MISURE BIOELETTRICHE
Misura del potenziale di membrana e
del trasporto ionico
attraverso epitelio isolato di rana
GENESI DEL POTENZIALE DI MEMBRANA
Il potenziale di membrana è una differenza di potenziale
(d.d.p.) elettrico che si misura ai due lati di una membrana
plasmatica.
Questa d.d.p. è stabile nel tempo (tranne nelle cellule
eccitabili), dura per tutta la vita cellulare ed è fondamentale
per tutti i fenomeni cellulari.
DE = - 80 - -90 mV
(lato int. negativo, lato est. positivo)
La genesi di questa d.d.p. è legata all’esistenza di un
disequilibrio ionico tra ambiente intra ed extracellulare.
Per spiegare il potenziale di membrana dobbiamo considerare
due questioni:
(1) La prima è la facilità con la quale le particelle cariche (Na+,
K+ ecc.) possono muoversi attraverso la membrana.
Questa facilità è influenzata dal numero e dal tipo di canali
ionici presenti nella membrana, che determinano la
permeabilità della membrana agli ioni.
(2) La seconda è la concentrazione degli ioni all’interno e
all’esterno della cellula (fluido intra ed extracellulare).
Il potenziale di membrana è un potenziale di diffusione, poiché gli
ioni hanno diversa mobilità (cofficiente di permeabilità del Na+ << K+).
LEGGE
DI
HODGKINKATZ
RT ln Pk[K+]e + PNa [Na+]e
DE =
F
Pk[K+]i + PNa [Na+]i
Se i due coefficienti di permeabilità (P) fossero uguali non avremmo
polarizzazione della membrana:
la tendenza del K+ ad uscire dalla cellula più velocemente del Na+,
polarizza negativamente la membrana , attrae il Na+ e favorisce il suo
ingresso.
Come mai il potenziale di membrana non va a zero?
int
+
est
-
K+
2K+
Na+
ATP-ase
3Na+
La pelle di rana è oggi considerata un modello ideale per lo studio dei fenomeni
bioelettrici e di trasporto epiteliale.
Vantaggi:
 facilmente isolabile
 sopravvive per molte ore in vitro sotto ossigenazione con aria atmosferica a t.a.
 può essere usata come membrana di separazione tra due soluzioni
sperimentalmente manipolabili con semplicità.
EPITELIO PLURISTRATIFICATO
AD ALTA RESISTENZA ELETTRICA
ambiente esterno
ambiente
interno
ambiente esterno
membrana
plasmatica
ambiente
interno
CELLULA PROCARIOTE:
membrana plasmatica
CELLULA EUCARIOTE:
membrana plasmatica
e membrane intracellulari
ambiente esterno all’organismo
membrana apicale
giunzione intercellulare
membrana basolaterale
ambiente interno dell’organismo
membrana epiteliale:
membrane plasmatiche in serie
LE VIE DI PERMEAZIONE TRANSEPITELIALI
VIA INTRACELLULARE
VIA INTERCELLULARE
Trasportano soluz. isotoniche a elevata velocità senza sviluppare gradienti osmotici.
R intercellulare 10-100
volte < R cellulare
Trasportano soluz. ipertoniche a bassa velocità o isotoniche a maggiore velocità
R intercellulare =
o > R cellulare
strato corneo
pluristrato
La pelle di rana è un tessuto molto umido, viscido per la
presenza di un sistema ipersecretorio di muco e di altre sostanze.
RANE VELENOSE: Fam. Dendrobatidi, gen. Phyllobates
Poiché la cute di questi
animali
rappresenta
un
perfetto substrato per la
crescita dei microrganismi
patogeni (batteri e funghi), le
ghiandole cutanee hanno
sviluppato la capacità di
secernere tossine che agiscono
da antibiotici proteggendoli
dalle infezioni.
Questi
veleni
(alcaloidi)
venivano
utilizzati
dai
cacciatori
indios
per
avvelenare le frecce.
BATRACOTOSSINE
Sono le più potenti tra le tossine non proteiche di origina naturale.
Fanno aumentare selettivamente la permeabilità della membrana
esterna delle cellule nervose e muscolari agli ioni sodio:
depolarizzazione elettrica irreversibile (aritmie cardiache,
fibrillazione, collasso).
Il legame della tossina ai canali del Na+ ne impedisce la normale
chiusura : le cellule nervose non riescono più a trasmettere impulsi
e quelle muscolari restano in uno stato attivo, contratto.
EPITELIO DI RANA
organo osmoregolatore
Negli anfibi l’acqua rappresenta circa il 75% del peso totale del
corpo.
Sulla terraferma con l’evaporazione perdono acqua attraverso la
pelle e tornano in acqua per non disidratarsi .
H2O
ambiente est
TRASPORTO ATTIVO
di Na+
reni
di
mammifero
(stagno)
ambiente int
(sangue)
IPEROSMOTICO
sali
H2O
Frog skin -- a functional analog of the distal
tubule
• Many functions
• Epithelial tissue
• Uptake of NaCl across the body surface against a great gradient of
electrochemical potential
• The mechanism of Na + transport is similar to that of the distal
tubule
FUNCTIONS OF THE KIDNEYS
• Regulation of body fluid osmolarity and volume
• Regulation of electrolyte balance
• Regulation of acid-base balance
• Excretion of metabolic products and foreign substances
• Production and secretion of hormones
• Gluconeogenesis
Excretion
• Metabolic end products:
– Urea (from amino acids)
– Uric Acid (from nucleic acids)
– Creatinine (from muscle creatine)
• Foreign substances
Struttura del rene
Basic renal processes
1. Glomerular filtration
all low MW substances are filtrated
GFR ~180L/day
2. Tubular secretion
H + , K + , foreign chemicals
3. Tubular reabsorption
Final urine ~1.5L/day, >99%
reabsorbed
Distal Tubule and Collecting Duct
• Most important in the final regulation of salt and water balance
• Reabsorb only 12% of the glomerular filtrate
• The sites where the hormones and other factors affect
Study of transepithelial transport
• Asymmetry of the epithelial tissue
• Apical surface: faces the non-blood supply surface
• Basolateral surface: faces the blood supply surface
• Vectorial transport
est
K+
Na+
-
membrana apicale
ddp=50-100 mV
ATP-ase
2K+
membrana basolaterale
ATP
ADP + Pi
+
3Na
+
int
Short-Circuit Method of Ussing and Zerahn (1950)
• Si bagna l’epitelio simmetricamente con una
soluzione Ringer per eliminare il gradiente di
concentrazione.
• Si esegue un Voltage-clamp del tessuto per azzerare il
gradiente elettrico dell’epitelio.
• Si misura la corrente di corto circuito, che è
generata soltanto dal trasporto ionico attivo.
USSING studiò il modo di calcolare, a partire dalla d.d.p., la
quantità di Na+ trasportato attraverso l’epitelio.
La corrente non può essere misurata direttamente con un
amperometro, in quanto presenta una resistenza interna > di quella
del tessuto.
Si ricorre al metodo della CORTOCIRCUITAZIONE: consiste nel
far passare attraverso il tessuto una corrente elettrica opposta
(CORRENTE DI CORTO CIRCUITO, CCC) in grado di
azzerare il potenziale elettrico misurato col voltmetro.
La CCC corrisponde esattamente al trasporto attivo di Na+
transepiteliale.
Lab procedures
I. Dissect frog skin (ventral skin)
II. Prepare salt bridge electrodes
III. Connect the chamber/base to the voltage clamp
IV. Put the skin between the chambers
V. Install salt bridge electrodes
VI. Record data
CAMERETTE DI USSING
e
i
ELETTRODI A CALOMELANO: non vengono posti direttamente nella soluzioni di
incubazione perché contengono KCl 2.7M, circa 500 volte quello della soluzione Ringer e
produrrebbero la morte cellulare.
Ciascuna boccetta in cui è immerso l’elettrodo viene collegata alla soluzione
fisiologica mediante un ponte di agar, ossia un tubicino riempito con soluzione fisiologica
intrappolata nel gel.
Soluzione Ringer (mM): NaCl 112, KCl 5, CaCl2 1, NaHCO3 2.5,
pH 8.1.
Soluzione fisiologica con le stesse concentrazioni ioniche del liquido
interstiziale, gorgogliata con aria atmosferica, per assicurare l’apporto di
O2 e CO2 .
Quest’ultima contribuisce a formare il tampone acido carbonico
/bicarbonato che mantiene il pH della soluzione fisiologica stabile al
valore 8.1.
ELETTRODI DI PLATINO: posti direttamente nelle soluzioni di
incubazione di ciascuna emicamera e servono per inviare la CCC.
Poiché la d.d.p. è dovuta al trasporto di Na+, l’entità della
CCC sarà proporzionale al trasporto di Na+.
I parametri elettrici dell’epitelio sono d.d.p. transepitaliale e CCC.
Sapendo che:
Amper= coulomb/sec
96500 coulomb=1 F (quantità di carica trasportata da 1 mole di ioni)
V= R x I (I legge di Ohm)
Dai valori misurati si possono calcolare:
Rt = d.d.p. (mV) x sup (cm2) =  cm2
CCC (mA) x 10-3
Na = CCC (mA) x 3600 (sec h-1) = mEq cm-2 h-1
96500 (coulomb mole-1) x sup (cm2)
L’attività di trasporto può essere influenzata essenzialmente in 2 modi:
1. Agendo sui canali del Na+ presenti sulla membrana apicale
- ormoni neuroipofisari (ADH, ormone antidiuretico o vasopressina) esaltano il
trasporto di Na+ .
Na+ H2O urea
ATP
AMPc
GTP
G
G
AC
GDP
ADH
Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH2
• Sintetizzato nel nucleo sopraottico dell’ipotalamo
• Secrezione regolata da variazioni osmotiche (> osmolalità del plasma)
o riduzione del volume ematico
L’attività di trasporto può essere influenzata essenzialmente in 2 modi:
1. Agendo sui canali del Na+ presenti sulla membrana apicale
- ormoni neuroipofisari (ADH, ormone antidiuretico) esaltano il trasporto di Na+ .
- diuretici (come l’amiloride) sono invece inibitori+ specifici dei canali del Na+ e
Na
ne bloccano il trasporto passivo .
2. Inibendo l’attività della pompa Na/K ATPasi sulla membrana basolaterale
- l’ouabaina è un inibitore competitivo del K+ che entra in cellula attraverso
la membrana basolaterale e blocca la pompa determinando un accumulo di
Na+ in cellula.
ATP-ase
2K+
3Na+
Na+
ATP
AMPc
GTP
G
G
AC
GDP
ADH
Na+
Na+