Preparazione delle cellule di MIELOMA
Selezione degli ibridomi
E’ necessario creare condizioni di coltura in cui solo gli
ibridomi siano capaci di sintetizzare il DNA
Sistema HAT (ipoxantina-aminopterina-timidina)
La sintesi di DNA è condizionata alla presenza di NTP
sintetizzati a partire dai rispettivi monofosfati
Gli NTP si formano da:
a- sintesi De novo (via normale)
b - via di salvataggio (via alternativa)
Fusione cellulare
B-lymphocyte (from spleen) + myeloma cell (from cultured cell line)
add 50% polyethylene glycol (PEG)
(fuses cell membranes)
two separate nuclei in one cell membrane
two nuclei will join (temporary tetraploid)
chromosomes will mix together
subsequent cell division (cells "return" to diploid nucleus)
Selezione dei prodotti di fusione
B-lymphocytes
(produce antibodies)
unfused Blymphocytes
Myeloma cells
(grow in standard medium)
B-lymphocyte
+
B-lymphocyte
die in tissue culture in 7-10 days
B-lymphocyte
+
myeloma cell
(HYBRIDOMA)
unfused
myeloma cells
myeloma cell
+
myeloma cell
Selezione dei prodotti di fusione
B-lymphocytes
(produce antibodies)
unfused Blymphocytes
Myeloma cells
(grow in standard medium)
B-lymphocyte
+
B-lymphocyte
die in tissue culture in 7-10 days
unfused
myeloma cells
myeloma cell
+
myeloma cell
cannot survive in HAT medium
B-lymphocyte
+
myeloma cell
(HYBRIDOMA)
survives in HAT medium
and grows in tissue culture
FUSIONE
Far riscaldare in un becker dell’H2O a 37°C
MIELOMA A20
MILZA
1
Prelevare le cellule dalla Contare le cellule
piastra del giorno prima, 1:5
metterle in un tubo da 15
ml
2
Centrifugare le cellule e Nel
pozzetto
G12
risospenderle in 3ml di piastrare 5x104 cells in
terreno completo
200µl
di
terreno
completo
3
Contare le cellule dil 1:5
4
Nel pozzetto H12 piastrare /
5x104 cells in 200µl di
terreno completo
/
A questo punto unire le cellule di mieloma
con quelle della milza in un rapporto di 1:6 (1
cellula di mieloma con 5 cells di milza).
1x105 cell totali per pozzetto (calcolare un
totale di 100 pozzetti).
calcolare il volume corrispondente al numero
di cellule che ci occorrono per i 100 pozzetti
sia per le cellule di milza che per quelle di
mieloma.
Una volta uniti i due volumi aggiungere
terreno completo per arrivare ad un volume
totale di 5 ml (se si è già oltre tale volume
non aggiungere terreno ulteriore).
Centrifugare 5 minuti a 1500 rpm
Eliminare il surnatante
Porre la provetta contenente il pellet nel becker con
l’H2O a 37°C ed aggiungere:
- goccia a goccia 0,8 ml di PEG, risospendere il
pellet picchettando sulla falcon con la pipetta
- 1,00 ml di IMDM sempre goccia a goccia
- 8,00 ml di IMDM “
“
“
Centrifugare per 5 minuti a 1200 rpm.
Eliminare il surnatante e risospendere in 20 ml di terreno HAT
Versare il terreno con le cellule in una piastra e con la
multicanale piastrare la sospensione cellulare (200 µl per
pozzetto) in tutti i pozzetti TRANNE che nei pozzetti G12 e
H12.