A.A. 2014-15
Dipartimento di Scienze della Vita
CdS Biologia Molecolare e Cellulare (LM-6)
Genetica dei Procarioti - 4
Prof. Laura Marri
ricevimento: previo appuntamento telefonico o e-mail
Frequenza di mutazione
La frequenza con cui avvengono
i diversi tipi di mutazioni è
estremamente variabile.
Errori nella replicazione del DNA
ricorrono con una frequenza di
10-6 10-7 per coppia di basi per
singolo ciclo di replicazione.
Aumenta in fase stazionaria: mutazione di una cellula ogni 300–400
Una coltura di E. coli in terreno complesso (LB) entra
in fase di morte dopo tre giorni di incubazione.
In questa fase, il 90-99% della popolazione muore
ossidazione di proteine e DNA, programma simile
all’apoptosi eucariotica che determina la morte delle
cellule al raggiungimento di una densità elevata
Le cellule sopravvissute possono utilizzare le sostanze rilasciate da quelle morte,
inclusi gli amminoacidi dalle proteine, i lipidi dalla membrana cellulare e il DNA
Dopo la fase di morte la vitalità delle cellule può essere mantenuta per mesi o
addirittura per anni in una condizione definita fase stazionaria prolungata
A partire dal 10° giorno delle colture in LB si osserva la comparsa, all’interno
della popolazione batterica, del fenotipo GASP
I fenotipi GASP mostrano una fitness migliore rispetto al ceppo parentale e il
bilancio tra le cellule in crescita e morte fornisce un equilibrio dinamico il cui
risultato finale è la vitalità stabile della popolazione
rpoS
duplicazione di 46 bp all’estremità 3’  proteina in cui i quattro
amminoacidi presenti a C-terminale sono sostituiti con 39 nuovi
amminoacidi
indebolimento dell’espressione del regulon (in E. coli RpoS controlla
l’espressione di oltre il 10% dei geni)
sbilanciamento della competizione tra i vari fattori sigma per il core della RNA
polimerasi.
Cellule con una ridotta espressione di rpoS favorirebbero, infatti, l’associazione
dei fattori sigma RpoD (σ70 ) e RpoN (σ54) alla RNA polimerasi determinando
una fitness migliore rispetto al ceppo wild-type
lrp
Lrp è un regolatore trascrizionale che può funzionare sia da attivatore
che da repressore e controlla l’espressione di molti geni implicati nel
metabolismo e nel trasporto degli amminoacidi
maggiore capacità di recuperare gli amminoacidi rilasciati dalle cellule
morte, in particolare serina, treonina e alanina
Attivazione operone ybeJ-gltJKL
riarrangiamento genomico prodotto dalla sequenza di inserzione IS5.
Quattro geni di questo operone sono implicati nella regolazione del
trasporto per l’aspartato e il glutammato, aumenta il potenziale di
assorbimento degli amminoacidi per i mutanti
mutanti GASP: “truffatori evolutivi”, ignorano i segnali di inibizione della
crescita e continuano a moltiplicarsi
Un modello delle basi
fisiologiche del fenotipo
GASP
La competizione osservata all’interno di popolazioni batteriche è stata interpretata
facendo riferimento alla “teoria dei giochi”
i “cooperatori” (WT-WT) coesistono, entrambi bloccano anticipatamente la crescita
e sono premiati attraverso la redistribuzione delle risorse necessarie al
mantenimento della popolazione per lungo tempo
i “cooperatori” (WT) che incontrano i “truffatori” (GASP) sono imbrogliati e le loro
risorse vengono consumate prematuramente dai secondi
i “truffatori” che coesistono tra loro (GASP & GASP) sono puniti poichè continuano
a crescere senza controllo mettendo a rischio la vitalità a lungo termine
in un habitat artificiale spazialmente
strutturato (micro lastre in silicone) in
cui la disponibilità dei nutrienti è
omogenea, WT e GASP coesistono
operone criptico
sequenze di DNA fenotipicamente
silenti normalmente non espresse
durante il ciclo vitale dell’organismo
Sistemi criptici in Escherichia coli K12
bgl
cel
arbT
asc
metabolismo arbutina e salicina
metabolismo arbutina, salicina, cellobiosio
assunzione arbutina
metabolismo arbutina, salicina, cellobiosio
operone criptico Bgl
utilizzo beta-glucosidi aromatici
ARBUTIN
SALICIN
PHLORIZIN
Operone bgl
*
---------
*
CAP-cAMP
RNA polimerasi
CF CF
CF CF
regione AT
CF
CAP
CF
-35
CF
-10
Pbgl
bglG
t1
+132
H-NS binds to the upstream regulatory element and the promoter
StpA paralogo di H-NS
The H-NS paralog StpA shares 58% amino acid identity with H-NS and the two
proteins have many common properties.
StpA can complement the gene expression defect of the hns single mutant (Shi
and Bennet, 1994)
Antagonistic control of the Escherichia coli bgl promoter by FIS and CAP in vitro
Caramel A, Schnetz K.
Molecular Microbiology
Volume 36, Issue 1, pages 85-92, 2002
293, 625 - 629 (22 October 1981)
Insertion of DNA activates the cryptic bgl operon in E. coli K12
Ann E. Reynolds, Jeffrey Felton* & Andrew Wright
Spontaneous mutations which activate the cryptic bgl operon of
Escherichia coli K12 are caused by insertion of DNA at a site,
bglR, within the operon. Two insertion elements, IS1 and IS5,
have been observed to effect this activation. Once the activating
insertion has occurred the operon is inducible by glucosides in
a cyclic AMP-dependent manner.
Sequence of the bgl promoter and upstream regulatory region.
Indicated are the −35, −10, and transcription start sites of the
promoter; the CRP binding site (boxed); and the Fis binding sites
(dotted lines), as well as the BglJ-RcsB (solid lines) binding sites.
LeuO, a transcriptional regulator, likewise binds to
the bgl upstream regulatory region and relieves
repression of bgl independently of BglJ-RcsB.
BglJ and RcsB (both TR of
the LuxR-type family)
interact and form
heterodimers that
presumably bind upstream
of the bgl promoter
Promoters (P) are indicated by pointed flags.
Operone bgl
*
---------
*
Ruolo biologico ed evolutivo dei geni criptici
•
1.
2.
3.
Secondo il modello di Hall et al. (1987), un gene di una
popolazione microbica può trovarsi in tre stati:
Allele funzionale;
allele criptico;
allele non-funzionale.
L’allele wild type è favorevole in certi ambienti, mentre in ambienti
alternativi, con risorse limitate, l’allele criptico è vantaggioso.
La distribuzione di alleli criptici/funzionali per il metabolismo di βglucosidi varia all’interno delle Enterobacteriacae in relazione alla
nicchia ecologica occupata
Klebsiella spp.
Gruppo I
Escherichia coli,
Shigella sonnei
Gruppo II
fermentano β-glucosidi aromatici e cellobiosio
non possono fermentare β-glucosidi, ma
possono mutare acquisendo
indipendentemente un fenotipo Arb+, Sal+ o
Cel+
Il mantenimento di alcuni sistemi criptici rappresenta un sistema di regolazione
a lungo termine per funzioni raramente utilizzate
In ambienti multi-risorsa, un allele criptico attivato è svantaggioso, ma
selettivamente favorevole in particolari condizioni di stress (es. digiuno,
risposta immunitaria dell’ospite)
Nome/Gene
Funzione
σ70 (rpoD)
Geni necessari durante la crescita esponenziale
σ54 (rpoN)
Geni espressi in condizioni di carenza di azoto
σ38 (rpoS)
Geni espressi durante la fase stazionaria e in condizioni di
stress generale
σ32 (rpoH)
Geni espressi durante heat-shock (chaperoni per ristabilire
il folding corretto delle proteine citoplasmatiche)
σ28
Geni codificanti per proteine coinvolte nell’assemblaggio del
flagello
(rpoF)
σ24 (rpoE)
Geni espressi in condizioni di stress termico per ripristinare
l’integrità di membrana e assicurare il folding corretto delle
proteine di membrana
σ19 (fecI)
Geni espressi in relazione al trasporto del citrato ferrico
Consensus E. coli 32 (rpoH)
Some sigma factors are always
expressed but inactive without a
coactivator
Some are only expressed when the
genes they regulate are required
Some are expressed but degraded
Some are expressed but inactive
due to anti-sigma factors
Nome
σ70
(RpoD)
Funzione
principale fattore durante la crescita in condizioni
normali
σ54 (RpoN)
assimilazione dell’azoto
σ38 (RpoS)
principale fattore durante la fase stazionaria;
affamamento
σ32 (RpoH)
risposta a heat-shock
σ28 (RpoF)
sintesi del flagello
σ24 (RpoE)
EC
σ19 (FecI)
trasporto del ferro
Anti-sigma Factors

Anti-
Anti-sigma factors tightly (yet reversibly) bind sigma factors
and prevent their activity.
FlgM
durante le fasi iniziali della biogenesi flagellare σ28 è mantenuto
inattivo dalla stretta associazione con FlgM
l’uncino ed il corpo basale
sono assemblati FlgM viene
secreto attraverso il sistema
di trasporto flagellare (T3S)
folded form
The coupling of flagellar gene regulation to flagellum assembly.
Chevance F F V et al. J. Bacteriol. 2006;188:297-304
Some sigma factors are always
expressed but inactive without a
coactivator
Some are only expressed when the
genes they regulate are required
Some are expressed but degraded
Some are expressed but inactive due
to anti-sigma factors
Nome
σ70
(RpoD)
Funzione
principale fattore durante la crescita in condizioni
normali
σ54 (RpoN)
assimilazione dell’azoto
σ38 (RpoS)
principale fattore durante la fase stazionaria;
affamamento
σ32 (RpoH)
risposta a heat-shock
σ28 (RpoF)
sintesi del flagello
σ24 (RpoE)
EC
σ19 (FecI)
trasporto del ferro
Alcuni sRNA legandosì al 5' dell'mRNA impediscono la formazione della
struttura secondaria e permettono la traduzione di RpoS (σs).
ll sito di legame al ribosoma (RBS) dell'mRNA rpoS è appaiato alla regione 5‘
non tradotta dell'mRNA.
Most RpoS expression is determined at the translational level
At least three different small RNAs, DsrA, RprA and OxyS, regulate RpoS
translation
the abundance and, therefore, the activity of each is in turn regulated by different
environmental cues.
The stress response sigma factor RpoS has ~500
genes under its control
Default situation: «off», the 5’ folds back to block the chromosome entry
Hfq consists of six identical subunits arranged in a ring shape structure
Hfq is an RNA-binding protein
encoded in approximately half
of the (in 2002) sequenced
bacterial genomes and is one
of the most abundant proteins
in E. coli.
The typical action of an Hfq-associated sRNA.
The sRNA binds to the Hfq protein and then finds its target mRNA
regolazione mediante fattori sigma alternativi
 sRNA (small RNA), possono svolgere la loro azione regolativa appaiandosi
a regioni specifiche di un RNA bersaglio perfettamente o parzialmente
complementare (sRNA antisenso)
 Gli RNA antisenso sono molecole piccole (da poche decine a poche
centinaia di nucleotidi), diffusibili
OmpF
in
alternativa
pori grandi
livelli di
osmolarità
OmpC
pori piccoli
livelli di
osmolarità
MicF
OmpC
EnvZ/OmpR System of E. coli
Senses changes in extracellular osmolarity