L’AZIONE DI UNO XENOBIOTICO DIPENDE
raggiungimento
mantenimento
di adeguate concentrazioni nella sede in cui va ad agire
dalla quantità di xenobiotico
dalla entità e dalla velocità dei processi di:
entità e velocità dipendono dalle
proprietà chimico-fisiche degli xenobiotici
e sono condizionate dalla via di ingresso
ASSORBIMENTO dipende in gran parte dalla
dal flusso ematico locale
DISTRIBUZIONEliposolubilità,
e dal legame alle proteine plasmatiche
METABOLISMO
ESCREZIONE
in forma immodificata se idrosolubili,
composti trasformati se liposolubili
trasformazione
di una sostanza
in composti, i metaboliti, più idrosolubili
le reazioni metaboliche sono più facilmente eliminabili
catalizzate da enzimi presenti
soprattutto a livello epatico,
sono essenzialmente di due tipi:
REAZIONI DI FASE I o Fase di Funzionalizzazione
idrolisi
riduzione
ossidazione
REAZIONI DI FASE II o Fase di Coniugazione
glucuronoconiugazione
acetilazione
solfatazione
metilazione, etc.
BIOTRASFORMAZIONE
DI XENOBIOTICI
FEGATO
è l’organo primario per le trasformazioni
(fisiologicamente deputato a modificare i nutrienti introdotti con la dieta)
POLMONI, INTESTINO, RENI
le trasformazioni degli xenobiotici determinano
metaboliti inattivi
(l’organismo cerca di proteggersi)
metaboliti più attivi
metaboliti attivi o tossici
(eroina
(profarmaci)
morfina; paracetamolo)
Data la natura enzimatica delle trasformazioni metaboliche,
gli enzimi devono essere caratterizzati da una
grande adattabilità alla struttura di un substrato
così variabile come imprevedibile
Questa versatilità è ottenuta con uno o più dei seguenti fattori
GENETICI: differenze di specie e individuali
polimorfismo genetico nell'acetilazione;
polimorfismo genetico nell'ossidazione; idrolisi
FISIOLOGICI:età (nel neonato la capacità metabolica epatica è ridotta;anche
l'anziano presenta una ridotta capacità di biotrasformazione),
sesso, gravidanza
fenomeni di accumulo
PATOLOGICI: insufficienza epatica (riduzione di enzimi epatici,digestivi)
AMBIENTALI: fattori voluttuari (fumo, alcool), accidentali (contaminati
dell’aria, acqua etc.), farmaci
induzione e inibizione metabolica
FLORA BATTERICA: bioattivazione di precursori inattivi
(es. cancerogeni da precancerogeni).
INTESTINALE
attività epatica di coniugazione dei farmaci
IL METABOLISMO DEI FARMACI DIPENDE DALL’ETÀ
ontogenesi del metabolismo epatico
pubertà
nascita
adulto
anziano (> 65 anni)
età
sono maggiormente deficitarie
le reazioni di ossidazione e la
coniugazione con acido glucuronico
riduzione della massa epatica
correlazione tra metabolismo del diazepam ed età
emivita, t ½(b), ore
100
80
60
40
20
0
10
20
30
40
50
60
70
80
età in anni
DIFFERENZE NEL METABOLISMO TRA I DUE SESSI
Maggiore attività
CYP3A4 (verapamil, diazepam, prednisolone)
Minore attività
CYP2D6 (propanololo)
CYP2C19 (piroxicam)
CYP1A2 (caffeina)
alcool-deidrogenasi gastrica
etil-esterasi (cocaina)
glucuronazione (morfina, aspirina, digossina)
ENZIMI IMPLICATI NELLA BIOTRASFORMAZIONE
xenobiotico
fattore che
determina
l’intensità ENZIMI
di azione
fattore che
determina
ENZIMI la durata
di azione
termine degli effetti della sostanza e attenuazione della tossicità
nomenclatura
I singoli enzimi non possono essere denominati in base alle reazioni catalizzate
avendo scarsa specificità di substrato
sistemi arbitrari di nomenclatura che
si basano sulla sequenza primaria di aminoacidi dei singoli enzimi
distribuzione
Sono ampiamente distribuiti nell’organismo
il fegato è la sede più ricca di attività enzimatiche di biotrasformazione;
presentano gli stessi enzimi anche : cute
reni e ghiandole surrenali
polmoni
pancreas
livello delle
mucosa nasale
principali vie
cuore
cervello flora batterica intestinale occhio
di esposizione
tratto-gastrointestinale
plasma e cellule ematiche
mitocondri
Sono localizzati in vari compartimenti subcellulari
principalmente nel reticolo endoplasmatico (microsomi)
(poiché molti xenobiotici sono lipofili)
citosol
nucleo
lisosomi
DISTRIBUZIONE DEGLI ENZIMI
La biodisponibilità sistemica delle sostanze ingerite è limitata da
(“eliminazione presistemica” o “eliminazione in 1° passaggio”)
mediante estrazione e biotrasformazione di ciò
che viene assorbito nel tratto gastrointestinale
MUCOSA GASTRICA
es. ossidazione dell’alcool ad acetaldeide
Alcuni distretti extraepatici hanno contenuti abbastanza
elevati di enzimi di biotrasformazione degli xenobiotici
tuttavia
se la dimensione di questi organi è modesta il contributo
complessivo al processo di biotrasformazione è trascurabile
Un ruolo importante nelle biotrasformazione solo delle sostanze inalate è svolto
EPITELIO DELLA MUCOSA NASALE
pur contenendo quantità di
enzimi di biotrasformazione
non dissimili dal fegato,
Il fatto che i tessuti differiscono nella loro capacità di
biotrasformare gli xenobiotici ha importanti implicazioni tossicologiche,
specie per quanto riguarda la selettività del danno
Nell’ambito di uno stesso organo, le cellule possono avere
differente capacità di biotrasformare gli xenobiotici
e questa eterogeneità ha anch’essa implicazioni rilevanti
OGNI XENOBIOTICO PUÒ DARE ORIGINE
A PIÙ DI UN METABOLITA
xenobiotico
METABOLISMO DEGLI XENOBIOTICI
La biotrasformazione di uno xenobiotico può portare alla formazione di:
l’esempio del paracetamolo
REAZIONI DI BIOTRASFORMAZIONE
DEGLI XENOBIOTICI
Il metabolismo degli xenobiotici si attua attraverso due fasi
Es. morfina, eroina e codeina sono tutte convertite in morfina-3-glucuronide
la coniugazione con acido glucuronico è preceduta dalla Fase I
per diretta coniugazione della sostanza con acido glucuronico
alcuni xenobiotici (morfina)
subiscono direttamente
il metabolismo di Fase II
xenobiotico
Fase I
ossidazione,
riduzione
idrolisi
Fase II
prodotti di
coniugazione
lo xenobiotico coniugato
è solitamente inattivo
a seguito della Fase I lo xenobiotico
può risultare attivato, immodificato o,
nella maggior parte dei casi, inattivato
Le reazioni di Fase I hanno la finalità di inserire o mettere in evidenza
nella molecola gruppi funzionali come –OH, -NH2, -COOH
Le reazioni di Fase II usano i gruppi funzionali inseriti nelle reazioni di
Fase I come un “terminale” per la coniugazione con molecole endogene
VIE DI BIOTRASFORMAZIONE
DEGLI XENOBIOTICI
Reazione
Localizzazione
Enzima
FASE I
Idrolisi
carbossilesterasi
peptidasi
epossido-idrolasi
microsomi, citosol
sangue, lisosomi
microsomi, citosol
Riduzione
di azo- e nitrogruppi
di gruppi carbonilici
di gruppi disolfuro
di gruppi solfossido
di chinoni
dealogenazione
flora int., microsomi, citosol
citosol
citosol
citosol
citosol, microsomi
microsomi
Ossidazione
alcool deidrogenasi
aldeide deidrogenasi
aldeide ossidasi
xantina ossidasi
monoaminossidasi
diaminoossidasi
prostaglandina H sintasi
monoossigenasi flavinica
è la più frequente citocromo P 450
citosol
mitocondri, citosol
citosol
citosol
mitocondri
citosol
microsomi
microsomi
microsomi
FASE II
coniugazione glucuronica
coniugazione solforica
coniugazione con glutatione
coniugazione con aminoacidi
acetilazione
metilazione
microsomi
citosol
citosol, microsomi
citosol, microsomi
mitocondri, citosol
citosol
citosol
microsomi
mitocondri
DNA
membrana
nucleare
REAZIONI DI FASE I: IDROLISI
CARBOSSILESTERASI
Sono presenti in molti tessuti e nel plasma.
Idrolizzano numerosi composti endogeni:
O
H2C O C
HO C H
monoacil-glicerolo
CH2OH
O
O
H2C O C
C O C H
CH2OH
…
diacil-glicerolo
altri lipidi esterificati
Idrolizzano anche molti xenobiotici
scarsa specificità
possono idrolizzare non solo esteri
REAZIONI DI FASE I: IDROLISI
idrolizzano xenobiotici
aventi gruppi funzionali del tipo:
CARBOSSILESTERASI
O
H2C
O
CH3
O
CH2
N
C H3
CH2
CH2
OH
H2O
H2N
HO
H2N
ESTERE DI ACIDO CARBOSSILICO
(procaina ) ( viene rapidamente inattivata nel sangue)
CH3
anestetico locale O
HC
CH2
N
C H3
CH2
CH2
OH
H2O
H2N
CH3
C H2
N
CH3
CH2
C H2
O
2
NH
+
H2C
+
N
H2
H2N
H2C
CH3
C H2
N
CH3
CH2
C H2
(l’idrolisi enzimatica, come in vitro, è più lenta della procaina: a parità di
AMIDE
(procainamide)ingombri sterici, RNH è un gruppo uscente meno favorevole di RO dell’estere,
aritmie cardiache è in grado di mantenersi attiva dopo aver raggiunto il circolo sistemico)
L’azione delle carbossilesterasi influenza durata e sede di attività di certi farmaci
O
O
O
H3C
C H3
H2O
H
H
O
H
S
O
H3C
C H3
O
H
H
H
O
C H3
SH
+
O
HO
C H3
(notare che l’anello lattonico-un estere ciclico-rimane integro. Ciò a causa della
TIOESTERE
maggiore stabilità dei sistemi ciclici: la struttura aperta è ottenibile solo in
(spironolattone) ambiente nettamente alcalino [pH > 8] nella forma HO-(CH ) COO-M+)
2 n
NO2
O
O P O
O
H3C
H2O
O
O P O-H
O
H3C
H3C
H3C
+
NO2
H-O
(alcuni pesticidi organofosforici sono detossicati da
ESTERE DI ACIDO FOSFORICO
(paraoxon: dietil-p-nitrofenil fosfato)citpcromo P450, monoossigenasi flaviniche,
glutatione S-transferasi)
pesticida organofosforico
O
iP r-O
P
F
H2O
iP r-O
ANIDRIDE ACIDA
(diisopropilfluorofosfato DFP)
O
iP r-O
P
iP r-O
OH
+
H-F
CARBOSSILESTERASI
t u t t a v i a,
la presenza di sostituenti che sottraggono elettroni
indebolisce il legame amidico rendendo la molecola
più suscettibile all’idrolisi enzimatica
carbossilesterasi sierica
nota come
succinilcolina
agente
miorilassante
pseudocolinesterasi
durata d’azione
anestetico
circa il 2% tra i caucasici
è geneticamente
carente dell’enzima
prolungato blocco neuromuscolare
apnea
CARBOSSILESTERASI
non sempre il metabolismo degli xenobiotici da parte
delle carbossilesterasi comporta detossificazione
in presenza di un alcool,
possono catalizzare la trans-esterificazione degli xenobiotici:
etanolo
O
H3C
N
C
ESTERE ETILICO
(etilcocaina)
O
CH3CH2OH
OCH3
H3C
N
tossico
OCH2CH3
C
O
O
O C
CH3CH
metanolo
O C
attivazione metabolica
ESTERE METILICO
(cocaina)
La cocaina ed alcuni suoi metaboliti
vengono idrolizzati da una carbossilesterasi epatica che
in presenza di etanolo proveniente da bevande alcoliche,
produce trans-esterificazione trasformando
il gruppo carbossimetilico in carbossietilico
COCAINA-COOCH3
COCAINA-COOCH2CH3
gli esteri etilici
sono ancora più attivi e lipofili
incremento di attività e tossicità epatica
MORTALE (ad alti dosaggi e in presenza di etanolo)
CARBOSSILESTERASI
non sempre il metabolismo degli xenobiotici da parte
delle carbossilesterasi comporta detossificazione
O
O
CH3O-C-CH2CH2-C-OCH3
dimetilestere dell’acido succinico
carbossilesterasi
2 x CH3OH
metanolo
HOOC- CH2-CH2-COOH
acido succinico
epitelio nasale
degenerazione dell’epitelio
O
CH3-C-O-CH-CH2
acetato di vinile
carbossilesterasi
O
CH3-C-OH
acido acetico
O- CH-CH3
acetaldeide
legame covalente con
DNA e proteine
tumori nasali
CARBOSSILESTERASI
non sempre il metabolismo degli xenobiotici da parte
delle carbossilesterasi comporta detossificazione
O
N
CH3
C
N
CH3
CH3
1,3-dimetil-3-fenil-1-nitrosurea
carbossilesterasi
O
N
C
OH
[HO- N
N-CH3]
metildiazonio idrossido
CH3
acido N-metil-N-fenilcarbammico
legame covalente
con il DNA
tumori cutanei
CARBOSSILESTERASI
non si ha ancora una classificazione sistematica
La limitata specificità di substrato preclude la possibilità di denominare
questi enzimi in base alle reazioni che catalizzano.
Aldridge (1953) ha classificato le carbossilesterasi in base alla natura
delle loro interazioni con gli organofosforici
ESTERASI A
idrolizzano gli
organofosforici
(contengono un residuo
di cisteina nel sito attivo)
ESTERASI C
ESTERASI B
sono inibite dagli
organofosforici
non interagiscono con
organofosforici
(contengono un residuo
di serina nel sito attivo)
In realtà il termine carbossilesterasi è in un certo senso poco appropriato
perché questi enzimi possono agire anche come amidasi o fosfatasi
REAZIONI DI FASE I: IDROLISI
PEPTIDASI
Molti enzimi vengono sintetizzati come zimogeni (proenzimi), precursori inattivi.
L’attivazione consiste nella rimozione di una piccola parte della catena
polipeptidica, a opera di peptidasi specifiche.
CARBOSSIPEPTIDASI
AMINOPEPTIDASI
ENDOPEPTIDASI
R
COOH
C
NH
H
aa carbossiterminale
O
H
C
C
NH
…
…
NH2
catena polipeptidica
OH
aa aminoterminale
aa endopeptidici
l’idrolisi è rapida se il
residuo carbossiterminale
ha una catena R aromatica
o alifatica lunga
TRIPSINA (spezza il legame peptidico sui carbonili Lys o Arg)
CHIMOTRIPSINA (spezza il legame peptidico ai carbonili della Phe, Trp o Tyr)
REAZIONI DI FASE I: IDROLISI
trans addizione di H2O agli
epossidi alchenici o ossidi arenici (oxirani)
EPOSSIDO IDROLASI
sono stereoselettive
fornendo trans-dioli
importante ruolo nella detossificazione
la notevole reattività degli epossidi
è dovuta alla deformazione
degli angoli di legame
dai normali valori di 109° a circa 60°
C
O
H
CH2
O H
H
stirene 7,8-epossido
+ H 2O
+ H 2O
H
C
naftalene 1,2-ossido
CH2OH
H
HO H
OH
H
stirene 7,8-glicole
naftalene 1,2-diidrodiolo
Nel corso del metabolismo ossidativo di composti olefinici e aromatici si formano
epossidi reattivi che costituiscono un substrato per l’epossido idrossilasi
REAZIONI DI FASE I: IDROLISI
Gli epossidi, in assenza di idrolasi o glutatione e glutatione EPOSSIDO IDROLASI
transferasi che fornisce un addotto nettamente più idrofilo
inerte e facilmente coniugabile con acido glucuronico come a-glicole,
potrebbero attaccare proteine e DNA innescando processi di mutazione e cancerogenesi
Es. alta attività cancerogena del benzo[a]pirene (idrocarburi aromatici policiclici)
sono trasformati dal citocromo P450
in numerosi ossidi arenici che
stabiliscono legami covalenti con il DNA
Regione di baia
12
RUOLO
“TOSSICANTE”
1
2
11
10
P450
epossido
idrolasi
3
9
8
7
6
O
(+)benzo[a]pirene7,8-ossido
5
epossido
idrolasi
benzo[a]pirene
4,5-ossido
O
HO
OH
(-)benzo[a]pirene7,8-ddidrodiolo
RUOLO
DETOSSICANTE
P450
O
P450
PHS
HO
4
benzo[a]pirene
è un esempio di diolo epossido
di regione di baia
OH
(+)benzo[a]pirene
7,8-diidrodiolo-9,10-ossido
è più potente del benzo[a]pirene
resistente alla riduzione
prodotta dalla epossido idrolasi
OH
OH
benzo[a]pirene
4,5-diidrodiolo
• altamente mutageno da test sui batteri
(perché manca l’epossido idrolasi)
• poco mutageno nelle cellule di mammifero
legame covalente con il DNA
mutazione del 12° codone
dell’oncogene Hras
tumori del polmone e della cute
Una caratteristica comune di tutti gli epossidi di regione di baia è la loro resistenza alla
epossido idrolasi dovuta all’impedimento sterico da parte di un vicino gruppo diidrodiolico
REAZIONI DI FASE I: IDROLISI
È tra gli enzimi inducibili
della frazione microsomiale del fegato
EPOSSIDO IDROLASI
La sua induzione è associata a quella del citocromo P450
È distribuito in quasi tutte le sedi:
nel FEGATO esistono 3 forme
immunologicamente distinte per Western blot
prodotti da geni distinti
con diversa specificità di substrato
reticolo endoplasmatico
citosol
reticolo endoplasmatico
Nel sito attivo è presente un residuo basico
His431
+
H+-O-H
OH-
nucleofilo
sull’atomo di C
più accessibile
dell’anello ossiranico
REAZIONI DI FASE I: RIDUZIONE
REDUTTASI
più o meno specifiche
i substrati più comuni ed i relativi prodotti di riduzione sono:
Substrato
Prodotti di riduzione
Ar-N=N-Ar
Azocomposti
Ar-NH-NH-Ar
Idrazocomposti
2 Ar-NH2
Arilammine
Ar-NO2
Nitroderivati
Ar-NO
Nitrosoderivati
Ar-NHOH
Arilidrossilamine
R-CHO
Aldeidi
Alcoli I
R-COO
Chetoni
Alcoli II
R-S-S-R
Disolfuri
2 R-SH
Tioli o mercaptani
R-SO2-R
Solfoni
R-SO-R
Solfossidi
Chinoni
Idrochinoni
ArNH2
R-S-R
Solfuri
Alogenoalcani
Elementi inorganici
(es. arsenico pentavalente)
Le sostanze esogene contenenti gruppi funzionali riducibili vengono ridotte dagli enzimi
microsomiali e citoplasmatici.
Le sostanze esogene assunte per via orale possono essere ridotte già dai batteri intestinali.
Anche nella riduzione si possono formare metaboliti tossici.
A tutte le reazioni di riduzione è comune il fatto che gli enzimi partecipanti trasferiscono
inizialmente 2 equivalenti di H dal cofattore NADH o NADPH alla molecola esogena.
A seconda dei gruppi funzionali l’H:
rimane ligato alla molecola esogena
(alchene, azocomposto o chinone)
provoca l’eliminazione di un atomo di O
(nitrocomposti e N-ossidi)
REAZIONI DI FASE I: RIDUZIONE
REDUTTASI
AZO- e NITROGRUPPI
operate da batteri intestinali
catalizzate da 2 enzimi epatici: citocromo P450 e NADPH-chinone ossidoreduttasi
(flavoproteina del citosol nota come DT-diaforasi)
richiedono NADPH e sono inibite dall’ossigeno (ambiente anaerobico del digerente)
AZO- RIDUZIONE
NH2
N
N
NITRO- RIDUZIONE
SO2NH2
NO2
prontosil
NH2
nitrobenzene
[4H]
[2H]
NH2
N H2 + H2N
NH2
1,2,4-triaminobenzene
SO2NH2
NO
sulfanilamide
(principio attivo)
nitrosobenzene
[2H]
NHOH
fenilidrossilamina
[2H]
NH2
anilina
importanza tossicologica
REAZIONI DI FASE I: RIDUZIONE
GRUPPI CARBONILICI nel sangue e citosol di:
fegato
(aldeidi e chetoni)
CARBONIL- REDUTTASI
i loro substrati fisiologici
sono le prostaglandine
rene
cervello
etc.
ridotti anche dalla
alcool deidrogenasi
sono presenti carbonil-reduttasi ad alta e bassa affinità
la cui attività varia anche di 10 volte da un individuo all’altro
REDUTTASI
GRUPPI DISOLFURO
nel citosol
Alcuni disolfuri vengono ridotti e scissi nei rispettivi componenti sulfidrilici
Es. riduzione del gruppo disolfuro nella biotrasformazione del disulfiram (Antabuse)
S
C2H5
N
C2H5
C S
S
S
C
C2H5
N
2X
C2H5
disulfiram
C2H5
C2H5
S
N
C SH
dietiltiocarbammato
Es. riduzione glutatione dipendente dei gruppi disolfuro di xenobiotici
GSH
XSSX
XSH
GSH
XSSG
glutatione-S-transferasi
XSH
NADPH + H+
GSSG
glutatione-S-transferasi
GSH, glutatione
XSSX, disolfuro dello xenobiotico
GSSG, glutatione ossidato
NADP+
glutatione reduttasi
2GSH
REAZIONI DI FASE I: RIDUZIONE
REDUTTASI
SOLFOSSIDO e N-OSSIDO
nel citosol di:
fegato
rene
a n a l o g a me n t e
generati per ossidazione da parte del
citocromo P450 o monoossigenasi flaviniche
la riduzione dei gruppi N-ossido
può far tornare indietro
l’effetto della N-ossigenazione delle amine
formate dalle monoossigenasi flaviniche
la riduzione dei gruppi solfossidi
può far tornare indietro
l’effetto della solfossidazione
possono prolungare quindi
l’emivita di certi xenobiotici
NADPH-CHINONE OSSIDO REDUTTASI
DT-DIAFORASI
CHINONI
flavoproteina
citosolica
idrochinoni
Al pari dei chinoni sono substrati anche numerosi agenti potenzialmente tossici
(epossidi chinonici, chinonimmine, azo-composti e C-nitroso derivati da arilamine)
Nell’uomo questi enzimi
sono codificati da
4 distinti loci genici
(DIA1 fino a DIA4)
Il 4° locus codifica la NQ O1 è inducibile
responsabile di gran parte dell’attività nei tessuti umani
NQ O2 è non inducibile espresso in modo polimorfico
NADPH-CITOCROMO P450 REDUTTASI
CHINONI
flavoproteina
microsomiale
radicale libero
semichinonico
REAZIONI DI FASE I: RIDUZIONE
REDUTTASI
DEALOGENAZIONE nei microsomi
(F, Cl, Br, I dalle sostanze alifatiche)
DEALOGENAZIONE RIDUTTIVA (es. CCl4, fluotano)
X X
+ 2H
X-C-C-X
XH
- HX
X X
X-C-C-H
XH
penta-aloetano
tetra-aloetano
catalizzata dal citocromo P450
tramite
3 meccanismi
principali
DEALOGENAZIONE OSSIDATIVA (es. fluotano)
X X
X-C-C-X
XH
X X
+ [O]
X-C-C-O
- HX
X
tetra-aloacetilaldeide
penta-aloetano
catalizzata dal citocromo P450
DEALOGENAZIONE DI 2 ALOGENI SU ATOMI DI C ADIACENTI
X X
X-C-C-X
XH
+ 2H
- 2H
penta-aloetano
X
X
C
X
C
X
tri-aloacetaldeide
catalizzata dal citocromo P450 e dalla glutatione S-transferasi
Ruolo importante nella attivazione metabolica di molti alcani alogenati
REAZIONI DI FASE I: OSSIDAZIONE
ALCOL DEIDROGENASI
ALCOLI 1a
(ADH)
Bassa specificità, utilizza NAD+ come coenzima per ossidoriduzioni
metanolo
etanolo
formaldeide ALDH acido formico
acetaldeide*
acido acetico
ADH
alcoli semplici
aldeidi
circa 1/3 è metabolizzato
anche da CYP2E1 (indotto)
R-CH2OH
acidi carbossilici
meno tossici e
tossiche
facilmente eliminabili
legami covalenti
*triptofano
carboline
O
ADH
NAD+
citosol di:
fegato
rene
polmone
mucosa gastrica
R-C
NADH +
H+
H
ALDH
NAD+
+
H 2O
Solo alcuni ALCOLI 2a
ALCOLI 2a e ALCOLI 3a
40 kDa
NADH + H+
OH
direttamente coniugati
VARIABILITÀ
subunità
40 kDa
dimero proteico
ADH
dell’uomo
Poiché
loci genici codificanti
R-C
chetoni
(eliminati come tali)
subunità
O
subunità
varianti alleliche
ADH1
a
ADH2 (gene polimorfico)
b
b1
b2
ADH3 (gene polimorfico)
g
g1
g2
ADH4
p
ADH5

b3
Le ADH nell’uomo comprendono
8 subunità che possono combinarsi
come eterodimeri o omodimeri
REAZIONI DI FASE I: OSSIDAZIONE
ALCOL DEIDROGENASI
(ADH)
Le differenti forme molecolari di ADH
vengono suddivise in 3 classi principali
comprendenti i vari isoenzimi
CLASSE I
ADH1
aa
oppure
ab
ag
ADH2
bb (1,2,3)
oppure
CLASSE III
ADH3
gg (1,2)
CLASSE II
ADH4
pp
bg (1,2)
Responsabili dell’ossidazione
dell’etanolo e altri
alcoli alifatici a basso PM
Sono fortemente inibiti
dal pirazolo
Ossidano alcoli alifatici
di dimensioni maggiori
ADH5

Ossidano alcoli a catena lunga
e gli alcoli aromatici
Non vengono inibiti
dal pirazolo
Non vengono inibiti
dal pirazolo
Gli isoenzimi della classe I differiscono nella loro capacità di ossidare l’etanolo
omodimero b2b2
eterodimeri … b2
“ADH atipiche”
sono isoenzimi
particolamente
attivi nell’ossidare
l’EtOH a pH fisiologico
sono responsabili della conversione
eccezionalmente rapida in acetaldeide
che si osserva nell’85% della popolazione
giapponese e cinese (
intolleranza all’alcool)
accumulo di acetaldeide
vasodilatazione al viso,
palpitazioni e nausea
L’ADH atipica è espressa con frequenza
molto minore nei caucasici:
< 5% negli americani;
˜ 8% negli inglesi;
˜ 12% nei tedeschi;
˜ 20% negli svizzeri
negli afroamericani (< 10%),
negli americani nativi (zero),
negli indiani asiatici (zero)
REAZIONI DI FASE I: OSSIDAZIONE
ALCOL DEIDROGENASI
(ADH)
ISOENZIMI DELLA CLASSE I
ADH1 ADH2 ADH3
fegato
per cui l’ossidazione dell’alcol
differisce alquanto
principalmente
rene
tratto gastrointestinale
polmone
in minor quantità
stomaco
ADH3
(gg)
ha una minore affinità (Km >) per l’alcol
ma dopo ingestione di bevande dispone
di una grande quantità di substrato
Tale variabilità è la base della risposta agli xenobiotici.
Infatti le forme isoenzimatiche, pur catalizzando la stessa reazione,
possono avere costanti cinetiche diverse e diversa
compartimentazione .
Ciò permette di trasformare gli xenobiotici in relazione al loro
percorso e alla loro concentrazione relativa durante tale percorso.
REAZIONI DI FASE I: OSSIDAZIONE
ALDEIDI mitocondri e
ALDEIDE DEIDROGENASI
(ALDH)
citosol
Bassa specificità: trasforma sia aldeidi alifatiche che aromatiche
utilizza NAD+ come coenzima per ossidoriduzioni
ALDH
R-CHO
NAD+
+
H 2O
R-COOH
NADH + H+
Le differenti forme molecolari di ALDH vengono suddivise in 3 classi
ALDH I
citosol
grande varietà di xenobiotici
a struttura aldeidica
subunità subunità
54 kDa 54 kDa
subunità subunità
54 kDa 54 kDa
ALDH III
ALDH II
mitocondri
acetaldeide
subunità subunità
54 kDa 54 kDa
citosol stomaco
(altri distretti extraepatici)
subunità
85 kDa
subunità subunità
54 kDa 54 kDa
mutazione puntiforme
(Glu 487
Lys 487)
isoforma meno attiva
presente nel 45-50% di cinesi e giapponesi
(insieme alla “ADH atipica”)
subunità
85 kDa
REAZIONI DI FASE I: OSSIDAZIONE
ALDEIDE OSSIDASI
Sono enzimi metalloflavoproteinici
XANTINA OSSIDASI
intervengono nella trasformazione intermedia delle sostanze
RIDUZIONE
OSSIDAZIONE
dei derivati piridinici
delle purine
delle pirimidine
Km elevata rispetto a quella dell’ALDH
l’aldeide ossidasi
partecipa in maniera poco significativa
alla degradazione delle aldeidi
REAZIONI DI FASE I: OSSIDAZIONE
AMINE 1a
MONOAMINOSSIDASI
(MAO)
mitocondri
in tutti i tessuti
funzione fisiologica
è quella di disattivare
amine degli
alimenti (tiramina)
catecolamine
altre amine biogene
Bassa specificità per i substrati: preferisce le ammine 1a alchiliche e aromatiche
in secondo luogo anche le ammine 2a e 3a
RCH2NH2
MAO
RCH
NH
+ H2O
*FAD come coenzima
OH
- NH3
RCH
NH2
RCHO
il gruppo aminico sia legato a un
gruppo metilenico non sostituito
(es. benzilamina).
anilina
non sono substrati
anfetamina
*FAD= flavin adenin dinucleotide
DIAMINOSSIDASI
(DAO)
UNICA CONDIZIONE
AMINE 1a
citosol
Catalizzano la stessa reazione nelle sostanze provviste di due centri basici:
istidina
lisina
ornitina
istamina
decarbossilazione
cadaverina
putrescina
REAZIONI DI FASE I: OSSIDAZIONE
PROSTAGLANDINA H SINTASI
(PGS)
microsomi
nelle cellule epiteliali
della maggior parte degli organi
Complesso enzimatico contenente Fe che catalizza la biosintesi di prostaglandine e trombossani
Le sostanze esogene possono essere “co-ossidate” mediante l’attività perossidasica dell’enzima
PGS ossida una
quantità ampia di sostanze
COOH
deidrogenazioni
acido arachidonico
fenoli
aminofenoli
2O2
cicloossigenasi
O
N-demetilazioni
prostaglandina
H sintetasi
COOH
O
catalizza entrambe
amine aromatiche
epossidazioni
solfossidazioni
OOH
N-idrossilazioni
idroperossi-endoperossido (PGG2)
xenobiotico A
B
amine aromatiche
prostaglandina
idroperossidasi
O
COOH
O
idrossilazioni
composti aromatici
policiclici
Etc.
OH
idrossi-endoperossido (PGH2)
il contributo totale di questo enzima al processo di disattivazione di xenobiotici
può anche sembrare piccolo (crf. numerose reazioni dovute al citocromo P450)
t u t t a vi a
se si considera che la bioattivazione di sostanze cancerogene può avvenire
nei tessuti bersaglio, allora la PGS assume un ruolo importante
REAZIONI DI FASE I: OSSIDAZIONE
MONOSSIGENASI FLAVINICA attiva l’OSSIGENO MOLECOLARE
microsomi
(FMO)
fegato
polmoni
Complesso enzimatico FAD che
utilizza NADPH come coenzima
substrato
dipende
3a
dal tipo
amine
di S se
aclicliche 2a
FMO
cicliche
porta a
aromatiche
metaboliti eteroaromatiche
inattivi
o attivati idrossilamina
idrazina 1,1-disostituita
tiolo
FMO ossida
i seguenti gruppi funzionali:
struttura
R3N
prodotto
R3N O
(N-ossido)*
R2N-H
R2N-OH
(idrossilamina)
R2N-OH
R2N-O
(nitrone)
R-CH2, R)N-NH2
R-CHO + R-NH-NH2
(aldeide+ idrazina monost.)
RSH
RSSR
(disolfuro)
disolfuro
RSSR
RSR
O (tioetere)
O
tioetere
RSR
RSR
O (solfone)
*la molecola di ossigeno legata alla flavina viene ridotta a perossido
per ossidazione dello xenobiotico un atomo di O del perossido
è trasferito sulla molecola esogena
O2 + NADPH + H+ + enzima FAD
R3NH + enzima FAD .OOH
enzima FAD .OH + H+
enzima FAD .OOH + NADP+
R3N O + enzima FAD .OH
Enzima FAD + H2O
REAZIONI DI FASE I: OSSIDAZIONE
è il sistema enzimatico più diffuso per l’ossidazione
CITOCROMO P450 di xenobiotici
microsomi
CYP 450
famiglia di enzimi che permette all’organismo di ossidare
praticamente tutte le sostanze organiche
il nome deriva dal fatto che
la forma ridotta con Fe2+ lega
CO per dare un complesso con
un massimo di assorbimento
a 450 nm (nel blu)
È COSTITUITO DA:
• eme-proteina, (ferro-porfirinico)
trasporto di e- e
attivazione
di O2
ione
ferroso
N
si riferisce al ruolo dell’eme-proteina:
contiene il centro attivo a cui la sostanza
esogena e l’O2 si legano e su cui avviene
il trasferimento di ossigeno al substrato
N
Fe3+
N
N
• NADPH associato a NADPH reduttasi
• altri cofattori
L’insieme di questi enzimi è contenuto nella
matrice fosfolipidica del reticolo endoplasmatico
O2
RH
H2 O
R-OH
La presenza dei fosfolipidi
è fondamentale per
permettere sia le reazioni
fra i due enzimi che
l’arrivo del substrato
a livello del sistema
enzimatico attivo
REAZIONI DI FASE I: OSSIDAZIONE
CITOCROMO P450
CYP 450
GRANDE VERSATILITÀ CATALITICA
differenziatosi
geneticamente
per il
metabolismo
di
steroidi
e
acidi biliari
è in tutte le specie
polimorfismo genetico
polimorfismo inducibile
uno dei più versatili sistemi di difesa
da sostanze estranee alla biologia cellulare
REAZIONE FONDAMENTALE
durante la catalisi, il CYP450
si lega direttamente ad S e all’O2 ma
non interagisce direttamente con il NADPH
substrato (RH) + O2 + NADPH + H+
MONOOSSIGENAZIONE
un atomo di ossigeno viene
incorporato nel substrato,
l’altro atomo di ossigeno è
ridotto ad acqua con gli
equivalenti riducenti forniti
dal NADPH
prodotto (ROH) + H2O + NADP+
il meccanismo con cui CYP450 riceve e- dal NADPH dipende dalla
sua localizzazione subcellulare
NADPH
citocromo
P450
reduttasi
e-
eFe
citocromo
P450
FMN
citoplasma
FAD
membrana
Componenti molecolari del sistema P450 nella membrana del reticolo
endoplasmatico
citocromo
b
REAZIONI DI FASE I: OSSIDAZIONE
CICLO CATALITICO
CITOCROMO P450
il funzionamento e le possibili interazioni di questo complesso
CYP 450
sistema enzimatico con i substrati è rappresentabile al meglio dal
cosiddetto ciclo di ossidazione
A
prodotto (ROH)
substrato (RH)
Fe3+
P450
I
Fe3+
B
(RH)
Fe3+
G
ROH
IV
F
ossidazione
del substrato
e-
II
attivazione
dell’ossigeno
(FeO)3+ agente
RH ossidante
Fe2+
C
(RH)
H2O
O2
(CO)
H+
Fe2+OOH
RH
E
Fe2+ O2
RH
III
H+ , e-
si lega
ancora
più
saldamente
D
NADPH-citocromo
citocromo b
I microsomi epatici di tutte le specie di mammifero contengono
numerosi enzimi P450 e ognuno di essi ha la capacità di
catalizzare differenti tipi di reazioni
REAZIONI DI FASE I: OSSIDAZIONE
La specificità di substrato, spesso molto ampia e non
CITOCROMO P450 sovrapponibile tra i diversi sottotipi rende impossibile
CYP 450
denominare gli enzimi in base alla reazione catalizzata
REAZIONI CATALIZZATE DAL CYP 450
Isomerizzazione (es. conversione di PGH2 in trombossano e prostaciclina)
alifatiche (tolbutamide)
Idrossilazione
O
O
O
O
aromatiche
S-ossigenazione (omeprazolo)
O
H
cumarina
H
O
OH
O
N-ossigenazione (4-metilnitrosamina-1-(3piridil)butan-1-one (NNK), specifica del tabacco)
Dealchilazione (diazepam; 7-etossiresorufina; 6-metilmercaptopurina)
(N-; O-; S-)
CH2 C O + NH3
CH2 CH NH2
Deaminazione ossidativa
anfetamina
CH3
[o]
CH3
Desolforazione ossidativa (parathion)
ossidativa
Dealogenazione
riduttiva
azo-gruppi
Riduzione
nitro-gruppi
Scissione di esteri (loratadina)
Deidrogenazione (nicotina)
Attraverso tecniche del DNA ricombinate è stato possibile
determinare la sequenza della catena aa di numerosi enzimi P 450
REAZIONI DI FASE I: OSSIDAZIONE
La sequenza aa dell’eme-proteina determina
CITOCROMO P450
l’affinità dell’enzima CYP per una determinata
CYP 450
classe chimica di substrato:
lega per affinità
idrocarburi aromatici
sacca lipofila in grado
di legare sostanze apolari
fenilalanina
aa apolari
( leucina, isoleucina, valina)
CENTRO
CATALITICO
aa bicarbossilici
( glutamato, aspartato)
lisina
arginina
legano composti
carichi negativamente
legano composti
con centri cationici
REAZIONI DI FASE I: OSSIDAZIONE
CITOCROMO P450
La sequenza aa costituisce la base per
CYP 450
classificare e denominare gli enzimi P 450
NOMENCLATURA
in base al grado di parentela con la sequenza di geni (> 300)
il principio su cui si basa la nomenclatura per i prodotti genici
è il grado do omologia della sequenza aa che deriva
dalla sequenza di acidi nucleici del gene codificante
Il singolo enzima viene denominato con la sigla CYP seguita da:
1° numero
FAMIGLIA (1, 2, 3, …)
˜ 35%
lettera maiuscola
omologia
SOTTOFAMIGLIA (2A, 2B...)
40-60% omologia
2° numero
Es. CYP1A1
SOTTOTIPO (2A1, 2A2...)
> grado omologia
REAZIONI DI FASE I: OSSIDAZIONE
I nomi sono assegnati in ordine cronologico
CITOCROMO P450
indipendentemente dalla specie di origine
CYP 450
(es. nel fegato dell’uomo è espresso CYP2A6, ma è l’unico 2A)
Famiglie di enzimi P 450 procariotici ed eucariotici
Famiglia
n° sottofamiglie
n° enzimi
Funzioni enzimatiche
CYP1
1
2
addizione O2 xenobiotici
CYP2
8
57
addizione O2 xenobiotici, steroidi
CYP3
2
10
addizione O2 xenobiotici, steroidi
CYP4
2
10
idrossilazione di acidi grassi
CYP7
1
1
colesterin-7a-idrossilasi
CYP11
2
3
steroide-11b-idrossilasi
CYP17
1
1
steroide-17a-idrossilasi
CYP19
1
1
aromatasi
CYP21
1
1
steroide-21-idrossilasi
CYP27
1
1
colesterina-27-idrossilasi
CYP51
1
1
lanosterolo… in saccaromiceti
9
in lieviti e aspergilli
CYP52-CYP57
CYP101
CYP102-107
camferossigenasi in batteri
8
in diversi ceppi di batteri
il numero di enzimi P450
in ciascun sottotipo
differisce
da una specie all’altra
REAZIONI DI FASE I: OSSIDAZIONE
CITOCROMO P450 L’enzima principale del fegato umano è il CYP3A4
seguito da CYP2E1, CYP2C9 e CYP1A2
CYP 450
FAMILY OF ENZYMES (CYPs) IN LIVER
Proportion of Pharmaceuticals Metabolized
by Individual Cytochrome P450’s
P-4502B6
P-4502C9/10
P-4501A2
P-4502C19
P-4502A6 P-4502C9
Major P450 Content of
Human Liver
P-4502B6
P-4502E1
Other
P-4502C19
P-4502E1
P-4502C8
P-4501A2
P-4503A
P-4503A
P-4502B6
P-4502A6
Gli enzimi citocromo P 450 dell’uomo
Famiglia
Organo
Substrato
CYP1A1
polmone, placenta,
linfociti, pelle
IPA (es. benzo[a]pirene)
CYP1A2
fegato
amine e ammidi aromatiche e N-eterocicliche
caffeina, fenacetina, aflatossina B1
CYP2A6
fegato
cumarina, dietilnitrosamina
CYP2C9
fegato,
intestino tenue
antiepilettici (S-mefenitoina)
CYP2D6
fegato
antiaritmici, b-bloccanti, antidepressivi
CYP2E1
fegato, esofago
alcani, alcoli, acetone, benzene, anilina, etc.
intestino tenue
fegato,
aflatossina, nifedipina, cancerogeni aromatici
tratto gastrointestinale
CYP3A4
REAZIONI DI FASE I: OSSIDAZIONE
I livelli e l’attività di ciascun enzima P 450
CITOCROMO P450
variano da individuo a individuo in rapporto a
CYP 450
fattori ambientali e/o genetici
mutazioni bloccano la sintesi dell’enzima o determinano
la produzione di enzima inattivo o poco
efficiente dal punto di vista catalitico
infezioni,
esposizione a xenobiotici
ATTIVITÀ a causa di
deprimono la sintesi del P450
con l’inibizione del CYP 450,
un farmaco può bloccare la
trasformazione di un altro
xenobiotico e modificarne la risposta
(l’inibizione riproduce gli effetti di un deficit genetico)
esposizione a sostanze che inibiscono o
rendono inattivo l’enzima presente
duplicazione genica
sovraespressione della proteina enzimatica
ATTIVITÀ a causa di
esposizione a xenobiotici
induzione della sintesi del CYP 450
È il meccanismo più frequente
stimolazione da parte di uno xenobiotico dell’enzima già presente
Sostanze esogene inducenti nell’uomo
Sostanza esogena
fumo di tabacco
fumo di tabacco, carne alla griglia
indolo nel cavolo di Bruxelles,
alcol
barbiturici, desametasone, rifampicina
è necessaria l’interazione con
una specifica proteina recettore;
il complesso con il recettore
migra all’interno del nucleo e
legandosi alla regione genica
di promozione dell’enzima mette
in azione la sintesi di mRNA
Enzima P450 indotto
CYP1A1
CYP1A2
CYP2E1
CYP3A4
REAZIONI DI FASE I: OSSIDAZIONE
In una % significativa della popolazione, gli
CITOCROMO P450
effetti di alcuni xenobiotici sono accentuati dalla
CYP 450
carenza ereditaria di enzimi P450
POLIMORFISMO GENETICO
CYP 2C19
ereditate come caratteri autosomici recessivi
ha le più importanti implicazioni cliniche:
la sua attività è distribuita bimodalmente
nella popolazione in cui si possono
distinguere 2 fenotipi
ultraveloci (amplificazione del gene 2D6)
rapidi metabolizzatori
lenti
(3-10%)
Frequenza relativa degli alleli
CYP 2D6
AA
Aa
aa
Attività enzimatica relativa
omozigoti per un carattere autosomico recessivo
e non posseggono l’enzima a livello epatico
REAZIONI DI FASE I: OSSIDAZIONE
CITOCROMO P450
CYP 450
sito
reattivo
O
C
NH2
O CH2 O
+
N
CONH2
¨
N
+ H+ + 2e-
R
R
HO OH
NAD+
NADH
NH2
C
N
HC
O- P
H
H
CONH2
HH HH
O
H
+
N
O
O- P
TRASPORTATORI DI ELETTRONI
N
C
C
N
CH
N
O CH2 O
O
sito
reattivo
NAD+ (nicotinamide adenin dinucleotide R = H)
NADP+ (nicotinamide adenin dinucleotide R = PO32-)
H H HH
HO OR
H3 C
N
H3 C
N
H
H
H
H
C
C
C
C
H C
O
NH
N
H
OH
OH
OH
H
O
sito
reattivo
NH2
C
N
O
N
C
CH
O P O
HC
C
N
N
O
O- P O CH2 O
O
H3C
N
H3C
N
R
FAD
H
O
NH
N
O
+ 2H+ +
N
H3C
2e-
N
N
R
H
FADH2
H H HH
HO OH
O
H3C
FAD (flavin adenin dinucleotide: flavinmonunucleotide(FMN), AMP)
NH
O
REAZIONI DI FASE I: OSSIDAZIONE
CITOCROMO P450
CYP 450
scarsa specificità di substrato*
ogni difetto genetico può influenzare
il metabolismo di molti farmaci
citocromo
P450
tuttavia, l’osservazione che soggetti con difetto genetico
di un particolare P450 hanno un metabolismo lento
di una o più sostanze
*
principio generale:
la velocità di eliminazione di uno xenobiotico
può essere in larga misura determinata da
un singolo CYP 450
ciò sembra contraddire
In realtà i diversi CYP450 pur potendo catalizzare uno stesso xenobiotico,
hanno caratteristiche di affinità molto diverse tra loro
FENOTIPIZZAZIONE DEL CYP 450
1) Analisi di correlazione: velocità di trasformazione di un substrato
in prodotto in frazioni microsomiali umane, in relazione al contenuto
dei singoli tipi P450 presenti nelle varie frazioni.
2) Inibizione chimica: inibizione enzimatica con composti noti, tipici
di una certa isoforma. Inibitori non competitivi.
3) Inibizione con anticorpi specifici.
4) Uso di cDNA di isoforme specifiche di CYP450.
REAZIONI DI FASE II: DI CONIUGAZIONE
Sono reazioni enzimatiche di biosintesi per mezzo delle quali un composto
esogeno o un metabolita derivato dalle reazioni di fase I si lega in modo
covalente con una molecola endogena mediante –OH –COOH -NH2 -SH
La maggior parte degli enzimi preposti si trova nel citosol
unica eccezione (microsomi)
S ENDOG.
ENZIMA
REAZIONE
SUBSTRATO
coniug. glucuronica
UDP-glucuronil
transferasi
ac. UDP
glucuronico
coniug. solforica
sulfotrans.
fosfoadenisil
fosfosolfato
fenoli, alcoli:
morfina, diazepam
fenoli, alcol, amine:
paracetamolo
coniug. con glutatione
GSH-Stransferasi
epossidi
acido etacrino
coniug. con aa
acil-CoA
glicina trans.
glicina
acidi carbossilici
acetilazione
N-acetil
transferasi
acetil CoA
amine: clonazepam
metilazione
transmetilasi
S-adenosil
metionina
dopamina, adren.,
istamina
tranne queste, causano
un aumento notevole della
idrofilicità dello xenobiotico
Il meccanismo di reazione prevede consumo di
energia, utilizzata per attivare i cofattori
ad intermedi ad alta energia.
si svolgono nel corso
di reazioni con
xenobiotici attivati
Le reazioni di fase I procedono in genere più lentamente di quelle di fase II
la velocità di eliminazione è in genere
determinata dalle reazioni di fase I
REAZIONI DI FASE II: DI CONIUGAZIONE
Gli agenti coniuganti più comuni sono: ACIDO GLUCURONICO
ACIDO SOLFORICO
GLICINA
La sequenzialità
delle coniugazioni di una stessa sostanza
può dare origine a svariati prodotti di coniugazione
Es. acido p- amminosalicilico può essere substrato di più di un enzima
metabolizzante, così che processi di coniugazione diversi possono
competere per lo stesso gruppo funzionale
coniugazione con glicina
acil glucuronazione
COOH
OH
NH2
O. solfoconiugazione
O. glucuronazione
acetilazione
N. glucuronazione
vasta gamma di metaboliti
REAZIONI DI FASE II: GLUCURONAZIONE
UDP-GLUCURONIL trasferisce l’acido glucuronico sul substrato
TRANSFERASI formando un legame b-glicosidico
microsomi
Differenti classi di coniugati di acido glucuronico
tipo di glucuronide
C-O-glucuronide
gruppo funzionale
esempio
C O G
alcol
alifatico
aliciclico
benzilico
fenolico
tricloroetano
esobarbital
metilfenilcarbinolo
3-idrossi-benzo[a]pirene
C O G
acido carbossilico
alifatico
aromatico
acido a-etilesano
acido a-aminobenzoico
CH C O G
chetone a,b insaturo progesterone
N-O-glucuronide
N O G
N-idrossi-
N-acetil-N-fenil-idrossilamina
carbamato
meprobramato
arilamina
2-naftilamina
amina alifatica 3a
tripelennamina
ariltiolo
tiofenolo
1,3-dicarbonil
fenilbutazone
N-glucuronide
O
C
N G
O H
Ar N G
H
(R)3 N+ G
S-glucuronide
(R)3 S
G
C-glucuronide
C S
G
L’uomo e i grandi primati
sono le uniche specie in grado di formare i glucuronidi di ammonio quaternario dalle amine 3a
REAZIONI DI FASE II: GLUCURONAZIONE
UDP-GLUCURONIL Il co-substrato della reazione è l’acido UDP-glucuronico
TRANSFERASI
poiché questo è in equilibrio
con glicogeno e D-glucosio 6-P, il D-glucosio –1-P
co-substrato della glucuronazione
nel fegato può essere limitante UTP
solo in condizioni estreme
UDPG-pirofosforilasi
PPi
UDP-D-glucosio
2NAD+
2NADH2
UDPG-deidrogenasi
acido UDP-
(0.3-0.5 mM nel fegato) glucuronico
OH
UTP
UDP-glucuronil-transferasi
1-naftolo
O O
COOH
OH
OH
La glucuronazione è catalizzata da un gruppo di isoenzimi
(con specificità per i substrati a volte sovrapponibile)
OH
i singoli isoenzimi possono essere indotti dagli stessi induttori dei CYP450
NOMENCLATURA
Essendo noti i cDNA, i singoli enzimi vengono nominati sulla base della
sequenza di aa derivata (come per i CYP450)
Il singolo enzima viene denominato con la sigla UGT seguita da:
numero
FAMIGLIA (1, 2)
lettera maiuscola
(UDP-glucuroniltransferasi)
l’omologia fra le due non supera il 50%
SOTTOFAMIGLIA (UGT2B) omologia > 60%
numero
identifica il GENE (UGT2B1)
o la PROTEINA
REAZIONI DI FASE II: GLUCURONAZIONE
La scissione di glucuronidi nell’intestino dovuta alle
UDP-GLUCURONIL
b-glucuronidasi batteriche può prolungare la permanza
TRANSFERASI
dello xenobiotico
I glucuronidi possono costituire i “metaboliti di trasporto” di sostanze tossiche.
Es. ruolo della glucuronazione nell’attivazione di 2-naftilamina.
fegato
NH2
N Gluc
NH N-glucuronazione
OH
GT
N-idrossilazione
CYP450
OH
sangue
reni
vescica
+
NH
urina
essendo instabile a causa del basso pH, si idrolizza
a idrossilamina e per eliminazione di H2O si forma
nitroione reattivo
La glucuronazione può contribuire alla disattivazione di metaboliti reattivi con
l’interruzione dei cicli ossidazione/riduzione presenti nel metabolismo di chinoni.
Ciclo di riduzione di chinone/idrochinone
Oe
O
O2
Benzo[a]pirene-3,6-chinone
.
O
-
O-.2
OH
Benzo[a]pirene-3,6-semichinone
O2
e-
OH
O-.2
OH
Benzo[a]pirene-3,6-idrochinone
GT
Benzo[a]pirene-idrochinone
glucuronide
REAZIONI DI FASE II: SOLFOCONIUGAZIONE
le solfotransferasi e le glucuroniltransferasi competono
SOLFOTRANSFERASI per lo stesso substrato, reagendo con:
tipo di solfoconiugato
gruppo funzionale
citosol
esempio
C
O SO3
alcol
idrossidimetridazolo
C
O SO3
fenolo
fenolo
N O SO3
(solfonato)
idrossilamina
N-idrossi-2-acetilaminofluorene
C
amina
anilina 2-naftilamina
NH SO3
(solfamato)
l’estere del solfato formatosi si trova soprattutto in forma ionizzata
ai pH fisiologici, cioè la solubilità dello xenobiotico aumenta
Il co-substrato della reazione è la 3’-fosfoadenosin-5’-fosfosolfato (PAPS)
SO42ATP
PPi
deriva dalla alimentazione o
dal metabolismo ossidativo della cisteina
ATP-sulforilasi
APS
ATP
ADP
(50 mM nel fegato)
OH
1-naftolo
APS-cinasi
PAPS
PAP
OSO3
-
fenol-solfotransferasi
Le solfotransferasi sono isoenzimi citosolici
possono essere indotti
possono dare composti tossici
REAZIONI DI FASE II: GLUTATIONE-CONIUGAZIONE
Il glutatione (GSH) è contenuto in tutte le cellule e
GSH- S
TRANSFERASI in alcuni tessuti raggiunge conc. di 10 mM citosol
(> 95%)
microsomi
Composti fortemente elettrofili possono reagire con GSH anche per via non enzimatica.
alla disattivazione di ossigeno reattivo
GSH
partecipa
anche
al mantenimento delle funzioni di membrana
al mantenimento dell’equilibrio redox nelle cellule
Glu
H3N+ COOCH
CH2
CH2
C O
Cys
Gly
NH
libero
su cui avviene
la conuigazione
con lo xenobiotico
HC CH2 SH
O C
NH
CH2
H3N+ COOCH
CH2
CH2
C O
COO-
CH2
CH2
O C
NH
NH
HC CH2 S S CH2 HC
O C
NH
-
COO
GSH
(forma ridotta)
Si conoscono 5 diverse classi
di GSH-S-transferasi
con specificità sovrapponibile
H3N+
CH
C O
NH
CH2
CH2
COO-
COO-
GSSG
(forma ossidata)
4 sono localizzate nel citosol
diverse specificità
1 localizzata nei microsomi (inducibili)
disintossicazione
da metaboliti formati
nel reticolo endoplasmatico
REAZIONI DI FASE II: GLUTATIONE-CONIUGAZIONE
catalizzano la formazione di un legame tioetere tra
GSH- S
TRANSFERASI un atomo C fortemente elettrofilo del substrato e
il gruppo sulfidrilico del GSH
REAZIONI CATALIZZATE
sostituzione nucleofila all’atomo C saturo
CH3-SG + HI
+ GSH
CH3I
metilioduro
sostituzione nucleofila all’atomo C aromatico
Cl
Cl
Cl
SG
+ HCl
+ GSH
NO2
3,4-dicloronitrobenzene
sostituzione nucleofila all’atomo C saturo
di una catena laterale dell’anello
NO2
CH2SG
CH2Cl
+ GSH
+ HCl
cloruro di benzile
reazione di addizione su un doppio legame C=C
CHCOOC2H5
CHCOOC2H5
+ GSH
CH2COOC2H5
GS CHCOOC2H5
dietilmaleato
reazione di addizione con apertura
dell’anello di un epossido
O
CH
CH2
CH(OH)CH2 SG
+ GSH
1,2-epossidazione
REAZIONI DI FASE II: GLUTATIONE-CONIUGAZIONE
i coniugati di xenobiotici sono degradati nei reali
GSH- S
TRANSFERASI prodotti di eliminazione, N-acetilati cistein-tioeteri
(acidi mercaptanici)
O C Gly
HC CH2 SH
HN g Glu
+ RX
GSH-S-transferasi
HX
O C Gly
HC CH2 SR
HN g Glu
g-glutamiltranspeptidasi
Glu
O C Gly
CH2 SR
HC
HN2
cisteinilglicinasi
Gly
COOH
CH2 SR
HC
HN2
AcCoa
N-acetiltransferasi
COOH
HC
CH2 SR
HN C CH3
O
acido mercaptanico
Cys-S-R + H2O
R-SH + CH3COCOOH + HN3
cisteina b liasi
Tuttavia le cisteine b liasi, presenti soprattutto nel fegato, reni e batteri intestinali,
possono scindere allo stadio di cisteina-coniugato il legame B-C della cisteina e lo zolfo
con la formazione di un tiolo reattivo e instabile come anche di piruvato e ammoniaca
REAZIONI DI FASE II: AMINOACIDI-CONIUGAZIONE
alcuni acidi carbossilici vengono trasformati
ACIDI CoA-LIGASI
ATP- e N-ACETILTRANSFERASI in amidi per coniugazione con aa
DIPENDENTI
mitocondri
citosol
glicina
glutamina
SUBSTRATI
acidi carbossilici aromatici
gli acidi carbossilici
sono substrato
anche per la glucuronazione
acidi acetici aromatici sostituiti
acido b-arilpropionico
acidi acrilici b-sostituiti
CONIUGAZIONE CON GLICINA
attivazione
PP
COOH
acido benzoico
AMP
O
C AMP
ATP
adenilato
C S CoA
CoA
coenzima A-tioestere
O
O
C S CoA
C NH CH2
coenzima A-tioestere
NH2
CH2
COOH
O
COOH
REAZIONI DI FASE II: ACETILAZIONE
nella biotrasformazione degli xenobiotici i gruppi
N-ACETILTRANSFERASI aminici e idrossilaminici sono acetilati
citosol
possono essere acetilate sia
SUBSTRATI
all’N che al gruppo idrossilico
amine aromatiche
acido arilidrossamico
alcune amine alifatiche primarie
alcune idrossilamine
acetossiarilamina
idrazine
idrazidi
solfonamidi
N-idrossiderivati delle arilamine arilidrossilamine
Il co-substrato “attivato” della reazione è l’acetil CoA
NH2
NH
O
CH3
C CH
C CH2
CH2
OH
CH2
C
O
CH3
O
P O
P
O
O
-
-
O
CH2 N
O
O
O
NH CH2 CH2 S C CH3
N
N
O
O
-
HO3P
N
si forma durante il
metabolismo intermedio
della sostanza dal CoA
Attraverso l’acetilazione
del gruppo sulfidrilico
della molecola
O
H
La N- e O-acetilazione di arilamine o arilidrossilamine avviene in 2 stadi:
il gruppo acetilico del co-substrato è trasferito all’enzima
il gruppo acetilico è sottratto dal gruppo aminico o idrossilaminico del substrato
Forme polimorfiche
REAZIONI DI FASE II: METILAZIONE
O-METIL,
N-METIL,
S-METIL,
TRANSFERASI
nella metilazione di xenobiotici vengono mascherati
i gruppi funzionali e aumenta la lipofila
citosol
microsomi
gruppi idrossilici fenolici (-OH del pirogallolo)
possono
essere
metilati
gruppi aminici 1a, 2a, 3a (atomo N della piridina)
gruppi sulfidrilici (-SH del metiltiolo)
Dal punto di vista quantitativo, la metilazione ha
un’importanza minore nel metabolismo degli xenobiotici
Il co-substrato “attivato” della reazione è la S-adenosilmetionina(SAM)
HOOC CH
CH2
+
CH2 S CH2
N
N
O
H H H
H
CH2
per donazione del gruppo metilico
HO OH
S-adenosilomocisteina
NH2
N
N
MUTAZIONI E LORO AZIONE SUL FENOTIPO
mutazioni geniche
conseguenza enzimatica
scambio di basi
esempio
diminuzione
N-acetiltransferasi 2
aumento
alcol deidrogenasi 2
perdita
aldeide deidrogenasi 2
insersione di basi
perdita
citocromo P-450 2D6
delezione di gene
perdita
citocromo P-450 2D6,
glutatione S transferasi
amplificazione genica
aumento
citocromo P-450 2D6
BIOTRASFORMAZIONE DEGLI XENOBIOTICI
E SISTEMA IMMUNITARIO
molecole estranee
di PICCOLE dimensioni
molecole estranee
di GROSSE dimensioni
virus e batteri
La biotrasformazione degli xenobiotici
può essere considerata un
importante meccanismo omeostatico
Il sistema immunitario
è responsabile
del meccanismo omeostatico
quantità
illimitata
di anticorpi
specifici