Ematologia di laboratorio
 Esame emocromocitometrico
 Anemie
 Malattie dei leucociti
 Emostasi e trombosi
Sequenza crescita e maturazione cellule
Sviluppo linfoide (linfoblasto, linfocita B,
plasmacellula, linfocita T,
cellule NK)
Sviluppo mieloide (eritrociti, piastrine,
leucociti neutrofili, eosinofili
e basofili, monociti)
Specifiche Analitiche

25 Parametri:
WBC, RBC, HGB, HCT, MCV, MCH, MCHC, PLT
RDW-CV, RDW-SD, MPV, PDW, P-LCR
NEUT %, LYMPH %, MONO%, EO%, BASO%
NEUT#, LYMPH #, MONO#, EO#, BASO#


HPC#, HPC%
5 Istogrammi:
WBC, EO, BASO, RBC, PLT
2 Citogrammi
WBC-DIFF, IMI
Principi e Tecnologie
Sette Canali Analitici
WBC (Linfo)
 DIFF ( Linfo, Mono, Gran.)
 EOSINOFILI
 BASOFILI
 IMI ( Cellule Immature )
 RBC / PLT
 HGB ( Emoglobina )

Principi e Tecnologie
Principio Resistivo a Volume fisso
Principi e Tecnologie
Canale WBC
Principi e Tecnologie
Rilevazione RF/DC
Segnale RF
(Densita' e Volume
Nucleare)
Segnale DC
(Volume Cellulare)
Principi e Tecnologie
Canale DIFF
Principi e Tecnologie
Conteggio RBC/PLT
Rilevazione Resistiva con Focalizzazione Idrodinamica
Indici Eritrocitari
MCH Emoglobina corpuscolare media
Espresso in pg (26-32)
Hb / eritrociti
< 26: IPOCROMIA
> 32: IPERCROMIA
MCHC Concentrazione emoglobinica
corpuscolare media
Hb (g/dL) / ematocrito
32-36%
Indici Eritrocitari
RDW-SD
Rappresenta l'ampiezza aritmetica della
curva di distribuzione RBC.
Viene calcolato come differenza
volumetrica ad un'altezza pari al 20
%del picco RBC e viene espresso in
femtolitri.
RDW-CV
Rappresenta l'ampiezza di
distribuzione espressa in coefficiente
di variazione(%). Viene calcolato
dividendo la deviazione standard (SD)
per il valore di MCV.
Indici piastrinici
PDW (Ampiezza Distribuzione PLT )
E' calcolato come differenza
volumetrica tra i 2 punti che
tagliano la curva di distribuzione al
20% della sua altezza.
MPV (Volume Piastrinico Medio )
E' calcolato dalla seguente formula:
MPV(fl)=Pct(%) X 1000 / PLT (x103
/ul)
P-LCR (Percentuale Grandi Piastrine)
Rappresenta la percentuale di
piastrine aventi volume superiore a
12 fl. rispetto al numero totale di
piastrine.
Principi e Tecnologie
Determinazione HGB
Metodica Sulfolyser
Legame tra Globina e gruppo idrofobico SLS
Modifica di Configurazione
Ossidazione Fe 2+
Fe 3+
Legame con Gruppo Idrofilico SLS e formazione di Fe --> SLS-Hb
Citogramma RETICOLOCITI
NRBC = globuli rossi nucleati, ovvero ERITROBLASTI
Principio di reazione canale IMI
•
•
•
•
•
Lipidi
Colesterolo
Fosfo-lipidi
Glico-lipidi
Super Surfactante
• Amino Acidi
WBC Maturi
WBC Immaturi
Distribuzione Canale IMI
PBSC = “peripheral blood staminal cells”
Left shift = spostamento a sinistra della
formula leucocitaria (immissione in circolo
di leucociti immaturi)
Referto
Classificazione delle anemie
Ridotta produzione di eritrociti
• aplasia midollare
• deficit B12/folati
• sindromi mielodisplastiche
• infiltrazione midollare
Aumentata distruzione
• anemie emolitiche
• cause extracorpuscolari (meccaniche,
autoimmuni)
Sintesi emoglobinica anomala o ridotta
• sideropenia
• disordini cronici
• talassemie e Hb anomale
Parametri per lo studio del
metabolismo del ferro
FERRITINA
TRANSFERRINA
RECETTORE SOLUBILE DELLA
TRANSFERRINA
Malattie dei leucociti
Alterazioni della funzione
Alterazioni quantitative non neoplastiche
(mononucleosi, reazione leucemoide,
neutropenia, …)
Malattie neoplastiche
• mieloproliferative (acute, croniche,
sindromi mielodisplastiche)
• linfoproliferative (acute, croniche,
linfomi)
• immunoproliferative (mieloma,
amiloidosi, gammopatie monoclonali,…)
EMOSTASI
MECCANISMO DI DIFESA A PROTEZIONE DELL’INTEGRITA’
DEL SISTEMA VASCOLARE
LO STUDIO DELLA COAGULAZIONE, CHE PUO’ APPARIRE
SEMPLICE, IN REALTA’ NASCONDE NON POCHE INSIDIE
ANCHE NELL’ESECUZIONE DELLE METODICHE PIU’ COMUNI
PER I NUMEROSI FATTORI CHE INFLUENZANO IL DATO
FINALE
DA UN PUNTO DI VISTA IDEALE, I RISULTATI ANALITICI
DOVREBBERO RIFLETTERE I VALORI DEI PARAMETRI
PRESENTI IN VIVO; E’ TUTTAVIA FACILE CAPIRE COME,
DAL MOMEMTO IN CUI IL SANGUE FUORIESCE DAI VASI,
VADA INCONTRO AD UNA SERIE DI CAMBIAMENTI A
CARICO DEI SINGOLI COMPONENTI DELL’EMOSTASI,CHE
POSSONO ALTERARE I RISULTATI IN MANIERA
CONSIDEREVOLE
ALCUNI DI QUESTI CAMBIAMENTI AVVENGONO
IMMEDIATAMENTE, COME L’ATTIVAZIONE DELLE
PIASTRINE, LA LIBERAZIONE DEL FATTORE TESSUTALE
E L’ATTIVAZIONE DELLA FASE DI CONTATTO; ALTRI
SONO PIU’ TARDIVI E RIGUARDANO I FATTORI PIU’
LABILI SOGGETTI A PREMATURO DETERIORAMENTO
GLI ERRORI CHE SI POSSONO VERIFICARE DURANTE LA
FASE PREANALITICA SONO PARTICOLARMENTE CRITICI
PERCHE’ SFUGGONO AI PROGRAMMI DI VALUTAZIONE
ESTERNA ED INTERNA CHE PERMETTONO DI INDIVIDUARE
VARIAZIONI NON VOLUTE CHE POSSONO VERIFICARSI
DURANTE IL PROCEDIMENTO ANALITICO
VARIABILI PREANALITICHE
LA VARIABILE PREANALITICA PUO’ RIGUARDARE:
 LE CONDIZIONI DEL PAZIENTE AL MOMENTO DELPRELIEVO
 LA RACCOLTA DEL SANGUE
 LA PREPARAZIONE DEL PLASMA
 LA CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE
Schema cascata coagulativa e test di screening
Via intrinseca
Via estrinseca
Chininogeno
Precallicreina
Fattore XII
FattoreXI
FattoreIX
Fattore VIII
Tromboplastina
Fattore VII
Via comune
APTT
Fattore XIIIa
Fattore X
Fattore V
Fattore II
Fattore I
Fibrina solubile
Fibrina insolubile
PT
Differenze fra sindromi emorragiche dovute alla
fase vasculopiastrinica e alla fase coagulativa
Difetto Vasopiastrinico
Difetto Coagulativo
Storia familiare
Rara
Frequente
Preval. sessuale
Femmine
Maschi
Tipo di
sanguinamento
Cute e mucose,petecchie
ed ecchimosi,spontaneo
Ematomi muscolari ed
emartri,post-traumatici
Modalita’ di
presentazione
Sanguinamento immediato
dopo trauma, persistente
Test di laboratorio
PT e APTT normali
Sanguinamento ritardato
dopo trauma ,ritardato e
ricorrente
PT e/o APTT 
TE e PLT alterati
TE e PLT normali
Test di screening
TEMPO DI EMORRAGIA
CONTEGGIO DELLE PIASTRINE
TEMPO DI PROTROMBINA
TEMPO DI TROMBOPLASTINA PARZIALE
ATTIVATO
TEMPO DI EMORRAGIA
Definizione
Il tempo di emorragia (o T. di Sanguinamento o T. di
Stillicidio o Bleeding Time) e’ il tempo necessario
all’arresto del sanguinamento da un piccolo taglio, di
dimensioni standardizzate, provocato sulla superficie
cutanea
Intervallo di riferimento per il test secondo Ivy
2 – 9 minuti
TEMPO DI EMORRAGIA
Finalita’ diagnostiche
Il tempo di emorragia valuta l’interazione delle piastrine
con la parete vascolare e la successiva formazione del
tappo piastrinico.
Un prolungamento del T.E. e’ riscontrabile, oltre che in
casi di piastrinopenia o di piastrinopatia, anche in
pazienti con carenza di alcuni fattori plasmatici
(Fibrinogeno e FvW) e in soggetti con alterazioni della
parete vascolare.
TEMPO DI EMORRAGIA
Malattie congenite
Alterazioni della componente vascolare
Alterazioni della adesivita’ piastrinica al subendotelio
Alcune forme di piastrinopatia
Difetti nella formazione di fibrina nel tappo piastrinico
TEMPO DI EMORRAGIA
Malattie acquisite
Difetti di formazione di fibrina nel tappo piastrinico (DIC)
Presenza in circolo di proteine anormali e anticorpi
Anormalita’ di interazione fra endotelio e piastrine (m. renali,
m. epatiche, anemie)
Disordini funzionali acquisiti delle piastrine dovuti a farmaci
(ASA, Antibiotici)
VIA INTRINSECA (aPTT)
VIA ESTRINSECA (PT)
FXII
FXI
Ca2+
FIX
FVII
Tissue Factor
Ca2+
Ca2+
Eparina
AT
VIII
FX
VIA COMUNE
Ca2+
FII
FIBRINOGENO
FXIII
Fibrina
FV
Coagulo di Fibrina
TEMPO DI PROTROMBINA
VII
X
Xa
V
II
TROMBINA
FIBRINOGENO
FIBRINA
TEMPO DI PROTROMBINA
Definizione
Tempo di coagulazione del plasma in esame, reso povero in
piastrine, dopo aggiunta di quantità ottimali di un estratto
tissutale (tromboplastina) e di ioni calcio.
TEMPO DI PROTROMBINA
Espressione dei risultati- ieri
1) TEMPO DI PROTROMBINA:ESPRESSIONE IN SECONDI
2) ATTIVITA’ PROTROMBINICA : ESPRESSIONE IN
PERCENTUALE RISPETTO AD UN NORMALE
sec. paziente
3) INDICE DI PROTROMBINA: ------------------- x 100
sec normale
sec. paziente
4) RAPPORTO DI PROTROMBINA: ……………..
sec normale
TEMPO DI PROTROMBINA
Espressione dei risultati-oggi
INR = International Normalized Ratio
modello di espressione standardizzato proposto nel 1983
dall’OMS, definito come il rapporto PT paziente/PT normale
elevato all’ ISI (International Sensitivity Index ); l’ISI indica la
sensibilità della tromboplastina utilizzata rispetto alla
Tromboplastina di Riferimento Internazionale (per definizione
ISI = 1) .
L’espressione dei risultati in INR dovrebbe superare il problema
della variabilita’ dei sistemi di misura e consentire la
comparabilita’ dei risultati ottenuti nei vari laboratori.
TEMPO DI PROTROMBINA
Via coagulativa esplorata
Il PT misura l’attività della via estrinseca (F VII) e
della via comune (F II, V, X); fattori sintetizzati dal
fegato e vitamina K dipendenti (F II, VII, X).
Misura inoltre il livello di fibrinogeno (F I).
Popolazione normale: 0.85 – 1.25 INR
Pazienti TAO: 2.00 – 4.5 INR
TEMPO DI TROMBOPLASTINA
PARZIALE ATTIVATA ( APTT )
Definizione
Tempo in secondi richiesto per la formazione del
coagulo di fibrina in un campione di plasma citratato,
povero di piastrine, per azione di un attivatore della
fase di contatto ed in presenza di fosfolipidi, che
simulano quelli piastrinici, e di ioni calcio.
TEMPO DI TROMBOPLASTINA
PARZIALE ATTIVATA ( APTT )
Procedimento analitico
Il plasma citratato, un attivatore di contatto (farina fossile) e dei
fosfolipidi procoagulanti (cefalina) vengono mescolati e incubati a
37° C. L’attivatore di contatto attiva i Fattori XI e XII. I
Fosfolipidi forniscono la superficie per l’interazione dei fattori
della coagulazione. Dopo l’incubazione viene aggiunta una
quantita’ appropriata di ioni calcio, che promuovono l’attivazione
della via intrinseca della cascata coagulativa, e misurato il tempo
di formazione del coagulo.
TEMPO DI TROMBOPLASTINA
PARZIALE ATTIVATA ( APTT )
Espressione dei risultati
I valori sono espressi in
SECONDI
RATIO (Rapporto fra il valore in secondi dell’APTT
del plasma campione e il valore in secondi dell’APTT
del plasma di riferimento )
L’espressione in RATIO dovrebbe migliorare la
comparabilità dei risultati tra i vari laboratori e dello
stesso laboratorio in giorni differenti.
TEMPO DI TROMBOPLASTINA
PARZIALE ATTIVATA ( APTT )
Via coagulativa esplorata
Il test APTT esplora la via intrinseca (fattori VIII, IX, XI, XII)
e la via comune (fattori I, II, V, X) della coagulazione.
intervalli di riferimento
Popolazione normale: 26 – 42 secondi
0.60 – 1.23 Ratio
Possibili anomalie dell’emostasi
esplorata con i test di primo filtro
TE
PT APTT Fase alterata
Fase emostasi
anormale
N
N
N
N
N
A
N
N
Vasopiastrinica
N
N
A
Coagulativa
Piastrinopenie
Piastrinopatie
FVIII,FIX,FXI,FXIII
N
A
N
Coagulativa
FVII
N
A
A
Coagulativa
FX,FV,FII,FI
A
N
N
m vWillebrand
A
A
A
Vasopiastrinica
Coagulativa
Vasopiastrinica
Coagulativa
Difetti Globali
emostasi
TEST COMPLEMENTARI
DOSAGGIO FIBRINOGENO
DOSAGGIO ANTITROMBINA
D-DIMERO
TEMPO DI TROMBINA
FIBRINOGENO
Definizione
Il fibrinogeno è una glicoproteina sintetizzata dal fegato,
costituita da tre coppie di catene polipeptidiche (Aa,Bß, γ)
legate da ponti disolfurici S-S, che dopo clivaggio
proteolitico da parte dell’enzima procoagulante trombina e
l’intervento del F XIIIa è convertita in fibrina insolubile
stabilizzata. Ha una emivita di circa 3-5 giorni.
FIBRINOGENO
METODI DI DOSAGGIO
1)METODO IMMUNOLOGICO
2)METODI COAGULATIVI
METODO DI CLAUSS
METODO PT DERIVATO
FIBRINOGENO
Metodo di Clauss
Il metodo piu’ usato per il dosaggio del fibrinogeno è il
metodo funzionale secondo Clauss. Usando un eccesso di
trombina il tempo di formazione del coagulo del plasma
diluito è inversamente proporzionale alla concentrazione del
fibrinogeno plasmatico.
FIBRINOGENO
Metodo PT Derivato
Metodo fotometrico che consente di valutare la
concentrazione del fibrinogeno plasmatico dalla variazione di
assorbanza durante il dosaggio del tempo di protrombina. Il
vantaggio è il contemporaneo dosaggio del Fibrinogeno e del
PT. Buona correlazione con il metodo di Clauss per livelli di
fibrinogeno normali, scarsa comparabilità dei risultati per PT
prolungato (es. in TAO), per valori elevati o bassi di
fibrinogeno, in corso di terapia trombolitica.
FIBRINOGENO
Metodo Immunologico
Impiego
basilare
nella
diagnostica
delle
disfibrinogenemie dove, in presenza di una ridotta
fibrinogenemia determinata con metodi funzionali, si
osserva una normale concentrazione della proteina
valutata come antigene.
FIBRINOGENO
Espressione dei risultati
e
intervallo di riferimento
I risultati vengono espressi in mg/dl
Intervallo di riferimento 200-400
D-DIMERO
Definizione
Il d-dimero è il piu’ piccolo frammento del peso di 182 kd
resistente alla plasmina, descritto per la prima volta da
Gaffney nel 1972.
Puo’ essere considerato un indice globale di attivazione
emostatica, in quanto è il prodotto finale di una sequenza
di reazioni che portano alla degradazione della fibrina
stabilizzata ad opera della plasmina.
Ha una emivita di 4-6 ore.
Attivita fibrinolitica della plasmina
PLASMINA
Fibrinogeno
Fibrina stabilizzata
Fibrina I
Bß1-42
Bß 15-42
Frammento D
Dimero-D
Frammento E
Frammento E
D-Dimero
Metodi di determinazione
Dosaggio semiquantitativo mediante utilizzo di particelle di
lattice, rivestite di anticorpi monoclonali specifici per i DDimeri
Dosaggio immunoenzimatico
Dosaggio immunoturbidimetrico
D-DIMERO
Procedimento analitico
Il dosaggio del D-Dimero viene eseguito con un metodo
quantitativo immunologico al lattice. Il reattivo è composto
da una sospensione di microparticelle del diametro molto
piccolo (da 0.1 a 0.2 μ) unite con legame covalente a due
anticorpi murini monoclonali anti DD scelti per la loro
reattività nei confronti dei diversi prodotti di degradazione
della fibrina. La dimensione di queste particelle rende il
mezzo di reazione praticamente trasparente e la luce è
assorbita in misura molto modesta. In presenza di D-D la
reazione antigene-anticorpo provoca un’agglutinazione delle
microparticelle che rendono il mezzo opaco. Questo aumento
di torbidità è misurato a 540 nm ed è proporzionale alla
quantita’ di D-D presenta nel campione.
D-DIMERO
Significato del test
Importante il suo significato prognostico negativo.
La sua negatività favorisce l’esclusione di diagnosi di trombosi
venosa profonda ed embolia polmonare.
Bassa specificità e basso valore predittivo positivo del
D-Dimero nella diagnosi dell’evento tromboembolico.
Infatti, aumenta in altre situazioni patologiche quali:
Coagulazione intravascolare disseminata, Neoplasie, Patologia
epatica, Sindrome Nefrosica, Insufficienza renale, Periodo
postoperatorio, Gravidanza, Sforzo fisico eccessivo.
D-DIMERO
Espressione dei risultati
I risultati vengono espressi con il metodo in uso, in g/ml di
FEU ( Unita’ Fibrinogeno Equivalenti).
FEU = quantità nota di D-Dimero rispetto una quantità
nota di fibrinogeno sottoposta all’azione della trombina e
della plasmina (standard D-D in FEU).
Intervallo di riferimento fino a 0.80 g/ml FEU.
I risultati possono anche essere espressi in g/ml di D-D.Il
valore FEU è il doppio di quello espresso in g/ml di DD.
PT PROLUNGATO
APTT PROLUNGATO
Ricerca eparina
Anamnesi
Positiva
Negativa
Negativa
Paziente in
TAO
Positiva
miscela
Nessuna correzione
Correzione
Ricerca LAC
Dosaggio di fattori
Inibitori specifici
DOSAGGIO DEI FATTORI DELLA
COAGULAZIONE
Metodo qualitativo: misura l’attivita’ di una molecola
Metodo quantitativo:misura l’intera entita’ molecolare
intesa come capacita’di comportarsi da antigene e reagire
con anticorpi specifici
DOSAGGIO FUNZIONALE DEI FATTORI
oSi basa sulla modificazione dell’APTT e del PT
oIl plasma in esame viene diluito o miscelato con un plasma
contenente in eccesso tutti i fattori della coagulazione
tranne il fattore in esame
oL’APTT o il PT, eseguito su questa miscela,fornira’ un
tempo di coagulazione dipendente esclusivamente
dall’attivita’ del fattore in esame contenuto nel campione
TROMBOFILIA
Gli anticoagulanti naturali modulano i processi emocoagulativi
impedendo che essi procedano in modo eccessivo.
 La formazione del trombo e’ il risultato di un’insufficiente
azione di questi inibitori fisiologici.
 La carenza congenita degli anticoagulanti naturali e’ trasmessa
generalmente come carattere autosomico dominante ed e’
correlata ad alto rischio di manifestazioni trombotiche anche in
giovane eta’. Il rischio e’ ulteriormente aggravato dalla carenza
contemporanea di piu’ anticoagulanti naturali.
 Gli eventi trombotici possono essere favoriti da eventi esterni
quali: traumi, interventi chirurgici ,obesita’,contraccezione
orale…
TROMBOFILIA
Il trombo rappresenta la lesione patognomonica della
trombofilia.
Si forma all’interno dei vasi per effetto di un abnorme
attivazione del sistema emostatico.
Tale condizione puo’ restare a lungo senza conseguenze
cliniche, ma puo’ anche determinare l’occlusione
vascolare in concomitanza di un’insufficienza relativa o
assoluta dei meccanismi naturali di controllo.
Meccanismi di controllo reazioni
emocoagulative
XII
XI
P.K.
HMWK
TF
IX
PS-PCa
TF
VIII
X
V
II
VII
TFPI
AtIII
TROMBINA
Test di laboratorio nella trombofilia
I test di laboratorio che permettono di diagnosticare
predisposizione o stato di tromboembolia sono:
ANTITROMBINA
 PROTEINA C
 PROTEINA S
 APCR (Resistenza alla proteina c attivata)
 LUPUS ANTICOAGULANT (LAC)
Test di laboratorio nella trombofilia
Test di laboratorio che permettono di diagnosticare
predisposizione o stato di tromboembolia sono:
 MUTAZIONE G20210A DELLA PROTROMBINA
 ANTICORPI ANTIFOSFOLIPIDI
 ANTICORPI ANTICARDIOLIPINA
 OMOCISTEINA
DISFIBRINOGENEMIA
DIFETTI DI PLASMINOGENO
DIFETTI DI tPA
DIFETTI DI HC II
AUMENTO DEL PAI -1
ANTITROMBINA
Definizione
E’ UNA GLICOPROTEINA PLASMATICA A CATENA
SINGOLA DEL P.M. DI 58 Kd.
VIENE SINTETIZZATA NEGLI EPATOCITI E NELLE
CELLULE ENDOTELIALI ED ESCRETA DAI RENI.
LA SUA EMIVITA E’ DI 60 ORE.
APPARTIENE ALLA FAMIGLIA DELLE SERPINE (SERIN
PROTEINASI INHIBITOR) E INIBISCE LE PROTEASI
SERINICHE CHE INTERVENGONO NEL PROCESSO
COAGULATIVO.
ANTITROMBINA
Funzioni (I)
L’Antitrombina è uno dei principali inibitori fisiologici della
coagulazione: la sua azione si estrinseca attraverso
l’inattivazione di tutte le proteasi seriniche ad azione
procoagulante (IIa,XIIa,XIa,IXa,Xa,Pka) con le quali forma un
complesso stabile, equimolare, privo di attivita’ residua.
ANTITROMBINA
Funzioni (II)
L’azione inibitoria dell’Antitrombina e’ di per se’ lenta, ma
e’ notevolmente accelerata in vitro dall’eparina (cofattore
eparinico I). In vivo l’azione dell’AT e’ probabilmente
mediata ed accelerata dal suo legame con i
glicosaminoglicani eparino-simili che si trovano sulla
parete vascolare
ANTITROMBINA
Diagnosi di laboratorio
Metodi Funzionali
Metodi Immunologici
Metodi coagulativi
Metodi cromogenici
Immunodiffusione radiale
Elettroimmunodiffusione
ELISA
ANTITROMBINA
Procedimento analitico
METODO FUNZIONALE CROMOGENICO:
Plasma diluito + eparina + trombina in eccesso
Complessi Trombina-Antitrombina
+
TROMBINA RESIDUA
Viene misurata utilizzando un substrato cromogenico
ANTITROMBINA
Espressione dei risultati
e
intervallo di riferimento
La densità ottica misurata viene letta sulla
curva di calibrazione con ottenimento della
% di attività.
I risultati vengono espressi in %
Intervallo di riferimento: 80% -120%
ANTITROMBINA
Difetti congeniti
Le carenze congenite portano a fenomeni di tromboembolia piu’
frequentemente venosa che non arteriosa.
Le carenze di AT vengono classificate come:
TIPO I: Livelli antigenici e funzionali ridotti
TIPOII: Presenza di livelli plasmatici normali ma riduzione
della capacita’ di nautralizzare la trombina o di legare l’eparina
ANTITROMBINA
Difetti acquisiti
I difetti acquisiti si possono osservare nel corso di svariate
condizioni patologiche tra cui:
-Epatopatie (cirrosi,neoplasie)
-CID e Ustioni (per rapido consumo di Antitrombina)
-Sindromi nefrosiche (perdita proteica per compromissione del
filtro renale)
-Gastroenterite acuta (Entropatia proteino disperdente)
-Chemioterapia (Maggior attivazione della trombina e
conseguente consumo di antitrombina)
-Neoplasie e Leucemie (Immissione di materiale procoagulante e
conseguente consumo di antitrombina)
ANTITROMBINA
Condizioni fisiologiche particolari
Si osserva :
-riduzione fisiologica nei neonati per ridotta sintesi epatica di
AT fino al 6° mese;
-riduzione nei maschi adulti dopo i 30 anni,che diventa piu’
marcata dopo i 60 anni;
-riduzione nelle femmine in eta’ fertile con un andamento che
segue quello ormonale (massimi durante il mestruo, minimi
durante l’ovulazione);
-riduzione durante la gravidanza.
ANTITROMBINA
Condizioni terapeutiche particolari
Riduzione nella chirurgia maggiore con picco riduttivo in terza
giornata post-operatoria e ritorno alla normalita’ intorno alla
quinta;
Riduzione nella terapia estroprogestinica (aumenta di 5 volte il
rischio tromboembolico);
L’eparina induce un aumentato catabolismo della At (la
somministrazione e.v. o s.c. a dosi terapeutiche puo’ causare
una riduzione dal 5% al 31% dei livelli di At in circolo);
La TAO aumenta i livelli di At come conseguenza della ridotta
sintesi dei fattori del complesso protrombinico.
ANTITROMBINA
Utilizzo clinico
L’Antitrombina ha i seguenti utlizzi clinici:
-Dosaggio pre-operatorio
-Dosaggio basale ante terapia eparinica
-Dosaggio in Trombosi venosa profonda giovanile ed
embolia polmonare per valutare alterazioni congenite
o riduzioni acquisite
-Controllo in terapia estroprogestinica
PROTEINA C COAGULATIVA
La Proteina C coagulativa (PC) e’ un inibitore fisiologico
del fattore Va e VIIIa.
 Ha una azione inibitrice della trombina attraverso un
complesso meccanismo regolatore.
 La PC attivata (APC) modula inoltre l’attivazione del
plasminogeno e del tPA favorendo la fibrinolisi.
 La PC e’ sintetizzata nel fegato ed escreta dai reni.
 L’emivita e’ di 7 ore.
Attivazione e azione della PC
Ca2+
V
BLOOD FLOW
APC
PS
VIIIa
IXa
VIIIa inactive
PC
APC
V a inactive
PC
Ca2+
THROMBOMODULIN
T
Va
Xa
V
PS
PHOSPHOLIPID SURFACE
APC
Ca2+
PROTEINA C
Difetti congeniti
I difetti genetici da carenza totale sono incompatibili con la vita
 Le carenze congenite parziali possono portare a fenomeni di
tromboembolia piu’ frequentamente venosa che arteriosa
 La PC e’ vitamina K-dipendente ed ha una emivita breve per
cui si manifesta un deficit di PC in anticipo rispetto
all’inattivazione degli altri fattori da parte della TAO
 Le carenze vengono clessificate come:
TIPO I : livelli antigenici e funzionali ridotti
TIPOII : Presenza di livelli plasmatici normali ma riduzione della
funzionalita’
PROTEINA C
Difetti acquisiti
Ridotta sintesi
Aumentata
escrezione
Aumentato consumo
Cirrosi epatica
Sindrome
nefrosica
CID
Epatopatia cronica
Plasmaferesi
Porpora trombotica
trombocitopenica
Insufficienza epatica
fulminante
Intervento chirurgia
maggiore
Pazienti con
metastasi epatiche
Ictus acuto ischemico
Pazienti con
leucemia acuta
PROTEINA C
Condizioni fisiologiche
Si osserva riduzione fisiologica nei neonati per ridotta sintesi
epatica di PC fino al 6° mese.
La gravidanza dal 1° trimestre induce aumento dei livelli di
PC che si mantengono alti fino al momento del parto e del
puerperio.
Correlazione positiva
plasmatica di PC.
fra
l’eta’ e
la
concentrazione
PROTEINA C
Condizioni terapeutiche particolari
L’uso della terapia estro-progestinica induce aumento dei livelli
di PC (aumento della sintesi epatica dei fattori vitK dipendenti)
Assunzione di anticoagulanti orali causa la riduzione di PC
(proteina vitK dipendente)
Il trattamento con L-asparaginasi nelle leucemie acute e nei
linfomi causa una riduzione di PC (tossicita’ del farmaco a
livello epatico)
La somministrazione orale di uno steroide anabolizzante, lo
Stanazololo, provoca un aumento della PC (gli epatociti
conterrebbero recettori per gli steroidi capaci di legare gli
steroidi anabolizzanti)
PROTEINA C
Test di laboratorio
I test di laboratorio di tipo funzionale sono in grado di
individuare sia i difetti di Tipo I sia i difetti di Tipo II.
I test si basano sull’attivazione dalla PC presente nel campione
in esame mediante veleno di serpente (Protac).
L’azione della proteina C endogena cosi’ attivata, si valuta
quindi verificando il prolungamento da essa determinato di un
Aptt (metodo coagulometrico) o la capacita’ della stessa di
agire su un substrato cromogenico specifico (metodo
cromogenico).
PROTEINA S COAGULATIVA
La proteina S (PS) e’ un cofattore della PCa nella inattivazione
dei fattori Va e VIIIa, e’ vitamina K dipendente .
Il 35% della PS circola in forma libera. Questa porzione e’
quella che agisce come cofattore della PC. Il restante 65% e’
legata in modo reversibile alla proteina C4b-BP (binding
protein) appartenente al sistema del complemento. Questo
legame con la PS non modifica l’attivita’ regolatrice della C4bBP nel sistema del complemento.
La PS e’ sintetizzata dal fegato, dalle piastrine e dalle cellule
endoteliali ed e’ escreta dai reni.
C4bBP
PS
IX
TF -VIIa
PS
IXa
VIII
PS
VIIIa
X
PS
Xa
Va
Protrombina
•Agisce come cofattore dell’ aPC nell’inattivazione di FVa e FVIIIa,
eliminando la protezione di FIXa su FVIII e di FXa su FV.
•Da sola inibisce il complesso protrombinasi ed il complesso
attivante il FX con interazione diretta con FVa, FXa, FVIII.
PROTEINA S
Difetti congeniti
LE CARENZE DI PS VENGONO CLASSIFICATE COME:
TIPO I : livelli antigenici ridotti della PS totale e libera con
conseguente riduzione della funzionalita’.
TIPO II : livelli antigenici normali sia della PS totale e libera,
ma riduzione della funzionalita’.
TIPO III: livelli antigenici normali della PS totale ma
riduzione del livello della PS libera e riduzione della
funzionalita’.
PROTEINA S
Difetti Acquisiti
Trattamento con anticoagulanti orali
Gravidanza
Epatopatie
Coagulazione intravascolare disseminata
Diabete
Contraccettivi
Trattamento con l-asparaginasi
Infiammazione
Proteina S Significato Clinico
E’
carente nel 3-5% di pazienti con trombosi
ricorrente.
Il
50% dei pazienti con deficienza congenita
ha il primo evento trombotico prima dei 25
anni.
Trombosi
venosa profonda e prossimale,
embolia polmonare possono intervenire livelli
di Proteina S < 50%.
MODIFICAZIONE ACQUISITE DI AT, PC, PS
Evento acuto
AT, PC, PS
Terapia eparinica
AT
TAO
PC, PS
Epatopatie
AT, PC, PS
Gravidanza
PS, PC
T.estroprogestinica
PS, PC
SINDROME
DA ANTICORPI ANTIFOSFOLIPIDI
La sindrome da anticorpi antifosfolipidi (APS) e’ un disordine
acquisito di origine ignota, caratterizzato da trombosi
arteriose e/o venose e complicanze della gravidanza che si
associano alla presenza nel sangue degli anticorpi
antifosfolipidi ( aPL).
Gli aPL allungano i tempi di coagulazione dei tests fosfolipidedipendenti della coagulazione (LAC), oppure sono evidenziati
mediante tecniche ELISA che utilizzano la cardiolipina o altri
fosfolipidi a carica netta negativa come antigeni in fase solida.
ANTICOAGULANTE TIPO LUPUS
Diagnosi di laboratorio
1)Allungamento di uno o piu’test fosfolipide-dipendenti
(TEST DI SCREENING)
2)Dimostrazione che l’allungamento sia effettivamente
dovuto alla presenza di un anticoagulante circolante
(TEST DI MISCELA)
3)Dimostrazione che l’anticoagulante sia diretto contro
i fosfolipidi
(TEST DI CONFERMA)
ANTICOAGULANTE TIPO LUPUS
Diagnosi di laboratorio
TEST DI SCREENING:
•APTT (Tempo di tromboplastina parziale attivato)
•KCT
(Tempo di coagulazione al caolino)
•dRVVT (Test al veleno di Vipera Russell diluito)
ANTICOAGULANTE TIPO LUPUS
Diagnosi di laboratorio
TEST DELLA MISCELA:
Si esegue con uno dei test di screening e consiste nella
ripetizione del test su una miscela plasma paziente
/plasma normale.
La persistenza del prolungamento del tempo di
coagulazione eseguito sulla miscela (mancata
correzione) suggerisce la presenza di un anticoagulante
circolante.
ANTICOAGULANTE TIPO LUPUS
Diagnosi di laboratorio
TEST DI CONFERMA:
Sono basati sull’incremento o la diminuizione della
concentrazione dei fosfolipidi o sull’uso di fosfolipidi a
conformazione particolare.
Il tempo di coagulazione di un test dipendente dai
fosfolipidi,prolungato per la presenza di LA, si accorcia
sensibilmente fino a correggere quasi completamente il
difetto, se ripetuto aumentando la concentrazione dei
fosfolipidi. Alternativamente il test si prolunghera’ se
viene diminuita la concentrazione dei fosfolipidi.
APC RESISTANCE
Responsabile di circa il 20% dei casi di trombosi
venose consecutive e di circa il 50% dei casi
selezionati come trombosi eredofamiliari.
MAGGIOR FATTORE DI RISCHIO
GENETICO PER TROMBOSI VENOSA
FINORA SCOPERTO
APC RESISTANCE
E’ una malattia ereditaria congenita scoperta da DAHLBACK
nel 1993
I pazienti insensibili all’APC mostrano una diminuzione dello
allungamento dell’APTT in presenza di Proteina C attivata
Un anno piu’ tardi Bertina (Leiden Olanda) scopriva una
anormalita’ nel Fattore V
ATTIVAZIONE DEL FATTORE V
IIa/Xa
NH2
A1
A2
IIa/Xa
Iia/Xa
B
A3 C1 C2
COOH
Fragments
FactorVa
Ca 2+
Heavy chain
94 kDa
ZollerB.,Familial Thrombophilia,1996
74 kDa
Light chain
INATTIVAZIONE FATTORE V
NH2
A1
A2
Heavy chain
B
A3
Thrombin
A1
A3
FV:R506
506
COOH
FV
A2
Ca2+
Light chain
C1 C2
FVa
C1 C2
APC
Ca2+
306
APC
506 679
Ca2+
Zoller B., Familial Thrombohilia,1996
FVi
INATTIVAZIONE FATTORE V
NH2
A1
A2
Heavy chain
B
A3
Thrombin
A1
COOH
A3
FV:R506
506
Ca2+
APC
506 679
Ca2+
Zoller B., Familial Thrombohilia,1996
FV
A2
FVa
Ca2+
Light chain
306
C1 C2
C1 C2
APC
FV:Q506
306
Ca2+
306
Ca2+
APC
679
FVi
FATTORE V:Q506 ( LEIDEN)
Mutazione puntiforme nel nucleotide 1691,esone 10
del gene codificante il FV
CGA
Arginina
CAA
Glutammina
Su un sito che corrisponde ad un sito di clivaggio della APC
APC e’ meno efficiente ad inattivare il FVa
Bertina R M. e altri ,Nature ,1994
MALATTIE TROMBOTICHE EREDITARIE
CARENZA
INCIDENZA
AT
1 – 5%
PC
6 – 9%
PS
3 – 13%
MUTAZIONE F II
APCR
Lane DA.e altri, Thrombosis Haemostasis, 1996
5%
> 20%
APC RESISTANCE
PREVALENZADEL FATTORE V LEIDEN
NELLA POPOLAZIONE GLOBALE EUROPEA
Austria
2%
Italy
0-2%
Finlandia
3%
Netherlands
3-5%
France
1-10%
Poland
1%
Germany
4-8%
Sweden
5-10%
Greece
15%
Spain
3%
Iceland
5%
UK
3-8%
Rees DC e altri ,Lancet ,1995; Rees DC e altri, Br.J. Haematol.,1996
APC RESISTANCE
PREVALENZA IN PAZIENTI TROMBOTICI
ED IN INDIVIDUI SANI
Pazienti con trombosi%
Koster et al.
1993
21
Griffin et al.
1993
52-64
Svensson et al .
1994
40
Cadroy et al.
1994
19
Tosetto et al.
1994
10
Simioni et al.
1997
16.3
Individui sani %
5
7
1.5
1
APC RESISTANCE
DIAGNOSI DI LABORATORIO
PRINCIPIO DEL TEST:
2 APTT su plasma
indiluito del paziente
--in presenza di una quantita’ standardizzata di APC
--in assenza di APC
IL RISULTATO SI ESPRIME IN APC ratio:
t (sec) APTT + APC
t (sec) APTT - APC
Dalback e altri, Proc Nat Acad Sci,1993
APC RESISTANCE
INTERFERENZE
ALLUNGAMENTO DELL’APTT per:
• Difetto di fattori
• Presenza di LAC
• Terapia eparinica
• TAO
AUMENTO DEL FATTORE VIII per:
• Gravidanza
• Fase acuta
• Assunzione di estroprogestinici
de Ronde e Bertina,1994;Hampton e altri,1994;Bokarewa e altri,1994; Ehrenforth e altri,1995; Martorell e
altri,1995