METASTASI
Del fenomeno dell’invasività
risultano essenzialmente
responsabili fattori intrinseci della
cellule neoplastiche che possono
essere riassunte con:
a) modificazione dell’adesività
intercellulare;
b) produzione di sostanze attive
sulla membrana basale, sui
componenti della matrice
extracellulare e sulle cellule
normali.
METASTASI
c) Locomozione delle cellule neoplastiche per mezzo di pseudopodi;
d) produzione di fattori che inducono la formazione del sistema vascolare
nel tumore.
Durante la transizione dal tessuto normale a carcinoma in situ ed invasivo,
lo stroma locale ospite gioca un ruolo attivo.
L'interazione fra l'epitelio e i compartimenti mesenchimali produce una
zona della membrana epiteliale basale interrotta da cui la cellula
maligna emerge ed invade l'altro tessuto.
METASTASI
cellule del tumore e dello stroma scambiano:
fattori di crescita: fattore di crescita tumorale -b (TGF-b), fattore di
crescita epidermico (EGF),
citochine e chemiotattici: IL-6, fattore di crescita degli epatociti e
fattore di invasività (SF/HGF),
fattori di angiogenesi: fattore di crescita dell’endotelio vascolare
(VEGF), fattore base di crescita dei fibroblasti (bFGF)
Proteasi: le metalloproteinasi della matrice (MMPs) e l'attivatore del
plasminogeno urochinasi (uPA).
Funzioni della Matrice
Extracellulare
• 1980- supporto cellulare
• 1990- regolazione della migrazione, motilità e
adesione, differenziazione e sviluppo embrionico
• 2005- ”full partner” nel regolare eventi
cellulari:proliferazione, apoptosi, risposta agli
stress, angiogenesi, regolazione della proteasi
Matrice Extracellulare
• Struttura extracellulare formata da materiale secreto dalla membrana
plasmatica, la composizione assoluta varia fra i tessuti differenti e le
differenti parti dei tessuti
• Composizione: laminine, collageni, proteoglicani, altri secreti
cellulari
• Il legame del complesso collageno-proteoglicani alla superficie cellulare
avviene attraverso molecole di legame, per esempio fibronectina,
laminina
• Queste molecole sono ancorati alla cellula soprattutto attraverso una
famiglia di recettori transmembrane, chiamati integrine
Le cellule tumorali attivano i fibroblasti, la proliferazione delle cellule
endoteliali e il reclutamento dei leucociti. I fibroblasti attivati e le cellule
endoteliali secernono MMPs, fattori di crescita e componenti dell’ECM; i
leucociti liberano citochine e chemiochine. Le MMP accelerano la
degradazione dell’ECM, il rilascio di fattori di crescita e aumentano il
rimodellamento.
L’effetto sulla cellula tumorale: migrazione, invasione, sopravvivenza e
proliferazione
Degradazione di ECM
secrezione locale di enzimi proteolitici
Proteasi della serina
u-PA = attivatore del plasminogeno urochinasi
converte Il plasminogeno, proteolizzandolo in plasmina attiva :
degrada una serie di proteine, quali la fibrina, fibronectina,
collagene, laminina.
L’espressione di uPAR è stimolata da fattori di crescita,quali TGFb , EGF,
HGF
Recettore u-PA (uPAR) è presente sui leucociti
sulle cellule di tumore è richiesto per la metastasi, la
capacità di invasione
marker di prognosi negativa in molti cancri
A) Le cellule umane del cancro della prostata secernono uPA (red).
u-PA lega il recettore di uPA (uPAR) sulla superficie delle cellule del cancro della
prostata (green).
B) Le cellule umane del cancro della prostata sono state transfettate con DNA che
codifica la forma inattiva di uPA (yellow).
Occupando i recettori di uPA, il uPA inattivo impedisce la proteasi attiva legarsi
alla superficie delle cellule.
Entrambi i tipi di cellule secernono uPA attivo, e producono i tumori una volta
iniettati negli animali da laboratorio. Ma le cellule (A) metastatizzano, mentre le
cellule (B) no.
Ruoli delle MMP secrete dalle cellule tumorali e dello stroma
nella metastatizzazione
crescita e angiogenesi
invasione vasale e nella migrazione
crescita e angiogenesi di metastasi distali
Espressione delle MMPs
BASSO livello di espressione
Fisiologico remodelling del tessuto
Guarigione ferite
Angiogenesi
Nei depositi di grasso
ALTO livello di espressione :
in vari tumori umani e linee cellulari
La produzione delle MMPs da parte dello stroma è regolata dalle cellule
tumorali attraverso l’espressione di chimochine, citochine e l’induttore
extracellulare di metalloproteasi di matrice.
Metalloproteinasi di Matrice (MMPs)
MMPs sono sono una famiglia di circa 17 endopeptidasi zincodipendenti.
MMPs sono classificate in cinque sottoclassi a seconda della loro
specificità per un substrato: collagenasi interstiziali, gelatinasi,
stromelisine metalloproteinasi di membrana e elastasi.
Possono essere secrete o legate alla membrane MT-MMP
Tutte le MMPs sono sintetizzate in forma latente.
Richiedono attivazione extracellulare.
Classificazione di MMPs
MMPs sono classificate in cinque sottoclassi a seconda della loro
specificità per un substrato
Collagenasi (MMPs 1, 8, 13,18) --- fibre di collagene
Gelatinasi (MMP-2, MMP-9) --Gelatina, collageno tipo IV, fibronectina, elastina, laminina,
vitronectina
Stromelisine (MMP-3, 10, 11, 7) --Gelatina, fibronectina, caseina, laminina, elastina,
MMP-2/ TIMP-2 , aggrecani
Elastasi (MMP-12) -- Elastina, gelatina, collageno IV,
fibronectina, laminina, vitronectina, proteoglicani
MMPs legate alla membrane (MMP 14, 15,16, 17) –
Pro-MMP2, pro-MMP13
Attivazione delle MMPs
Il processo di attivazione delle MMPs consiste di una
reazione a due steps: un iniziale cleavage a livello della
regione propeptidica che porta alla rimozione del peptide
N-terminale, ed il secondo step, una reazione
autoproteolitica che genera l’enzima attivo stabile.
Oltre ad un’autoattivazione le MMPs possono essere il
substrato di altre MMPs.
AND
ANGIOGENESIS
Riguardo al MMPs
ruolo
delle
MMPs nell’angiogenesi è conflittuale
MMP-9 è stata trovata essere upregolata nelle isole angiogeniche e la sua
espressione si correla con l’aumento del complesso VEGF/VEGFR.
MMPs possono anche regolare negativamente l’angiogenesi.
Le MMP-7 e 9 possono convertire il plasminogeno nel potente inibitore
angiogenico angiostatina.
MMPs AND APOPTOSIS
Le MMPs inducono l’apoptosi in almeno due modi: (i) attraverso la
degradazione della ECM e la perdita dei segnali di sopravvivenza
essenziali (ii) attraverso la solubilizzazione di ligando specifici inducenti la
morte.
E’ stato visto che la capacità della MMP-7 di contribuire all’apoptosi si
correla con l’abilità si liberare il ligando di Fas (FasL), che induce l’apoptosi
in cellule che esprimono Fas
Inibitori naturali delle MMP MMP-2 e MMP-9
inibitori tissutali delle metalloproteinasi (TIMPs)
TIMP-1
Fattori di crescita
per alcune cellule
tumorali
TIMP-2
? essenziale per l’attivazione di MMP-2
in alcuni sistemi,
Elevati livelli di TIMP sono riportati in associazione
con la progressione del cancro
e identificati come indicatori di prognosi povera
in molti tipi di tumore!
TIMP-3 e TIMP-4
TIMP-3
Strettamente legato al ECM,
inibisce l’apoptosi indotta da
TNF-a
Mediante la stabilizazione dei
recettori TNF-a
sulla superficie cellulare
TIMP-4
Ha un ruolo
nell’omeostasi della
ECM stimola
l’apoptosi quando
overespressa
Per capire come un segnale cellulare possa essere
trasmesso attraverso l’interazione cellula-cellula o cellulamatrice extracellulare, basta ricordare che tali rapporti
richiedono sempre la partecipazione di specifiche proteine
di membrana, in grado di sostenere l’organizzazione della
connessione tra cellule o della matrice extracellulare.
Famiglie di proteine di adesione
• Caderine
cell-cell
• Selectine
cell-cell
• Immunoglobuline
superfamiglia
cell-cell
• Integrine
cell-matrice e
cell-cell
adesione CELL-CELL
Cad. repeats
MOLECOLE DI ADESIONE CELLULARE
Caderine
Ca 2+ -dip. omofiliche adesioni
unità funzionale = dimero
Ig and Fn III
repeats
superfamiglia
Immunoglobine (CAM)
omofiliche o eterofiliche
lectin repeats
Selectine
eterofiliche
I-CAM
Integrine
eterodimeri, eterofiliche
Si lagano a ECM, Ig-CAM,
caderine
adesione, polarizzazione,
migrazione
Caderine
PROTEINE di ADESIONE CELLULARE CALCIO DIPENDENTI
E- (epithelial)
N- (neuronal)
P- (placental)
E-caderina è la più importante
Legame omotipico:
si lega soltanto a molecole identiche sulla
superficie cellure adiacente o forma
"zipper" multimolecolare
E-caderina staining
in pelle umana
E-caderina è un soppressore dell’invasione e delle metastasi
Nuovo modello, 5-domini
di interazione
Siti che legano il Ca
Precedente modello,
dimerizzazione fra
L’N-terminale
soltanto
β-cat
γ-cat
α-cat
filamenti di actina
Carcinoma gastrico
Il carcinoma gastrico può assomigliare al
carcinoma del colon o essere diffuso
I carcinomi diffusi non formano ghiandole ma
si infiltrano come singole cellule
50% dei carcinomi gastrici del tipo diffuso
contengono mutazioni di E-cad ed in tutti i
casi espressione di E-cad è persa
Cancro gastrico con la
mutazione germinale del sito di
legame della E-cad
Seconda mutazione in E-caderina nel
carcinoma gastrico diffuso
mucosa normale stained per E-cad
Tumore gastrico diffuso quasi
nessun staining
Metilazione
del promotore di E- cad
Le molecole adesive appartenenti alla famiglia delle integrine organizzano una
complessa rete di molecole citoplasmatiche che regola la sopravvivenza, la
proliferazione e il movimento cellulare
Cellula – ECM
Integrine
Ca2+/Mg2+ dipendenti
Meccanismi Integrina-dipendenti
Adesione e diffusione
Motilità/migrazione
Differenziazione
Proliferazione
Coagulazione
Estravasasione Leucocitaria
Generazione segnali di sopravvivenza
Protezione contro l’apoptosi (anoikis)
Tumorigenesi
Metastasi
Catena b
Catena a
Cys-rich
INTEGRINE
Integrina è un eterodimero transmembrana
Lega la matrice extracellulare e il
citoscheletro
Espressa a concentrazioni molto alte sulla superficie
cellulare
Due subunità glicoproteiche: a e b associate
covalentemente
Entrambi richeste per il legame alla matrice
Sulla catena a 3-4 domini che legano Ca2+ o Mg2+
Al momento sono state riconosciute 18 subunità alfa e 9 beta che
possono formare 25 eterodimeri differenti.
b1
aE
a1
a2
a3
a4
a5
a6
a7
a8
a9
a10
a11
b7
b4
b5
av
b3
b2
b6
aIIb
aL
aM
aX
aD
b8
b9
Struttura delle Integrine
ligandi:
Legame con molecole della ECM
a b
es. fibronettina, collageno,
vitronectina,
ligandi solubili es. fibrinogeno
membrana plasmatica
citoplasma
Legame al citoscheletro e molecole
di segnalamento
proteine che legano l’actina
es. vinculina, a-actinina, talina,
Proteine che legano i filamenti
intermedi es. plakoglobina
Molte molecole di segnalamento es.
tirosine chinasi
L’ottimale segnalamento dell’integrina richiede sia
occupazione dell’integrina sia la clasterizzazione dell’integrina
CITOPLASMA
Tensin FAK
RGD
Occupazione
Actin stress fibres
Talin a-actinin
Vinculin Tensin FAK
RGD RGD RGD RGD
Clasterezzazione
Occupazione e
clasterizzazione
a-actinin
actin
Tensin
Pax
Small GTPases FAK
-Rho,Rac,cdc42 G
src
SS
Cation-bindingM2+
D
site
G SP
R
G
CITOPLASMA
Tensin
Pax
FAK
G src
SS
M2+
D
G SP
R
G
ECM glycoprotein
eg fibronectin
A seconda della taglia e della
localizzazione le strutture
possono essere contatti focali,
adesioni focali, o adesioni
fibrillari.
I segnali trasdotti attraverso
i complessi focali e le adesioni
focali sono implicati in una
serie di processi cellulari
La proteina integrina, è
in grado di modificare
la propria struttura
tridimensionale nei
punti in cui la matrice
extracellulare o le
connessioni tra cellule
subiscono alterazione,
attivando un segnale
intracelluare che porta,
ad esempio, alla
proliferazione cellulare
Analogamente, una
modificazione della
struttura
tridimensionale della
proteina integrina può
determinare
l’attivazione di un
secondo messaggero
in grado di iniziare la
sintesi di nuove
proteine, come
miosina ed actina
Complesso Adesione Focale
COMPONENTI STRUTTURALI
Talina è la struttura base
delle adesioni focali,
lega actina, vinculina, e FAK.
a-actinina è una
proteina di collegamento
che può legare anche la
vinculina.
Vinculina lega actina e tensina.
Segnalamento attraverso Integrina
a b
FAK
Grb-2
PI3-K
MAPK
Proliferation
Survival
Akt
Struttura di FAK (Focal Adhesion Kinase)
tirosina chinasi non-recettore (come la famiglia Src
–nuotante nel citosol
Crk
Nck
Csk
Cas Sos
Integrin ?
talin
paxillin
Crk
FAT Region
Amino Terminal Domain
Kinase Domain
Y925
Y397
Src
Grb-7
Carboxy-terminal Domain
Grb-2
PI3-K
Sos
FAT Region = Focal Adhesion Targeting Region
Integrine, FAK, e MAPK
Intracellulare
Matrice Extracellulare
fibronectina
b integrina
a
fibronectina
1
P
src
Paxillina
fak
MEMBRANA
2
3
P
4
Src
5
(rac, rho, ras)
1 Aggregazione integrine
2 Autofosforilazione di fak
Intracellulare
Organizazione
del citoscheletro
Segnalamento via ECM
3 Associazione fak/src
4
5
5
Nucleo
src fosforila fak
risposte mitogenetiche
5 AND...
FAK
Dopo il legame al complesso attivato
dell'integrina, FAK autofosforila la sua
tirosina
c-Src è una tirosin chinasi non
recettore citosolica solitamente
inattiva per la configurazione
auto-impacchettata
Questo
fosfotirosina
permette che FAK
leghi i dominii SH2
di Src o Fyn
fosforilandoli
FAK legandosi attiva c-Src aprendola
C-Src fosforila FAK di nuovo!
c-Src chinasi
FAK chinase
solo legame
SH2 domain of Grb2
Attivazione di
JNK/NF-kB
(proteina adattatrice recruta
RasGEF SOS alla membrana)
attivano
Ras-MAPK
Sopravvivenza
Cellulare
p85 subunità di PI-3K
attivazione
PKB/AKT
Sopravvivenza e
Propagazione
Attivazione di JNK/NF-kB
JNK è un modulatore delle funzioni delle cellule epiteliali che è
implicato in risposte opposte.
Quando è attivato dalle integrine porta alla progressione del
ciclo cellulare attraverso l’espressione di geni AP1.
Le integrine attivano anche il fattore di trascrizione NF-kB, che
promuove la sopravvivenza e l’angiogenesi.
L'overespressione di integrine è un
forte sostegno per le cellule del tumore
Integrina α5β3
fortemente espressa
sul fronte invasivo del melanoma maligno
e dei vasi sanguigni angiogenici.
Espresso a debolmente
in nevi e vasi sanguigni quiescenti
Integrina α6β4
fortemente espressa
NON espressa
durante la progressione dei carcinomi tiroidei
nelle cellule tiroidee benigne
Integrina α5β1
Ha un azione soppressiva del tumore.
La sua espressione è persa in molti tumori
Integrine e Cancro
• Il profilo delle integrine cambia nella
progressione di molti tumori solidi
• Spesso, specifiche integrine sono perse
• Transfezione per ripristinare l’espressione
dell’integrina decrementa la tumorigenicità
Espressione di avb6 in epitelio orale normale e
carcinoma delle cellule squamose
x33
epitelio normale
x33
carcinoma Squamoso
FAK Knockout mice
• Embrioni letali
– Embrioni hanno severi difetti morfogenici
– Il numero delle adesioni focali è
INCREMENTATO
• Non difettano nella formazione delle adesioni
focali, come fibroblasti FAK-/- fanno
eccezionalmente larghe adesioni focali
• Il difetto sembra essere nella dissoluzione
dell’adesione focale, critica per la migrazione
cellulare
FAK e Cancro
• In molti tumori solidi, l’espressione di FAK
è aumentata
• FAK può essere un marker di tumori
invasivi e metastatici
• Aumentate sopravvivenza e migrazione,
funzioni dell’aumentata espressione di
FAK fa di esso un attraente target per lo
sviluppo di piccole molecole inibitorie
come agenti antineoplastici
FAK e SOPRAVVIVENZA
• L’ingranaggio di FAK dall’integrina stimola un
pathway della sopravvivenza
• Il distacco delle cellule epiteliali dalla ECM
provoca un tipo di apoptosi. ANOIKIS
• La trasduzione del segnale procede attaverso
altri enzimi di segnalamento che promuovono la
sopravvivenza: FAK-PI3Kinasi-Akt-Bad-antiapoptosi
• Questa funzione può essere la principale di FAK