MUTAZIONI NEI GENI
STRUTTURALI II: il connettivo
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Lezione 5
By NA
Osteogenesi Imperfetta (OI)
1/10.000 IN TUTTO IL MONDO
FACIES:
Estrema fragilita’ delle ossa
Ipomineralizzazione
Fraquenti fratture congenite
Sclere bluastre o blu-grigio(l’OI e’ una patologia del tessuto
connettivo e, quindi puo’ coinvelgere tessuti diversi da quello osseo)
(n.b la sclera e’ la parte non trasparente della tunica esterna dell’occhio)
Crescita anomala del cranio e tardiva chiusura della fontanella
anteriore(dopo il primo anno di vita)
Sviluppo intellettivo normale
Dentinogenesi imperfetta
AUTOSOMICA DOMINANTE
By NA
Classificazione clinica
By NA
I
Fratture durante l’infanzia, meno frequenti
dopo la puberta’. Statura normale , deformita’
minima. Sclere bluastre, denti normali. A volte
perdita dell’udito
II
Gravi deformita’ e fratture ossee congenite.
Di solito letale in eta’ perinatale per
insufficienza respiratoria
III
Fratture
congenite
con
progressivo
rallentamento della crescita. Denti anormali,
sclere bluastre, possibile perdita dell’udito
IV
Fragilita’ delle ossa lieve o moderata, denti
anormali, sclere normali o grigiastre, possibile
perdita dell’udito
Genetica dell’OI
AUTOSOMICA DOMINANTE
a
a
Genotipo
omozigote
Fenotipo
Non affetto
By NA
a
A
A
eterozigote
AFFETTI
A
omozigote
Basi biochimiche dell’OI
VISTI GLI ASPETTI FENOTIPICI DEVE DIPENDERE DA
UN DIFETTO DELLA STRUTTURA DEL TESSUTO
CONNETTIVO
OTTIMO CANDIDATO
IL COLLAGENE E’ LA PROTEINA PIU’
ABBONDANTE DEL TESSUTO
CONNETTIVO
By NA
Il collagene
a2
a1
a1
N-term
Dominio a tripla elica
C-term
Esistono tipi diversi di collagene nei vari tessuti. Essi si differenziano
per lunghezza, sequenza dei diversi domini, per composizione e
dimensione dei peptidi C e N terminali e per proprieta’ fisiche.
Il collagene di Tipo I e’ piu’ abbondante in pelle, tendini, ossa e
arterie. Questi sono anche i tessuti maggiomente interessati dalla OI
By NA
Sintesi del
collagene
cfr.testo
By NA
Prove del coinvolgimento del collagene nell’OI
ISOLAMENTO DELLE PROTEINE
PELLET CELLULARE
MEZZO DI COLTURA
COLTURA IN PRESENZA DI 3H-PROLINA
DIVERSA MIGRAZIONE DIVERSA PROTEINA
Le proteine sono state
tagliate e separate per
elettroforesi evidenziando
che un frammento del
proa1(I)
migrava
in
maniera anomala
PROa1(III)
PROa1(I)
SDS-PAGE
PROa2(I)
C’era una delezione nella proteina
By NA
C OI
C OI
Clonaggio del gene di OI1
1979 YAMAMOTO E CO.isolarono il cDNA del COA1
mRNA del collagene e’ stato estratto dal tessuto osseo di embrioni di pollo e frazionati in
base alle dimensioni per centrifugazione su gradiente di saccarosio.
Le diverse frazioni sono state saggiate per la capacita’ di codificare il procollagene in un
sistema acellulare per traduzione.
Dalle frazioni capaci di codificare il procollagene e’ stato costruito il cDNA.
Clonaggio del cDNA nel plasmide pBR322 e successiva trasformazione batterica in E.Coli
Trasferimento delle colonie su filtro e ibridazione con il cDNA marcato radiattivamente.
Isolamento colonie positive.
Verifica con saggio di legame al filtro:
Denaturazione del DNA del clone positivo.
Legame a colonna.
Caricamento della colonna con RNA estratto da ossa di pollo.
Allontanamento dell’RNA non legato ed Eluizione dell’RNA
legato.
Test per la produzione di COA1 mediante traduzione in vitro.
By NA
I tipi di collagene
TRAMITE SCREENING DI LIBRARY GENOMICHE E’ STATO
POSSIBILE ISOLARE DIVERSI GENI PER IL COLLAGENE.
ESISTONO DIVERSE CLASSI DI COLLAGENE:
COLLAGENI FIBRILLARI(DI TIPO I II III V E XI)
COLLAGENI NON FIBRILLARI(i domini a tripla elica sono
interrotti da domini non a tripla elica)
COLLAGENI A CATENA BREVE (TIPO VII)
OGNI CATENA DEL COLLAGENE E’ CODIFICATA DA UN GENE
DISTINTO. QUESTI GENI PRESENTANO OMOLOGIA DI
SEQUENZA ELEVATA.
I GENI PER IL COLLAGENE FANNO PARTE DI UNA FAMIGLIA
GENICA (insieme di geni con un elevato grado di omologia di sequenza e
codificanti per prodotti con funzione simile o correlata. Possono contenere
elemeni non funzionanti detti PSEUDOGENI)
By NA
Origine della famiglia del collagene
Tali geni si sarebbero originati in seguito a fenomeni di DUPLICAZIONE di
un unico gene ancestrale e successiva diversificazione per effetto di
mutazioni nelle diverse copie.
diversificazione
mutazione
geneA
duplicazioni
FAMIGLIA GENICA1
es.collagene fribrillare
By NA
duplicazioni
FAMIGLIA GENICA2
es.collagene a catena breve
Mappatura dei geni del collagene
TECNICHE COME COSTRUZIONE DI IBRIDI SOMATICI E IBRIDAZIONE
IN SITU HANNO PERMESSO DI MAPPARE QUESTI GENI.
SEBBENE DERIVINO DA UN GENE ANCESTRALE COMUNE I
GENI PER IL COLLAGENE SONO DISPERSI NEL GENOMA,
MAPPANO CIOE’ SU CROMOSOMI DIVERSI:
es. il gene per la catena a1(I)(COA1) e’ localizzato sul chr17,
mentre esistono geni per altre catene del collagene sui
cromosomi 2, 7, 12 etc.
E’ VERAMENTE UNA MUTAZIONE
IN UNO DI QUESTI GENI A
PROVOCARE L’OI????
By NA
L’identificazione di mutazioni nel gene del collagene in casi di OI ha richiesto
complesse analisi di linkage tramite polimorfismi di lunghezza dei frammenti di
restrizione(RFLP)
 RFLP:
Variazione della sequenza nucleotidica che interessa il sito di riconoscimento
di un enzima di restrizione
Enzima Enzima
A
A1
B1
B2
A1
B1
B2
endonucleasi A
By NA
A2
B
A3
A3
mutazione
elimina il sito
di restrizione
endonucleasi B
Pattern di ibridazione su
filtro
Studi di linkage
Il cDNA di COL1A2 venne testato nella popolazione generale (normale) per individuare
la presenza diRFLP
EcoR1
cDNA COL1A2
14Kb
A1
A2
cDNA COL1A2
3.5Kb
A1
A3
10.5Kb
A2
Se si digerisce il DNA genomico di individui
normali che non mostrano la OI presi a caso
nella popolazione e si ibrida con il cDNA di
COL12A si nota che la regione omologa al
cDNA e’ polimorfica: cioe’ nel DNA puo’ essere
presente o meno un sito di restrizione. Questo
si nota nella popolazione normale.
By NA
GEL
filtro ibridato con cDNA
In questo gruppo di individui il cDNA
riconosce nel genoma dopo digestione 2
frammenti di = lunghezzae’: 14 kb
perche’ su entrambi i cromosomi in quella
regione non e’ presente un altro sito
QUINDI UNA SOLA BANDA
In questo gruppo di individui il cDNA
riconosce nel genoma dopo digestione 4
frammenti 2 da 10.5 e 2 da3.5 kb
perche’ su entrambi i cromosomi in quella
regione e’ presente un altro sito che
cade all’interno della regione identificata
dal cDNA. QUINDI 2 BANDE
A1
A1
14Kb
14Kb
A2
A2
3.5Kb
10.5Kb
3.5Kb
10.5Kb
A1
A1 A3
A2
A2
In questo gruppo di individui il cDNA
riconosce nel genoma dopo digestione 3
frammenti : 1 da 10.5 e 1 da3.5 kb
originati dalla digestione di un cromosoma A1 14Kb
A2
(perche’e’ presente un altro sito che
cade all’interno della regione identificata
dal cDNA) e 1 frammento da 14
originato dalla digestione dell’ altro
3.5Kb
10.5Kb
cromosoma. QUINDI 3 BANDE
By NA
A1 A3
A2
Omozigoti
per allele
14:14/14
Omozigoti
per
allele
10.5,3.5:
10.5,3.5/
10.5,3.5
Eterozigoti per
alleli
14 e10.5,3.5
14/10.5,3.5
I
Famiglie OI1
-/-
1
-/+
2
II
-/-
1
-/+
2
-/-
3
-/-
4
-/+
5
-/-
6
III
1
-/-
2
-/-
3
4
-/+
-/+
5
-/+
6
-/+
IV
-/-
1
-/-
2
+/+
3
Il polimorfismo non rappresenta la causa
dell’OI, ma e’ inprobabile che tale variazione
segreghi con il fenotipo OI per caso...
By NA
-/+
4
LA MUTAZIONE OI DEVE RISIEDERE INSIEME
CON IL POLIMORFISMO, CIOE’ NEL GENE
COL1A2