Alma Mater Studiorum - University of Bologna
CeRMiV
Centro di ricerca e diagnostica molecolare in vivo
www.cermiv.unibo.it
Absolute quantification
of human brain metabolites
using
QUEST
E. Malucelli , D.N. Manners , C. Testa , C. Tonon , R. Lodi ,
1
1
1
1
1
B. Barbiroli1, S. Iotti1
1Dipartimento
di Medicina Interna dell’Invecchiamento e delle Malattie Nefrologiche,
University of Bologna, Bologna, Italy,
Magnetic Resonance Imaging
(MRI)
MRI Struttutale
Diffusion Tensor Imaging (DTI)
Trattografia
Functional MRI (fMRI)
1100
Reaction Time (ms)
•
•
•
•
1000
Younger
Older
Neutral
900
800
700
600
0
NST
ST
NST
Introduzione
• Perchè usare la MRI?
• Che cos’è la MRI?
• Come si ricostruisce un’immagine?
• Cosa rende un’imamgine interessante?
Introduzione
• Perchè usare la MRI?
• Che cos’è la MRI?
• Come si ricostruisce un’immagine?
• Cosa rende un’imamgine interessante?
What isusare
MRI used
for?
Perchè
la MRI?
• Il segnale MRI deriva per la maggiro parte dai
protoni dell’acqua
• Il corpo umano è largamente formato da
acqua, specialmente i tessuti molli
• Il cervello umano è composto
per il 78% di acqua
Perchè usare la MRI?
• Non invasiva
• Nessuna radiazione ionizzante
• Rilevamento di tessuti molli
• Alto contrasto e applicabilità
• Alta risoluzione spaziale
CT
MRI
MRI: Applicazioni cliniche
• A scopi clinici la MRI si utilizza per:
– Rilevare tumori e altre anormalità
– Rilevare regioni con ictus
– Rilevare emorragie celebrali
– Pianificare e guidare interventi
E molto più……
MRI: Apllicazioni scientifiche
MRI è utilizzata sia per scopi clinici sia per ricerca
– Studi funzionali cerebrali (functional MRI)
– Studi strutturali e morfologici cerebrali
MRI: dai protoni all’imamgine
• Perchè usare la MRI?
• Che cos’è la MRI?
Magnetic: origine del segnale
Resonance: eccitazione - rilevamento
Imaging: convertire il segnale in immagine
• Come si ricostruisce un’immagine?
• Cosa rende un’imamgine interessante?
MRI: dai protoni all’imamgine
• Perchè usare la MRI?
• Che cos’è la MRI?
Magnetic: origine del segnale
Resonance: eccitazione - rilevamento
Imaging: convertire il segnale in immagine
• Come si ricostruisce un’immagine?
• Cosa rende un’imamgine interessante?
MRI: dai protoni all’imamgine
• Perchè usare la MRI?
• Che cos’è la MRI?
Magnetic: origine del segnale
Resonance: eccitazione - rilevamento
Imaging: convertire il segnale in immagine
• Come si ricostruisce un’immagine?
• Cosa rende un’imamgine interessante?
Il contrasto
z gradient coil
r.f. transmit/receive
x gradient coil
super conducting magnet
subject
gradient coils
MRI: dai protoni all’imamgine
Orientazione casuale
Magnete a superconduzione
• Gli spin sono polarizzati dal
campo magnetico costante, B0
• Magnetizzazione – M||B0
Boss fMRI
13
B0
M
Coordinate del sistema
z
M
y
x
B0
La direzione del campo magnetico principale (B0)
determina le coordinate del sistema
Asse longitudinale: parallelo a B0 (asse z)
Piano trasversale: perpendicolara a B0 (piano x,y)
Dopo lo stimoli gli atomi tendono a ritornare alla
posizione di equilibrio di M parallelo a B0
• Solo la magnetizzazione
trasversale riesce ha
essere rilevata e a dare
segnale
Pulse-sequence diagram
90°
RF
Boss fMRI
15
Tempi di rilassamento: T1 e T2
Mxy
e-t/T2
Decadimento del segnale
nel piano trasversale
in accordo con il T2
T1>T2
1-e-t/T1
Mz
Recupero della magnetizzazione
lungo l`asse longitudinale
in accordo con il T1
time
Impulso RF
Ampiezza del segnale
Tempo di eco (TE) e contrasto T2
Dopo l`eccitazione, il signale decade
exponenzialmente in accordo con il T2.
Tessuto1
(T2 lungo)
Tessuto 2
(T2 corto )
TE
Segnale
Echo Time (TE) e contrasto T2
Basso
contrasto
Alto
signale
TE
corto
TE
Segnale
Echo Time (TE) e contrasto T2
Basso
signal
Medio
contrast
TE
lungo TE
Signal
Echo Time (TE) e contrasto T2
Alto
contrasto
Signale
medio
Medio
TE
TE
Repetition Time (TR) e
contrasto T1 Contrast
Mz
(% of max)
La magnetizzazione si riallinea con il
campo principale in un tempo T1
Il T1 è diverso per ogni tessuto
Ma... non si ha signale lungo Mz (solo
sul piano Mxy)
Tempo dall`impulso RF (ms)
Long TR
Short TR
T1
PD
Short TE
T2
Long TE
Ogni immagine possiede una rappresetazione nel
corrispondente K spazio
Spazio delel frequenze
K Spazio
Spazio immagine
FT
K spazio
acquisito
Trasformata
di Fourier
T1-Weighted Images
Le sequenze per acquisire immagine pesate in T1 sono
create e ottimizzate per creare immagini con contrasto
tra sostanza grigia, bianca e liquor
Tre fette assiali:
Risoluzione spaziale di 1 mm3
Tempo d`acquisizione per l`intero cervello 10 minuti
Zoom In
• La sostanza grigia è ben
definita
– Si può misurare lo spessore
della corteccia e provare a
correlare il dato con l`età e/o
malattia o altri parametri
• Puntini e linee bianche:
artefatti da flusso
arterioso
• E` possibile acquisire a
una maggiore risoluzione
spaziele
– Con un lo svantaggio di
aumentare il tempo di
acquisizione
-26-
Tre fette di uno stesso volume
• Una singola acquisizione genera immagini rumorose
• L`immagine precedentemente mostrata era la media
di 4 acquisizioni (per aumentare SNR)
-27- MRI può essere 2D o 3D
• La
Un`immagine di cattiva qualità
• Il soggetto ha mosso la testa durante l`acquisizione
– Artefatti di Ghosting and ringing
– Potrebbe essere utile solo per alcuni scopi clinici,
-28ma non a scopi quantitativi di ricerca
Variazioni strutturali
Le regioni celebrali mostrano diversi patterns di variazione
volumetrica durante il corso della vita
Questi effetti sono da attribuire
principalmente alla diminuzione di
densit’ sinaptica e poi alla morte
cellulare
Diffusione dell`acqua
La diffusione è un movimento
casuale (moto Browniano)
dovuta all`energia termica
La diffusione è strettamente
legata all`ambiente in cui si
trovano le molecole d`acqua
Einstein 1905, 5 articoli sul
moto Brownian
Diffusione dell`acqua
• Nei tessuti la diffusività dell`acqua
è condizionata dalla composizione
dall`ambiente cellulare
• Se le membrane delle cellule sono
disposte con direzionalità coerente
la diffusione sarà anisotropica
MRI: Diffusione dell`acqua
Fibre sostanza bianca
Isotropia
Anisotropia
MRI: Diffusione dell`acqua
Acqua
Elissoide di diffusione
Fibre sostanza bianca
• L`anisotropia può essere utilizzata per
seguire i fasci di sostanza bianca
Tensore di diffusione
 Dxx Dxy Dxz   V1x V1 y V1z   1
  V1x V2 x V3 x 
 
 
 
 

D   Dxy Dyy Dyz   V2 x V2 y V2 z    2
  V1 y V2 y V3 y 
 D D D  V V V  
 V V V 

yz
zz   3 x
3y
3z  
3   1z
2z
3z 
 xz
1  2  3
1
• Autovalore maggiore
• Autovettore maggiore:
3
FA 
    
V
V1 y
D
1  2  3
1x
2
i 1, 2 , 3
2
i

i 1, 2 , 3
2
i
3
V1z

T
Biomarkers micro-strutturali
Mean diffusivity (MD=media{λi=1,3}) ≈ magnitudine diffusione
Fractional anisotropy (FA=var{λi=1,3}/magn{D}) ≈ direzionalità
FA = 0 diffusione isotropica (CSF)
FA = 1 diffusione ad alta anisotropia (sostanza bianca)
• La sostanza bianca ha
bassa MD ed alta FA
MD
FA
• La sostanza bianca
compromezza
strutturalmente ha alta
MD e bassa FA
Mappe DTI
Imamgine non
pesata in
diffusione
-36-
Fractional
Anisotropy
FA colorata perla
direzionalità delle
fibre:
x = Rosso y = Verde
z = Blue
Mappa a colori dei principali
fasci
FA: Fractional Anisotropy; <D>: Mean Diffusivity
Mappa Tensor
a colori
Field of Diffusion
Ellipsoids
Zoom sul corpo calloso che presenta
un andamento delle fibre lungo l`asse X
Fiber tracking
Trattografia
Trattografia: Corpo Calloso
Trattografia:
Fascio Corticospinale
Diffusione nell`Ictus
• La MD diminuisce nel tessuto cerebrale colpito da
ictus dopo pochi minuti dal blocco del vaso sanguigno
– Il rigonfiamento che inizialmente subiscono le
cellule causa una riduzione di spazio extracellulare, il quale possiede un alta MD rispetto
all`ambiente intra-cellulare
• I danni causati dall`ictus non sono visibili dalla
convenzionali immagini pesate in T1 o in T2 prima di
2-3 giorni dal blocco del vaso
• Le immagini di diffusione oggi sono comunemente
utilizzate per valutare le regioni che hanno subito
danni
da ictus
-43-
Diffusione nell`Ictus
Acquisizione dopo 4 ore dall`esordio
-44-
Functional MRI (fMRI)
FMRI è una tecnica utilizzata per misurare la variazione
di ossigeno durante l`attività neuronale
Riposo
Attività
L`incremento dell`attività neuronale comporta un aumento del segnale MR
riposo
task
Paradigma
0
20
40 s …….
8 blocchi di ripetizioni del task per 20 s
In ogni blocco vengono
acquisite 10 immagini
Segnale fMRI
Andamento del segnale
temporale al massimo
dell’attivazione durante il
task (in rosso il regressore).
Segnale fMRI
Fittinf del segnale
temporale al massimo
dell’attivazione durante il task (blu)
e il segnale (rosso) .
fMRI finger tapping
riposo
task
Paradigma
0
20
40 s …….
8 blocchi di ripetizioni del task per 20 s
In ogni blocco vengono
acquisite 10 immagini
fMRI scacchiera tremolante
MRI
Fornisce
informazioni
anatomiche basate
sulla localizzazione
spaziale del segnale
dell’acqua
1H
MRS
Fornisce informazioni
biochimiche basate
sulla quantificazione
di metaboliti
intracellulari
1H
13C
31P
23Na
19F
Quantificazione assoluta
Significa calcolare la concentrazione molare dei
metaboliti:
• Esterno: una soluzione a concentrazione nota.
Il segnale generato confrontato con quello dei
metaboliti
• Interno: Preso come riferimento un metabolita a
concentrazione nota (ATP, H2O).
Il segnale nel dominio delle freqeunze
Trasf.
Fourier
dominio del tempo
Cr
Cho
mI
NAA
dominio delle frequenze
E’ più facile per l'occhio umano valutare lo spettro
nel dominio delle frequenze perché i segnali dei
metaboliti sono risolti e rappresentati in “picchi”
Il segnale NMR
Dipende dal rapporto giromagnetico g, dall’abbondanza
naturale del nucleo e dal campo magnetico:
  g N B0
Il rapporto segnale/rumore (SNR)
Il rivelatore registra non solo il segnale ma anche il
rumore durante l’esperimento per questo si definisce il
rapporto SNR per valutare uno spettro.
Signal Noise Ratio (SNR)
Dipende da:
• Il nucleo che si guarda (g)
• L’abbondanza naturale
• Il volume che contribuisce al segnale (Vc)
• La concentrazione del nucleo all’interno del volume
• Il campo magnetico (B0)
• La bobina (B1)
• Il numero di acquisizioni o medie (n)
• La sequenza di impulsi
Calcolo SNR
SNR= Signal/Noise
S = Area picco massimo
dev. std. (noise)
Si utilizza la deviazione standard perché il valor medio del
rumore calcolato su un gran numero di campioni è 0
Perché acquisire più medie
Spettro del muscolo: 32 medie
Spettro del muscolo: 8 medie
32 medie
8 medie
Apodizzazione
Manipolazioni dei dati nel dominio del tempo,
senza alterare le frequenze, per migliorare SNR.
L’SNR migliora perché diminuisce il rumore
ma diminuisce anche S (in misura inferiore)
.
Filtro Gaussiano
Filtro Lorentziano
La gaussiana,va a zero più
velocemente rispetto alla lorentziana
31P
MRS muscolo scheletrico
PCr
LG
Pi
MG
coil
coil
PME
PDE
So
ATP
g
a
b
Aumento SNR tramite somma spettri e apodizzazione
PCr
Quantificazione assoluta
ATP
g
Pi
a
[PCr], [Pi]
b
ATP standard interno; [ATP] = 8.0 mM
e calcolare:
Mg2+
pH
dPi
10
dATPb
0
-10
-20
ppm
pH, [Mg2+], [ADP]
Preprocessing
• Somma
• Fase
• Somma
Elaborazione spettri
Calcolo dell`area sottesa ad ogni picco dello spettro
AMARES è un algoritmo operatore dipendente
3
PCr
Pi
PDE
ATP
1 2
g
a
45
67
b
8 9 10
Risultati elaborazione spettri
Pi
PCr
b-ATP
dPi=Freq(Pi) – Freq(PCr)
[PCr] = Ampl(PCr) / Ampl(b-ATP) * 8 mM
[Pi] = Ampl(Pi) / Ampl(b-ATP) * 8 mM
Valutazione elaborazione spettri
Valutazione elaborzione:
• Qualitativamente: l’ampiezza dei
residui dei segnali
• Quantitativamente:
1 SNR (dato da PCr/noise)
2 CRB: 2* SD/Ampiezza S
Cramer-Rao Bound
CRB: 2*SD/Ampiezza S
CRB(Pi)0.079=7.9%
31P
MRS a diverse condizioni
metaboliche
serve a valutare:
funzionalità respiratoria
mitocondriale individuale
Esercizio
Flessioni plantari isocinetiche
di intensità crescente
ATPasi miosinica
ATP + H2O
ADP + Pi
Creatina chinasi
PCr + ADP +H+
Cr + ATP
(dPi  3.9)
pH  6.77  log
(5.68 d Pi)
PCr
pH end-ex = 6.65
ATP
AT
Pi
P
dPi
Row
g
a
b
pH rest = 7.06
1H
Single-voxel
Multi-voxel
MRS
NAA
Cr
Cho
mI
Single voxel 1H-MRS
RF
Gz
z
x
Gx
z
y
Gy
z
Segnale
x
Single voxel 1H-MRS
NAA
m-I
Cho
Cr
Lip
Glx
s-I
Lac
ppm
4








3
NAA, N-acetil aspartato: marker neuronale
Glx, glutammato+glutammina: neurotrasmettitori
Cr, creatina+fosfocreatina: marker metabolismo energetico
Cho, composti colinici: marker gliale
mI, mio-inositolo: marker della osmoregolazione
sI, scillo-inositolo: marker della funzionalità di membrana
Lac, lattato: marker metabolismo glucidico
Lip, lipidi: marker del metabolismo lipidico
2
1
-OOC
- CH- CH2- COO-
Cr
NH
NAA
CO
NH
H2N
CH3
C
N
CH3
Cho
HO
CH2
CH2
N(CH3)3
CH2
COO-
NH
Cr
H2N
C
N
CH3
CH2
COO-
HO
CH2
CH2
N(CH3)3
Segnale dell’acqua in 1H-MRS
H2O  55M
NAA
-3.0
-2.0
-1.0
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
Metaboliti
pochi mM
Soppressione dell’acqua
Segnale dell’acqua
non soppersso
Segnale dell’acqua
soppresso
Quantificazione assoluta I
Utilizziamo come riferimento interno il picco dell`acqua
• Abbondante concentrazione  55 M
• Ottimo SNR
Conc[met]

Conc[water]S[metab]/S[water]
Quantificazione assoluta II
S 0 (met ) numAcq( H 2O) numH ( H 2O)
[met ]  0.75  55.5 10 


S 0 ( H 2O) numAcq(met ) numH (met )
3
S0(met): segnale dei metaboliti estrapolato al tempo 0
S0(H2O): segnale dell’acqua estrapolato al tempo 0
numAcq(H2O): numero di acquisizioni dello spettro dell’acqua
numAcq(met): numero di acquisizioni dello spettro dei metaboliti
numH(H2O): numero protoni che contribuiscono al segnale dell’acqua (2)
numH(met): numero protoni che contribuiscono al segnale del metabolita
T2: Tempo di rilassamento
trasversale
1.2
1
0.8
S
T2=200ms
T2=400ms
T2=800ms
0.6
0.4
0.2
tempo
0
0
100
200
300
400
500
600
più è lungo il T2 più il segnale decade lentamente
Ampiezza del segnale
Quantificazione assoluta III
Decadimento
acqua
T2 Acqua
T2 Metaboliti
TE
Influenza TE nello spettro
TE 70 ms
TE 35 ms
Lipidi, T2 corto
Passi dell’elaborazione
Peak-Peaking conNAA
AMARES
Cr
Myo
Cho
Glx
Risultato Amares
A bassi TE non è possibile
valutare il segnale delle
macromolecole che comporterà
un errore nella valutazione dei
metaboliti
Macromolecole
0
LCModel
4.0
3.8
3.6
3.4
3.2
3.0
2.8
2.6
2.4
2.2
2.0
1.8
Chemical Shift (ppm)
1.6
1.4
1.2
1.0
0.80
0.60
0.40