SAGGIO IMMUNOCHIMICO CON RIVELAZIONE
ELETTROCHIMICA PER LA DETERMINAZIONE DEL p,p’-DDT
IN ACQUE REFLUE.
F.
1
Valentini ,
2
Compagnone
D.
e G.
1
Palleschi .
1. Dipartimento di Scienze e Tecnologie Chimiche, II Università diegli Studi di Roma Tor Vergata, via della Ricerca Scientifica 00133 Roma; e-mail: Federica.
[email protected]
2.Università degli Studi diTeramo, 64023 Mosciano S. Angelo (Te)
Nonostante nei paesi industrializzati l’uso del DDT come pesticida sia diminuito negli ultimi anni, la sua determinazione nel campo ambientale costituisce ancora oggetto di
studio, sia per il lungo tempo di persistenza del composto sia perché in paesi in via di sviluppo i livelli di concentrazione di tale inquinante risultano al di sopra del limite
WHO/FAO1. In questo lavoro è stato ottimizzato un nuovo metodo analitico basato sull’applicazione di un saggio immunochimico di tipo competitivo indiretto con
rivelazione elettrochimica (amperometrica) in FIA. Quest’ultima, in particolare, si è dimostrata essere più sensibile rispetto alla rivelazione spettrofotometrica2.
Schema del Saggio Competitivo Indiretto
Schema della rivelazione in Flusso
L.O.D.= ( x - 2s); 40 pg/mL;
E
Fig. 2
RSD inter-day : 2-6%;
E
RSD intra-day: 1-3%
E
Condizioni per la misura in FIA
DDTAc-bTG (bTG: Tiroglobulina
bovina)
Flusso: 0,8 ml/min; loop: 20 ml;
E. Lavoro: carbone vetroso (d = 3 mm; polarizzato a + 100 mV vs.
Ag/AgCl);
Rivelazione: la 3,3’,5,5’-Tetrametilbenzidina è stata utilizzata come
substrato per la misura dell’attività dell’enzima Perossidasi + H2O2
Anticorpo Antip,p’-DDT
DDT libero
E
Anticorpo secondario-HRP
Fig. 1
Valutazione dell’effetto matrice
Il saggio immunochimico è stato applicato su matrici diluite 1:1 in PBS
(Phosphate Buffer Saline 0,1M pH = 7,4) provenienti da tre impianti di
depurazione civile ed uno industriale.
100
90
I/I100
80
70
Tabella 1
(a,b,c,d)w.w./
a
(a,b,c,d)PBS
Impianto 1
1,00
Impianto 2
0,99
Impianto 3
1,00
Impianto4
0,98
60
50
0,01
0,1
1
10
100
Log [p,p'-DDT] ng/mL
PBS
Impianto1
Impianto 3
Impianto 2
Impianto 4
Fig. 3
y
b
c
d
1,00
1,00
1,00
0,98
0,97
0,97
0,98
0,95
0,95
0,95
0,99
0,97
Studio di Recupero
Al fine di ottenere maggiore sensibilità le matrici sono state estratte in Dietil Etere ed
i campioni risultanti concentrati 40 volte. In tabella 2 è riportato lo studio di recupero
per il p,p’-DDT effettuato addizionando quantità note di analita ad un pool di
campioni (per tre diverse estrazioni).
Aggiunta pg/mL
Recuperi (%)
RSD
5000
97
3
500
100
2
50
100
3
5
76
5
Tabella 2
Il valore di recupero ottenuto è intorno al 100% tranne che per la concentrazione di 5
pg/mL La diminuzione del valore di recupero osservata può essere imputata alla
presenza di molecole strutturalmente simili all’analita (DDE) che cross reagiscono
con l’anticorpo utilizzato e diminuiscono la sensibilità del dosaggio a basse
concentrazioni.
Bibliografia
1. R.K. Hans, M. Farooq, G. Suresh Babu, S.P. Srivastava, P. C. Joshi and P. N. Viswanathan,
Food and Chemical Toxicology 37 (1999) 847-852.
2. G. Giraudi, C. baggiani, A. Cosmaro, E. Santià, A. Vanni, J. Anal. Chem. (1998) 360: 235-240.
3. I. Jones and A. Madej, J. Immunoassay, 1998, 9 (3-4), 349.
Le curve di calibrazione sono state ottenute
applicando il modello della curva Logistica a 4
parametri indicata
 y

0
a
 x 
1 
x 

 0 
b
dove a e y0 rappresentano gli asintoti massimo e
minimo rispettivamente; x0 è il punto di flesso per la
curva e b è il coefficiente angolare. Le equazioni non
hanno mostrato differenze significative indicando
assenza di effetto matrice come evidenziato dai dati di
Figura 3 e Tabella 1.
Analisi dei campioni
Una serie di campioni provenienti dai depuratori sono stati sottoposti a
procedura di estrazione in Dietil Etere3. In tabella 3 sono riportati i valori di
concentrazione per i campioni in entrata ed uscita dei 4 impianti di
depurazione.
Tabella 3
Campioni
3E
4E
3E
1E
3E
4E
2E
3E
4E
4E
1U
2U
2U
1U
1U
2U
3U
2U
4U
3U
pg/mL
2
5
2
5
3
3
3
2
6
4
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d
n.d.
n.d
n.d.
n.d.
n.d.
Conclusioni
I risultati ottenuti mostrano come il
dosaggio
immunochimico
con
rivelazione elettrochimica abbia
caratteristiche
analitiche
di
sensibilità tali da poter essere
utilizzato come metodo di screening
per il monitoraggio del p,p’-DDT in
matrici ambientali.
Gli autori desiderano ringraziare il progetto Murst Cofin 1999 per aver finanziato questo lavoro.