteroides. In commercio con il nome di
Sephadex. La porosità dei gel a base di destrano è controllata dalla
massa molecolare del destrano usato e dall’ introduzione di legami
crociati ottenuti con epicloridrina. Limiti di esclusione 0.7-800 kD.
Il Sephacryl è destrano con legami crociati ottenuti con N,N’-metilene
bisacrilamide. Limiti di esclusione 1-8000 kD. Il Superdex e’ un gel
composito costituito da destrano covalentemente legato ad agarosio.
Formazione della matrice
O
OH
OH
O
CH2OH
O
O
OH
OH
O
O
O
O
O
OH
OH
Sephadex®
O
OH
O
HO
OH
HN
O
OH
OH
OH
O
OH
OH
O
OH
OH
O
OH
O
O
O
O
O
O
OH
O
O
OH
O
O
OH
O
O
OH
O
O
O
O
O
O
O
OH
O
O
OH
OH
n
Sephacryl®
O
O
OH
HN
OH
OH
OH
OH
OH
OH
O
O
C
H2
C
H2
OH
OH
NH
O
O
OH
O
O
O
HO
Agarosio
HN
OH
Tipi di matrici utilizzate
•
Poliacrilamide: Polimero di acrilamide e N,N’-metilenbisacrilamide
(quest’ultimo determina la formazione di legami crociati). E’ disponibile
in commercio come Bio-GelP, con limiti di esclusione tra 0.2 e 400 kD.
•
Polistirene Polimero di stirene legato con divinilbenzene.
•
Silice Polimero prodotto a partire dall’ acido ortosilicico. I molti gruppi
silanolo (Si-OH) rendono la matrice altamente idrofilica. Il loro eccesso
può essere eliminato derivatizzando con triclorometilsilano.
Colonne