Prof. Giorgio Sartor
Metabolismo dei
nucleotidi
1:
2:
3:
4:
5:
6:
7:
introduzione
biosintesi de-novo delle purine
biosintesi de-novo delle pirimidine
catabolismo delle purine
catabolismo delle pirimidine
sintesi deossiribonucleotidi
regolazione della sintesi deossiribonucleotidi
Copyright
© 2001-2013
by Giorgio Sartor.
V.0.2 © gsartor
2001-2013
All rights reserved.
Metabolismo dei nucleotidi
N01 - Versione 0.2 – may 2013
-1
A cosa servono i nucleotidi
• Informazione:
– Acidi nucleici: RNA e DNA (NMP; dNMP  NTP; dNTP)
• Sintesi proteica e regolazione:
– Acidi nucleici: mRNA, tRNA, smRNA…
• Trasporto di energia:
– ATP (GTP), ADP, AMP
• Metabolismo:
– UTP, ATP
• Segnali intracellulari:
– cAMP, cGMP
• Trasporto di equivalenti ridotti:
– NAD+/NADH, NADP+/NADPH, FAD/FADH2
• Trasporto di acili:
– CoA
• …
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Metabolismo dei nucleotidi
-2
Le basi azotate
• PURINE
• PIRIMIDINE
– Adenina
– Guanina
– Uridina
– Ciditina
– Timidina
– Inosina
– Xantina
– Orotidina
N
N
N
V.0.2 © gsartor 2001-2013
N
N
H
N
Metabolismo dei nucleotidi
-3
Le basi azotate
• PURINE
• PIRIMIDINE
– Adenina
– Guanina
– Uridina
– Ciditina
– Timidina
– Inosina
– Xantina
– Orotidina
N
N
N
V.0.2 © gsartor 2001-2013
N
N
H
N
Metabolismo dei nucleotidi
-4
Nucleotidi purinici
• Adenosinmonofosfato (AMP)
• Guanosinmonofostato (GMP)
NH2
N
N
N
OPO3-O
• Inosinmonofosfato (IMP)
• Xantinamonofosfato (XMP)
HN
N
N
OPO3-O
OH
HO
O
O
N
IMP
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HN
O
N
H
OPO3-O
N
HN
N
H2 N
N
OPO3-O
OH
HO
AMP
OH
HO
O
N
HO
N
N
GMP
OH
XMP
Metabolismo dei nucleotidi
-5
Nucleotidi pirimidinici
O
O
UMP
HN
O
OPO3-O
HO
CH3
HN
O
OPO3-O
N
OH
HO
N
TMP
OH
• Uridinmonofosfato (UMP)
• Timidinmonofosfato (TMP)
• Ciditinmonofosfato (CMP)
• Orotidinmonofosfato (OMP)
NH2
CMP
O
OPO3O
HO
O
N
OMP
N
O
OPO3-O
O
N
O
OH
HO
V.0.2 © gsartor 2001-2013
HN
Metabolismo dei nucleotidi
OH
-6
Metabolismo delle Purine
V.0.2 © gsartor 2001-2013
Metabolismo dei nucleotidi
-7
Metabolismo delle Pirimidine
V.0.2 © gsartor 2001-2013
Metabolismo dei nucleotidi
-8
Sintesi de-novo
• Quasi tutti gli organismi sintetizzano
nucleotidi da zero:
Aminoacidi, CO2, N10-formil-THF, ATP, Ribosio
BIOSINTESI
NUCLEOTIDI
Acidi Nucleici
Coenzimi
DEGRADAZIONE
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Basi azotate
Ribosio
Metabolismo dei nucleotidi
ENERGIA
-9
Chi sintetizza nucleotidi de-novo
• Tutte le cellule che proliferano!
– Linfociti
– Batteri
– Tumori
–…
• Le vie metaboliche di sintesi de-novo
dei nucleotidi sono il bersaglio di
farmaci antibatterici e antitumorali.
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Metabolismo dei nucleotidi
- 10
Sintesi de-novo
• Diversa strategia:
– Nucleotidi purinici
• La sintesi de-novo dei nucleotidi purinici
avviene attraverso la costruzione dell’anello
purinico sul ribosio-5-P per formare
INOSINA MONO FOSFATO (IMP);
– Nucleotidi pirimidinici
• La sintesi de-novo dei nucleotidi pirimidinici
avviene attraverso la sintesi di una purina
(OROTATO) e, quindi, legame al ribosio-5-P
con conversione in URIDIN MONO FOSFATO
(UMP)
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Metabolismo dei nucleotidi
- 11
a-riboso-5-fosfato
O
O
O
P O
O
V.0.2 © gsartor 2001-2013
HO
Metabolismo dei nucleotidi
OH
OH
- 12
Via dei pentosi fosfati
• A secondo dei bisogni della cellula la
via dei pentosi fosfati opera in vari
modi per massimizzare la
concentrazione dei diversi prodotti:
• riboso-5-fosfato, NADPH, e ATP,
V.0.2 © gsartor 2001-2013
Metabolismo dei nucleotidi
- 13
V.0.2 © gsartor 2001-2013
Metabolismo dei nucleotidi
- 14
V.0.2 © gsartor 2001-2013
Metabolismo dei nucleotidi
- 15
Sintesi di riboso-5-P e
NADPH
-D-Glucoso-6-fosfato
a-D-Glucoso-6-fosfato
O
O
O
P
O
O
O
O
HO
NADPH
P
O
O
O
OH
HO
OH
6-fosfo-D-glucono-1,5-lattone
HO
• Duplicazione
cellulare.
NADP+
P
O
O
– Il ribuloso-5-fosfato
viene convertito in
riboso-5-fosfato,
necessario per la
sintesi di nucleotidi e
acidi nucleici.
D-ribuloso-5-fosfato
O
P
O
O
O
Ribuloso-fosfato
3-epimerasi
(EC 5.1.3.1)
OH
P
P
Riboso-5-fosfato
isomerasi
(EC 5.3.1.6)
O
O
O
O
HO
HO
P O
O
O
O
O
+
OH
HO
OH
O
– Viene anche prodotto
del NADPH.
OH
OH
Transchetolasi
(EC 2.2.1.1)
H
HO
OH
D-riboso-5-fosfato
OH
OH
O
CO2
NADPH
OH
OH
6-fosfo-D-gluconato
O +
NADP
O
OH
OH
HO
O
O
OH
O
Fosfogluconato
deidrogenasi
(EC 1.1.1.44)
O
O
O
6-fosfogluconolattonasi
(EC 3.1.1.31)
O
D-xiluloso-5-fosfato
O
O
HO
OH
Glucoso-6-fosfato
deidrogenasi
HO
OH
(EC 1.1.1.49)
HO
Glucoso-6-fosfato
isomerasi
(EC 5.3.1.9)
O
O
O
P
O
D-sedoeptuloso-7-fosfato
OH
O
OH
O
D-gliceraldeide-3-fosfato
O
P
O
O
Transaldolasi
(EC 2.2.1.2)
O
H
Transchetolasi
(EC 2.2.1.1)
OH
O
O
P
O
+
OH
Metabolismo dei nucleotidi
O
O
O
O
OH
O
D-gliceraldeide3-fosfato
V.0.2 © gsartor 2001-2013
O
O
P
O
OH
OH
O
HO
D-fruttoso-6-fosfato
OH
P
O
O
D-eritroso-4-fosfato
- 16
Prof. Giorgio Sartor
Metabolismo dei
nucleotidi
2: biosintesi de-novo delle purine
V.0.2 © gsartor 2001-2013
Metabolismo dei nucleotidi
- 17
BIOSINTESI delle PURINE
NH2
N
N
O
P
O
N
O
O
O
HN
N
O H N
2
P
O
O
N
O
O
N
O
OH
HO
AMP
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N
OH
HO
GMP
Metabolismo dei nucleotidi
- 18
Purine
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Metabolismo dei nucleotidi
- 19
Purine
V.0.2 © gsartor 2001-2013
Metabolismo dei nucleotidi
- 20
Metabolismo purinico
• I nucleotidi purinici sono sintetizzati sia a partire da
precursori più semplici attraverso la biosintesi denovo, sia mediante il riutilizzo delle basi azotate e
dei nucleosidi attraverso le vie di recupero.
• L’IMP gioca un ruolo centrale nel metabolismo
purinico in quanto è sia il prodotto della biosintesi
de-novo che un intermedio metabolico necessario
alla sintesi dell’AMP e del GMP.
• Un altro substrato chiave è il aPRPP che è coinvolto
sia nelle prime tappe della biosintesi de-novo, sia
nelle vie di recupero delle basi puriniche.
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Metabolismo dei nucleotidi
- 21
Metabolismo purinico
• La biosintesi de-novo delle purine avviene
principalmente nel fegato;
• altri tessuti, nei quali la biosintesi de-novo è
meno rappresentata (cervello) o del tutto assente
(globuli rossi), dipendono dal fegato per fabbisogno
di purine e si riforniscono di nucleotidi purinici
attraverso le vie di recupero;
• il globulo rosso svolge un ruolo importante in
questo processo in quanto incorpora le purine nel
fegato e le cede agli altri tessuti.
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Metabolismo dei nucleotidi
- 22
Biosintesi dei nucleotidi purinici
• La sintesi dei nucleotidi purinici (AMP e GMP)
avviene attraverso la sintesi dell’intermedio
comune
• IMP – inosinmonofosfato
O
N
HN
N
O
P
O
OH
N
O
O
P
N
O
O
O
HO
V.0.2 © gsartor 2001-2013
N
O
O
O
N
N
OH
Metabolismo dei nucleotidi
HO
OH
- 23
Biosintesi dei nucleotidi purinici
IMP
O
N
HN
O
P
O
N
O
O
N
O
HO
OH
NH2
N
N
O
AMP
P
O
N
O
O
O
N
O H N
2
P
O
O
N
O
O
N
GMP
O
HO
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N
HN
OH
HO
Metabolismo dei nucleotidi
OH
- 24
Biosintesi del nucleo purinico
H
CO2
H
O
O
NH2
Aspartato
Glicina
6
1
N
N7
5
8
N10-Formil-THF
O
NH2
O
OH
O
H
2
N
4
N
N10-Formil-THF
9
3
R5P
O
H
O
H2N
O
Glutamina
NH2
V.0.2 © gsartor 2001-2013
Metabolismo dei nucleotidi
- 25
Biosintesi IMP
• Undici reazioni
– Tre reazioni per convertire il riboso-5-P a fosforibosil
glicinamide (GAR). L’azoto proviene da Gln. Si usano tre
molecole di ATP: una per formare aPRPP (ad AMP), una
per attivare la Gln e una per attivare la Gly;
– Quattro reazioni per la costruzione dell’anello a cinque
termini aminoimidazolo carbossilato (FGAR, FGAM, AIR,
CAIR) usando 10N-Formil-THF, Gln, CO2. Si usano due
molecole di ATP: una per usare la Gln e una per
chiudere l’anello;
– Quattro reazioni per la chiusura dell’anello purinico
dell’IMP (SAICAR, AICAR, FAICAR) usando, Asp, 10NFormil-THF e una molecola di ATP per usare Asp.
• Si consumano sette legami P~O~P
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Metabolismo dei nucleotidi
- 26
Tetraidrofolato (THF)
• La sintesi avviene attraverso la cessione
di unità monocarboniose veicolate dal
tetraidrofolato (THF).
H
N
H2N
N
H
N
5
N
O
R"
10
N
H
N
R'
O
V.0.2 © gsartor 2001-2013
O
Metabolismo dei nucleotidi
O
OH
OH
n
- 27
Tetraidrofolato (THF)
• La sintesi avviene attraverso la cessione
di unità monocarboniose veicolate dal
tetraidrofolato (THF).
H
N
H2N
N
H
N
R"
10
N
5
N
O
R'
O
H
N
R=
O
V.0.2 © gsartor 2001-2013
R
Metabolismo dei nucleotidi
O
OH
OH
- 28
n
Sintesi del THF
Folato
H
N
H2N
N
N
N
Diidrofolato
NADPH +
H
H
N
H
NADP+
H+
H
N
H2N
N
R
O
N
H
H
H
N
N
R
O
NADPH + H+
EC 1.5.1.3
Diidrofolato reduttasi
NADP+
H
H
N
H2 N
N
N
N
O
H
H
H
N
H
R
H
Tetraidrofolato THF
V.0.2 © gsartor 2001-2013
Metabolismo dei nucleotidi
- 29
H
N
H2 N
N
O
NAPD+
N
H
CH3
Omocys
H
N
Met
H
N
H
H
N
H
H
N
H2 N
N
R
Ser
N
R
N
H
O
H
N
H
R
Formiato + ATP
His
Formil Glu
Gly + NAD+
ADP + Pi
Formimmino
Glu
NADH + H+
CO2 + NH4+
Glu
Glu
N
O
H
H
N
H
H
N
Gly
NADPH + H+
H2 N
H
H
N
H
H
H
N
H
H
N
H2 N
N
N
O
H
N
H
H2 N
R
N
N
O
HN
NAPD+
H
H
N
H
H
N
ATP
O
H
N
H
H2O
H2 N
R
H
N
H
H
N
H
O
N
H
N
H
R
N
O
NH4+
NADPH + H+
H
N
H2 N
H
N
N
O
V.0.2 © gsartor 2001-2013
H
H
N
H
ADP
+ Pi
N
R
Metabolismo dei nucleotidi
- 30
H
N
H2 N
N
H2 N
H
H
N
H
O
N
H
CH3
H
N
H
H
N
H
H
N
H
H
N
H
H
N
H2 N
N
R
N
H
O
H
N
H
R
H
N
N
O
N
R
H
H
N
H
H
N
H2 N
N
N
O
H
N
H
HN
H2 N
R
H
H
N
H
H
N
N
N
O
O
H
N
H
H2 N
R
H
N
H
H
N
H
O
N
H
N
H
R
N
O
H
N
H2 N
H
N
N
O
V.0.2 © gsartor 2001-2013
H
H
N
H
N
R
Metabolismo dei nucleotidi
- 31
H
N
H2 N
H
H
N
H
N5-metil-THFH
N
H2 N
O
N
H
CH3
H
N
H
H
N
H
N
H
N
H2 N
N
R
H
H
N
H
THF
N
O
H
H
N
H
Metanolo
N.O. -2
R
Formaldeide
N.O. 0
H
N5,N10N
-metilene-THF
N
O
N
R
H2 N
H
H
N
H
H
N
H
N5-formimmino-THF
N
N
N
R
H
O
HN
H2 N
H
H
N
H
H
N
H
NN5-formil-THF
N
N
R
H
O
O
H2 N
H
N
H
H
N
H
N10N-formil-THF
O
N
H
H
R
N
O
H2 N
H
N
H
H
N
H
Formiato
N.O. +2
H
N5,N10N-metenil-THF
N
O
V.0.2 © gsartor 2001-2013
N
R
Metabolismo dei nucleotidi
- 32
N10-formil-THF
H
N
H2N
N
H
N
5
O
N
H
O
H
10
N
H
N
O
V.0.2 © gsartor 2001-2013
O
Metabolismo dei nucleotidi
O
OH
OH
n
- 33
Folato
• Il folato è necessario per la sintesi, la
riparazione e la metilazione degli
acidi nucleici
• I mammiferi non possono
sintetizzare folato de-novo;
• I batteri sono sensibili agli inbitori
della sintesi del folato (Sulfonamidi);
V.0.2 © gsartor 2001-2013
Metabolismo dei nucleotidi
- 34
Biosintesi del folato
http://www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?ko00790
V.0.2 © gsartor 2001-2013
Metabolismo dei nucleotidi
- 35
Pool del folato
http://www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway?ko00670
V.0.2 © gsartor 2001-2013
Metabolismo dei nucleotidi
- 36
Costruzione dell’IMP
Fosforibosilamina
GAR
FGAR
H
N
NH2
NH2
O
R5P
O
O
N
O
H2N
NH
N
R5P
CAIR
V.0.2 © gsartor 2001-2013
HN
H2N
NH
N
R5P
AICAR
N
H
N
R5P
FAICAR
Metabolismo dei nucleotidi
N
R5P
O
N
NH2
O
H2N
R5P
O
N
NH2
N
O
R5P
R5P
AIR
H
N
O
NH
O
FGAM
N
NH
N
N
R5P
IMP
- 37
Tre reazioni per convertire il Riboso-5-P a fosforibosilglicinamide
(GAR)
EC 2.7.6.1
Riboso-fosfato difosfokinasi
AMP
ATP
OPO3-
OPO3O
1
OH
O
OH
HO
O
O
H2 N
O
HO
O
P
O
NH3+
NH2
NH
EC 6.3.4.13
Fosforibosilamina
-glicina ligasi
OH
Fosforibosilglicinamide
(GAR)
P
O
O
EC 2.4.2.14
amidofosforibosiltransferasi
O
O
2
3
O
O
Fosforibosilpirofosfato
(aPRPP)
OH
HO
O
O
Gln + H2O
OPO3-
O
O
HO
O
ADP + Pi
O
O
OPO3-
NH2
NH2
O
NH3+
Glu + PPi
OH
Fosforibosil--amina
Gly + ATP
V.0.2 © gsartor 2001-2013
Metabolismo dei nucleotidi
- 38
Tre reazioni per convertire il Riboso-5-P a fosforibosilglicinamide
(GAR)
EC 2.7.6.1
Riboso-fosfato difosfochinasi
AMP
ATP
OPO3-
OPO3O
1
OH
O
OH
HO
O
O
H2 N
O
HO
O
P
O
NH2
NH
NH3+
EC 6.3.4.13
Fosforibosilamina
-glicina ligasi
OH
Fosforibosilglicinamide
(GAR)
P
O
O
LIMITANTE
EC 2.4.2.14
amidofosforibosiltransferasi
O
O
2
3
O
O
Fosforibosilpirofosfato
(aPRPP)
OH
HO
O
O
Gln + H2O
OPO3-
O
O
HO
O
ADP + Pi
O
O
OPO3-
NH2
NH2
O
NH3+
Glu + PPi
OH
Fosforibosil--amina
Gly + ATP
V.0.2 © gsartor 2001-2013
Metabolismo dei nucleotidi
- 39
Controllo
• Il prodotto fosforibolipirofosfato (aPRPP) è
il prodotto limitante;
• Il pirofosfato che si forma viene convertito
in due ioni fosfato;
• Nella formazione della ribosilamina vi è
inversione della configurazione di C1 del
ribosio che passa da a a ;
• La configurazione  di C1 viene mantenuta
in tutti i nucleotidi.
V.0.2 © gsartor 2001-2013
Metabolismo dei nucleotidi
- 40
1. Riboso-fosfato difosfochinasi (EC 2.7.6.1)
ATP
OPO3O
HO
AMP
OH
OH
O
OPO3O
HO
O
OH
P
O
O
O
P
O
O
Fosforibosilpirofosfato
(aPRPP)
• È presente sia come
esamero (B. subtilis)
che come tetramero
(Methanocaldococcus
jannaschii, 1U9Z)
V.0.2 © gsartor 2001-2013
Metabolismo dei nucleotidi
1U9Z
- 41
2. Amidofosforibosiltransferasi (EC 2.4.2.14)
•
•
•
•
La sintesi dei nucleotidi purinici è regolata, in
parte, dai prodotti finali attraverso l’inibizione di
amidofosforibosiltransferasi.
Lo studio della struttura ternaria del complesso
Enzima:ADP:GMP ha determinato che:
ADP si lega nel sito allosterico A
GMP si lega al sito catalitico e il legame di GMP
aumenta l’affinità per ADP al sito A di venti
volte
O
OPO3O
O
P
O
O
P
O
O
Fosforibosilpirofosfato
(aPRPP)
OH
HO
O
O
H2 N
Gln + H2O
O
HO
O
NH3+
O
O
OPO3O
O
O
Glu + PPi
NH2
NH3+
OH
Fosforibosil--amina
1AO0
V.0.2 © gsartor 2001-2013
Metabolismo dei nucleotidi
- 42
3-4-6. Fosforibosilamina-glicina ligasi (EC 6.3.4.13)
•
L’enzima GART umano (108 kDa,
1010 aminoacidi) è tri-funzionale
e catalizza le reazioni 3, 4 e 6
della via biosintetica de-novo
delle purine:
– Glicinamide ribonucleotide
sintetasi (GARS, PurD, E.C.
6.3.4.13),
– Glicinamide ribonucleotide
transformilasi (GARTfase, PurN,
E.C. 2.1.2.2.) e
– Aminoimidazolo ribonucleotide
sintetasi (AIRS, PurM, E.C.
6.3.3.1).
OPO3-O
EC 6.3.4.13
Fosforibosilamina
-gicina ligasi
NH2
OH
HO
Fosforibosil--amina
O
NH2
NH2
NH
OH
HO
ADP + Pi
Gly + ATP
O
Fosforibosilglicinamide
(GAR)
O
H
N
H2N
N10-Formil-THF
OPO3-
O
O
NH2
O
N
H
O
N
N2-formil-N1-(5-fosfo-D-ribosil)
glicinamide (FGAR)
R
THF
OPO3-
HO
GAR
O
HO
NH
ATP
ADP + Pi
OPO3- H2 N
O
NH
O
OH
2-(Formamido)-N1(5'-fosforibosil)acetamidina
(FGAM)
Metabolismo dei nucleotidi
EC 6.3.3.1
AIR sintetasi
O
O
EC 2.1.2.2
GAR transformilasi
OH
HO
N
H
N
NH
OPO3- HN
V.0.2 © gsartor 2001-2013
OPO3-O
HO
NH
NH
O
OH
N
N
OH
5-amino-1-(5-fospho-D-ribosil)
imidazolo (AIR)
- 43
HsGART
•
L’enzima GART umano (108
kDa, 1010 aminoacidi) è trifunzionale e catalizza le reazioni
3, 4 e 6 della via biosintetica denovo delle purine :
– Glicinamide ribonucleotide
sintetasi (GARS, PurD, E.C.
6.3.4.13),
– Aminoimidazolo ribonucleotide
sintetasi (AIRS, PurM, E.C.
6.3.3.1) e
– Glicinamide ribonucleotide
transformilasi (GARTfase, PurN,
E.C. 2.1.2.2.).
Schematic presentation of crystal structures of the HsGART domains. (A) GARS in complex with ATP. (B)
Ternary complex of GARTfase with 10-(trifluoroacetyl) 5,10-dideazaacyclic-5,6,7,8-tetrahydrofolic acid and
substrate glycinamide ribonucleotide (PDB ID. 1RBY). (C) Dimeric structure of AIRS.
M. Welin, J. G. Grossmann, S. Flodin, T. Nyman, P. Stenmark, L. Trésaugues, T. Kotenyova, I. Johansson, P.
Nordlund and L. Lehtio
Nucleic Acids Res. 2010 November; 38(20): 7308–7319.
V.0.2 © gsartor 2001-2013
Metabolismo dei nucleotidi
- 44
Quattro reazioni per la costruzione dell’anello a cinque termini
aminoimidazolo carbossilato
H
N
H2N
N10-Formil-THF
O
OPO3O
N
O
NH2
H
N
O
N
N
H
R
THF
4
NH
O
EC 2.1.2.2
GAR transformilasi
OH
HO
O
Gln + ATP + H2O
GAR
O
OPO3- H2 N
O
HO
O
O
N
N
OH
O
7
OH
EC 6.3.5.3
Fosforibosilformil
glicinamidina sintasi
O
NH3+
OPO3- H2 N
EC 4.1.1.21
AIR carbossilasi HO
V.0.2 © gsartor 2001-2013
5
O
5-amino-1-(5-fospho-D-ribosil)
imidazolo (AIR)
ADP + Pi
CO2
N2-formil-N1-(5-fosfo-D-ribosil)
glicinamide (FGAR)
O
NH3+
5-amino-1-(5-fosfo-D-ribosil)
imidazolo-4-carbossilato (CAIR)
NH
NH
O
HO
O
H2 N
Glu + ADP +Pi
O
OPO3-
O
N
N
OH
6
ATP
OPO3- HN
EC 6.3.3.1
AIR sintetasi HO
Metabolismo dei nucleotidi
O
NH
NH
O
2-(Formamido)-N1(5'-fosforibosil)acetamidina
(FGAM)
OH
- 45
5. FGAM sintasi (EC 6.3.5.3)
• Ci sono due tipi di
FGAM sintasi:
O
OPO3-
– Il tipo I è presente negli
eucarioti e batteri
Gram-consiste in unico
polipepeptide di 140
kDa chiamato “large
PurL” (lgPurL);
– Il tipo II, “small PurL”
(smPurL), è stato
identificato in archaea e
batteri Gram+ e
consiste in un
polipeptide di 80 kDa
N2-formil-N1-(5-fosfo-D-ribosil)
glicinamide (FGAR)
NH
O
OH
HO
O
O
H2 N
Gln + ATP + H2O
O
NH3+
O
O
O
Glu + ADP +Pi
O
NH3+
OPO3- HN
O
HO
V.0.2 © gsartor 2001-2013
NH
O
Metabolismo dei nucleotidi
NH
NH
O
2-(Formamido)-N1(5'-fosforibosil)acetamidina
(FGAM)
OH
- 46
5. FGAM sintasi (EC 6.3.5.3)
ACP (ATP)
FGAR
• Ci sono due tipi di
FGAM sintasi:
– Il tipo I è presente negli
eucarioti e batteri
Gram-consiste in unico
polipepeptide di 140
kDa chiamato “large
PurL” (lgPurL);
– Il tipo II, “small PurL”
(smPurL), è stato
identificato in archæa e
batteri Gram+ e
consiste in un
polipeptide di 80 kDa.
V.0.2 © gsartor 2001-2013
Metabolismo dei nucleotidi
2HS4
- 47
5. FGAM sintasi (EC 6.3.5.3)
FGAR
V.0.2 © gsartor 2001-2013
ACP (ATP)
Metabolismo dei nucleotidi
- 48
7. AIR carbossilasi (EC 4.1.1.21)
• Diversa dalle solite carbossilasi: non sono
necessari né ATP né biotina
O
OPO3-
H2N
HO
N
N
O
O
O
OH
OPO3-
+
H2N
O
HO
N
N
OH
H+
OPO3-
H2N
N
N
O
HO
O
OH
5-amino-1-(5-fosfo-D-ribosil)
imidazolo-4-carbossilato (CAIR)
5-amino-1-(5-fospho-D-ribosil)
imidazolo (AIR)
V.0.2 © gsartor 2001-2013
O
O
H
Metabolismo dei nucleotidi
- 49
7. AIR carbossilasi (EC 4.1.1.21)
• Nei vertebrati la sintesi di
CAIR è catalizzata da AIR
carbossilasi (EC 4.1.1.21)
• In Escherichia coli sono
necessari due enzimi:
– 5-(carbossiamino)imidazolo
ribonucleotide sintasi (EC
6.3.4.18) che forma 5Carbossiamino-1-(5-fosfo-Dribosil)imidazolo
– 5-(carbossiamino)imidazolo
ribonucleotide mutasi (EC
5.4.99.18) che sposta il gruppo
carbossilico sulla posizione 4
dell’anello imidazolico.
V.0.2 © gsartor 2001-2013
Metabolismo dei nucleotidi
O
N
P
O
O
O
HO
O
4
O
N
N
H
OH
OH
- 50
Quattro reazioni per la chiusura dell’anello purinico dell’IMP
1-(5'-fosforibosil)-5-amino-4(N-succinocarbossamide)-imidazolo (SAICAR)
O
CAIR
O
O
O
N
O
ADP + Pi
Ribosio
N10-Formil-THF
O
H
N
O
P O
O
N
HO
N
O
N
O
N
H2O
11
O
V.0.2 © gsartor 2001-2013
THF
N
H2 N
EC 3.5.4.10
IMP cicloidrolasi O
OH
N
H2N
9
Fumarato
H2N
HN
O
O
8
Inosina monofosfato
(IMP)
O
N
H
EC 6.3.2.6
SAICAR sintasi
O
O
O
NH3 +
Asp + ATP
N
H2N
O
N
H
O
N
10
Ribosio
EC 4.3.2.2
Adenilosuccinato liasi
O
H
N
N
H
N
H2 N
H2N
R
N
N
Ribosio
1-(5'fosforibosil)-5-amino4-imidazolocarbossamide
(AICAR)
EC 2.1.2.3
AICAR transformilasi
N
5-formamido-1-(5-fosfo-D-ribosil)
imidazolo-4-carbossamide
Ribosio
(FAICAR)
Metabolismo dei nucleotidi
- 51
8. SAICAR sintasi (EC 6.3.2.6)
• I substrati possiedono mutuo
antagonismo con maggiore
antagonismo tra CAIR e ATP e
Asp
• CAIR si lega all’enzima libero
con un’affinità 200 volte
maggiore rispetto al complesso
Enzima-ATP-Asp
• Il complesso Enzima-ATP-Asp
sembra esser la forma
dominante in vivo
• IMP è un inibitore competitivo di
CAIR, suggerendo la possibilità
della formazione di un legame H
tra il carbossile in 4 e l’ NH2 in
5 di CAIR legato all’enzima.
S.W. Nelson, D.J. Binkowski, R.B. Honzatko, H.J. Fromm
Properties of SAICAR Synthetase
Biochemistry, Vol. 44, No. 2, 2005
V.0.2 © gsartor 2001-2013
Metabolismo dei nucleotidi
- 52
8. SAICAR sintasi (EC 6.3.2.6)
V.0.2 © gsartor 2001-2013
Metabolismo dei nucleotidi
- 53
9. Adenilosuccinato liasi (EC 4.3.2.2 )
• La Adenilosuccinato liasi
(ASL) ha diverse funzioni:
• Converte adenilosuccinato ad
AMP e fumarato nella sintesi
di AMP da IMP
• Converte SAICAR in AICA e
fumarato
• ASL è parte della
superfamiglia degli enzimi
che catalizzano le βeliminazioni
• È un omotetramero con tre
domini in ogni monomero e
quattro siti attivi per
tetramero.
V.0.2 © gsartor 2001-2013
Metabolismo dei nucleotidi
2VD6
- 54
AMP
O
O
• Nel muscolo
scheletrico
serve per
rifornire il ciclo
di Krebs di
fumarato
Asp
GDP
O
GTP
NH2
O
O
O
EC 6.3.4.4
Adenilosuccinato sintasi O
O
P
O
O
O
O
N
O
O
OH
HN
O
N
O
N
HN
HO
HO
O
N
H
N
N
N
O
IMP
P
O
OH
EC 4.3.2.2
Adenilosuccinato liasi
NH3
O
EC 3.5.4.6
AMP deaminasi
P
O
O
O
O
O
HO
O
N
NH2
N
OH
HN
O
O
Fumarato
N
AMP
V.0.2 © gsartor 2001-2013
Metabolismo dei nucleotidi
- 55
9. Adenilosuccinato liasi (EC 4.3.2.2 )
O
O
Asp
GDP
O
GTP
NH2
O
O
O
EC 6.3.4.4
Adenilosuccinato sintasi
O
P
O
P
O
O
O
IMP
O
N
O
O
N
OH
HN
O
N
P
O
NH2 O
N
O
O
O
O
O
N
H
N
HO
N
HN
HO
HO
O
O
H
N
N
N
O
O
O
O
O
OH
1-(5'-fosforibosil)-5-amino-4(N-succinocarbossamide)-imidazolo (SAICAR)
OH
EC 4.3.2.2
Adenilosuccinato liasi
NH3
O
O
EC 3.5.4.6
AMP deaminasi
P
O
O
O
O
O
HO
O
N
NH2
N
OH
HN
O
O
O
Fumarato
P
O
N
N
O
NH2
NH2
O
O
N
HO
AMP
OH
1-(5'fosforibosil)-5-amino4-imidazolocarbossamide
(AICAR)
V.0.2 © gsartor 2001-2013
Metabolismo dei nucleotidi
- 56
Quattro reazioni per la chiusura dell’anello purinico dell’IMP
Enzima bifunzionale
1-(5'-fosforibosil)-5-amino-4AICAR
transformilasi (EC2.1.2.3)
(N-succinocarbossamide)-imidazolo (SAICAR)
IMP cicloidrolasi (EC 3.5.4.10)
O
CAIR
O
O
O
N
O
ADP + Pi
Ribosio
H
N
H2N
N10-Formil-THF
O
O
P O
O
N
HO
N
O
N
O
N
H2O
11
O
V.0.2 © gsartor 2001-2013
H2 N
9
N
H
H
N
N
Ribosio
EC 4.3.2.2
adenilosuccinao liasi
O
10
O
N
N
H
H2 N
H2N
R
N
N
Ribosio
1-(5'fosforibosil)-5-amino4-imidazolocarbossamide
(AICAR)
THF
N
H2 N
EC 3.5.4.10
IMP cicloidrolasi O
OH
N
Fumarato
1M9N
HN
O
O
8
Inosina monofosfato
(IMP)
O
N
H
EC 6.3.2.6
SAICAR sintasi
O
O
O
NH3 +
Asp + ATP
N
H2 N
O
EC 2.1.2.3
AICAR transformilasi
N
5-formamido-1-(5-fosfo-D-ribosil)
imidazolo-4-carbossamide
Ribosio
(FAICAR)
Metabolismo dei nucleotidi
- 57
Sintesi dell’IMP
Fosforibosilamina
GAR
Gln
R5P
O
3
NH
Gly
aPRPP
O
O
7
H2N
N
N
R5P
5
R5P
8 9
H2N
NH
HN
6
R5P
FAICAR
O
N
R5P
R5P
10
O
IMP
H2 O
N
NH2
N
N
H2N
Gln
O
ATP NH
2
Asp
V.0.2 © gsartor 2001-2013
NH
O
N
ATP
O
AICAR
Fum
AIR
H
N
ATP
N10-formil-THF
CAIR
FGAM
O
4
R5P
Glu
H
N
NH2
ATP
NH2
FGAR
N
H
N
R5P
O
N
NH
11
N
N
R5P
N10-formil-THF
Metabolismo dei nucleotidi
- 58
Controllo della biosintesi IMP
• Concentrazione limitante di
Fosforibosilpirofosfato (aPRPP);
• Utilizzo di N10-Formil-THF
– Negli eucarioti antagonisti dell’acido folico:
• Metopteridina
• Metotrexato
• Amminopteridina
– Nei batteri inibitori della sintesi del folato:
• Sulfonamidi che competono con l’acido
paraminobenzoico
V.0.2 © gsartor 2001-2013
Metabolismo dei nucleotidi
- 59
Inibizione
• Antagonisti dell’acido folico
N
H2N
N
OH
N
H2N
N
NH2
N
H2N
N
NH2
H
N
N
H
H
N
N
H
CH3
N
O
CH3
O
O
O
H
N
O
O
O
H2N
O
H
N
O
Metotrexato
O
H
N
O
Metopteridina
O
N
H
N
N
H
O
H
N
O
Amminopteridina
N
N
OH
O
H
N
(Glu)n; n < 8
H
N
N
H
O
H
N
O
Pteridina
O
O
O
PABA
• Sulfonamidi che competono con
l’acido paraminobenzoico
H2N
OH
PABA
V.0.2 © gsartor 2001-2013
H2N
Metabolismo dei nucleotidi
O
Sulfonamidi
O
S
NHR
O
- 60
Sintesi di AMP e GMP da IMP
• La sorgente di energia per la sintesi di
AMP è il GTP
• AMP:
– Il C=O in posizione 6 del IMP viene convertito
in NH2 utilizzando Asp e GTP
• la sorgente di energia per la sintesi di
GMP è ATP
• GMP:
– IMP viene ossidato a XMP e il C=O in
posizione 2 viene convertito in NH2 utilizzando
Gln e ATP ad AMP
V.0.2 © gsartor 2001-2013
Metabolismo dei nucleotidi
- 61
Sintesi di AMP e GMP da IMP
• La sorgente di energia per la sintesi di
AMP è il GTP
• AMP:
– Il C=O in posizione 6 del IMP viene convertito
in NH2 utilizzando Asp e GTP
• la sorgente di energia per la sintesi di
GMP è ATP
• GMP:
– IMP viene ossidato a XMP e il C=O in
posizione 2 viene convertito in NH2 utilizzando
Gln e ATP ad AMP
V.0.2 © gsartor 2001-2013
Metabolismo dei nucleotidi
- 62
AMP
EC 6.3.4.4
Adenilosuccinato sintasi
Asp
O
P
O
O
O
O
O
O
O
O
N
O
O
OH
HO
GTP
GDP
IMP
H
N
N
OH
HN
N
O
O
EC 4.3.2.2
Adenilosuccinato liasi
O
O
P
O
N
HN
HO
NH2
O
N
O
O
N
O
P
O
AMP
O
N
O
O
HO
V.0.2 © gsartor 2001-2013
OH
HN
O
NH2
N
N
O
O
O
Fumarato
Metabolismo dei nucleotidi
- 63
GMP
O
P
O
EC 1.1.1.205
IMP deidrogenasi
IMP
O
N
O
O
O
O
O
OH
HO
NAD+ + H2O
P
O
N
O
HO
O
N
OH
GMP
HN
NH
HN
O
O
O
Gln + ATP
O
V.0.2 © gsartor 2001-2013
OH
EC 6.3.4.1
GMP sintasi
O
O
N
XMP
NADH + H+
O
N
N
HN
HO
P
O
O
N
O
O
Glu + AMP + PPi
N
O
H2 N
NH2
O
O
O
NH2
NH2
Metabolismo dei nucleotidi
- 64
Energia
• Per sintetizzare NTP da ribosio5fosfato vengono consumati:
– Sette ATP (6 ATP + 1 GTP) per AMP
– Otto ATP per GMP
V.0.2 © gsartor 2001-2013
Metabolismo dei nucleotidi
- 65
Regolazione
Ribosio-5-P
ATP
AMP
EC 2.7.6.1
Riboso-fosfato difosfochinasi
aPRPP
Gln + H2O
Glu + PPi
EC 2.4.2.14
amidofosforibosiltransferasi
5-fosforibosil--ammina
EC 6.3.4.4
Adenilosuccinato sintasi
IMP
EC 1.1.1.205
IMP deidrogenasi
Adenilosuccinato
XMP
AMP
GMP
ADP
GDP
ATP
V.0.2 © gsartor 2001-2013
Metabolismo dei nucleotidi
GTP
- 66
Interconversione delle purine
• Il turnover degli acidi nucleici (soprattutto mRNA) porta al
rilascio di basi puriniche per formare adenina, guanina e
ipoxantina.
• Visto il costo metabolico per la loro sintesi vengono
riutilizzate per risintetizzare i nucleotidi attraverso le
fosforibosil trasferasi (HGPRT):
BASE + aPRPP  NMP + PPi
• L’idrolisi di PPi rende la reazione irreversibile
• L’assenza, o la sintesi ridotta, di HGPRT è causa della
sindrome di Lesch-Nyhan nella quale la sintesi di purine è
circa 200 volte maggiore e la concentrazione di acido urico
nel sangue è elevata
• Questo aumento è dovuto all’attivazione allosterica da
aPRPP della biosintesi de-novo delle purine.
V.0.2 © gsartor 2001-2013
Metabolismo dei nucleotidi
- 67
Interconversione delle purine
NH2
NH2
N
N
HO
O
O
O
O
P
P
O
O
N
N
N
HO
HO
O
O
O
O
P
P
O
O
H2N
HO
O
HO
H
NH2
N
N
HO
O
O
P
O
O
dATP
ATP
NDP
dADP
ADP
NMP
dAMP
AMP
Nucleoside dAdenosina
BASE
N
O
O
O
P
O
OH
HO
Riduzione
O
HO
H
H2N
HO
O
Ipoxantina
O
HO
XMP
aPRPP
N
N
O
O
P
O
OH
aPRPP
N
HN
Trasferimento
NH2
IMP
Inosina
N
N
H
Trasferimento
NH2
aPRPP
Adenosina
Adenina
O
HO
OH
NTP
O
O
P
O
O
O
O
O
O
P
P
O
O
O
O
HN
N
N
O
HO
N
HN
N
N
Ossidazione
O
HO
OH
N
N
O
HO
N
N
N
N
O
O
O
O
P
P
O
O
OH
Riduzione
NH2
N
HN
N
N
O
O
N
OH
GTP
dGTP
GDP
dGDP
GMP
dGMP
Guanosina
dGuanosina
Guanina
Traut TW. Enzymes of nucleotide metabolism: the significance of subunit size and
polymer size for biological function and regulatory properties. CRC Crit Rev Biochem. 1988;23(2):121-69.
V.0.2 © gsartor 2001-2013
Metabolismo dei nucleotidi
- 68
Crediti e autorizzazioni all’utilizzo
• Questo materiale è stato assemblato da informazioni raccolte dai seguenti testi di Biochimica:
– CHAMPE Pamela , HARVEY Richard , FERRIER Denise R. LE BASI DELLA BIOCHIMICA [ISBN 9788808-17030-9] – Zanichelli
– NELSON David L. , COX Michael M. I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER - Zanichelli
– GARRETT Reginald H., GRISHAM Charles M. BIOCHIMICA con aspetti molecolari della Biologia
cellulare - PICCIN
– VOET Donald , VOET Judith G , PRATT Charlotte W FONDAMENTI DI BIOCHIMICA [ISBN 9788808-06879-8] – Zanichelli
• E dalla
–
–
–
–
consultazione di svariate risorse in rete, tra le quali:
Kegg: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes http://www.genome.ad.jp/kegg/
Brenda: http://www.brenda.uni-koeln.de/
Protein Data Bank: http://www.rcsb.org/pdb/
Rensselaer Polytechnic Institute:
http://www.rpi.edu/dept/bcbp/molbiochem/MBWeb/mb1/MB1index.html
Questo ed altro materiale può essere reperito a partire da:
http://www.ambra.unibo.it/giorgio.sartor/ oppure da http://www. gsartor.org/
Il materiale di questa presentazione è di libero uso per didattica e ricerca e può essere usato senza
limitazione, purché venga riconosciuto l’autore usando questa frase:
Materiale ottenuto dal Prof. Giorgio Sartor
Università di Bologna – Alma Mater
Giorgio Sartor - [email protected]
V.0.2 © gsartor 2001-2013
Metabolismo dei nucleotidi
- 69