Biologia Molecolare
CDLM in CTF 2010-2011 – La modificazione dell’RNA e la traduzione
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La maturazione del trascritto primario
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I microRNA
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Le componenti del macchinario di traduzione
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Il meccanismo della traduzione
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La maturazione dell’RNA messaggero procede
attraverso vari passaggi:
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Rimozione degli introni e giunzione degli esoni
(SPLICING)
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Aggiunta di una metil-guanosina al 5’
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Aggiunta di una coda di poliA al 3’
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Lo splicing è stato osservato in organismi semplici come
un processo indipendente dall’intervento dello
spliceosoma
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Lo spliceosoma interviene nella maturazione della
maggior parte degli mRNA degli eucarioti pluricellulari
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5 piccoli RNA (snRNA)
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Più di 200 proteine
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I complessi si chiamano snRNP (U1, U2, U4, U5 e U6)
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Fare scansione
•  Resistenza alle 5’deossiribonucleasi
•  Efficienza dello
splicing
•  Riconoscimento
dell’estremità per la
traduzione
Poli(A) Polimerasi
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La maturazione del trascritto primario
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I microRNA
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Le componenti del macchinario di traduzione
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Il meccanismo della traduzione
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I siRNA sono piccoli RNA che operano
autosilenziamento (stesso locus)
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Sono di solito complementari al 100% alle sequenze
bersaglio
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I microRNA (o miRNA) sono coinvolti nei processi
di eterosilenziamento
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La complementarietà è inferiore al 100%
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I trascritti primari dei geni
miRNA sono chiamati primiRNA.
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I pri-miRNA vengono tagliati
da un enzima chiamato Drosha
in molecole più piccole, a
doppio filamento, chiamate premiRNA.
•  I pre-miRNA vengono esportati nel citoplasma e tagliati in RNA
doppio filamento più piccoli da un altro enzima chiamato Dicer.
•  Uno dei due filamenti contiene il miRNA maturo, lungo
solitamente tra i 19 e i 25 nucleotidi, che viene incorporato in
un complesso proteico chiamato RISC.
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I miRNA nei RISC sono in grado di legarsi a siti specifici di
mRNA provocandone il silenziamento:
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L’appaiamento della sequenza del miRNA con il suo sito
bersaglio non è perfetto, ma può contenere bulge e loop.
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Dalle coppie miRNA/target individuate sperimentalmente
emergono alcune regolarità nelle modalità di appaiamento.
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La regione iniziale (5’) del miRNA è chiamata
seed e sembra essere la regione più importante
nel silenziamento.
E’ lunga solitamente tra i 7 e i 10 nucleotidi, ma
esistono casi di seed più corti o più lunghi.
Tale regione è solitamente appaiata in modo
perfettamente complementare al suo target:
Il primo nucleotide del miRNA non
determinante e può non essere appaiato.
è
•  La regione a valle del seed contiene solitamente un bulge
o un loop:
•  La regione 3’ del miRNA mostra solitamente una
complementarità imperfetta al suo target.
•  Le coppie G:U nella regione del seed sembrano essere
sfavorevoli al silenziamento, sebbene siano ammesse,
mentre sono abbastanza comuni nella regione 3’.
•  Infine, le regioni di legame dei miRNA si trovano nella
regione 3’ UTR degli mRNA bersaglio.
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I miRNA svolgono un ruolo centrale nel controllo di numerosi
processi fisiologici:
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Aberrazioni nella loro espressione (mancanza, sotto o sovra
espressione) sono correlate a diversi tipi di patologie:
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Sviluppo
Differenziamento cellulare
Apoptosi
Cancro
Malattie neurodegenerative
Malattie cardiache
Si tratta dunque di molecole molto importanti, il cui studio è
fondamentale nella comprensione dei processi biologici, dei
fenotipi patologici e, di conseguenza, nel design di terapie
innovative.
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La maturazione del trascritto primario
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I microRNA
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Le componenti del macchinario di traduzione
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Il meccanismo della traduzione
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Procarioti: ribosomi 70s
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50s grande
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30s piccola
Eucarioti: ribosomi 80s
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60s grande
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40s piccola
Sono molecole adattatrici che legano e trasportano
aminoacidi specifici.
Due porzioni particolarmente importanti sono:
•  ANTICODONE : sequenza di 3 nucleotidi
complementari al codone corrispondente
all’aminoacido legato al tRNA.
•  Sito di attacco dell’aa. : sequenza 5’CCA-3’, uguale in tutti tRNA.
MET
L’anticodone si appaia in maniera specifica al codone
sull’mRNA in modo da permettere al tRNA di trasportare
l’aminoacido corrispondente quando questo viene richiesto
dalla informazione contenuta sul messaggero
MET
AUG UUAG
CUUC
GCGA
UAUC
Quanti sono i tRNA?
UNA LOGICA DEDUZIONE PER QUANTO DETTO FIN’ORA E’ CHE DOVREBBERO
ESSERCI 61 tRNA DIVERSI, UNO PER CIASCUN CODONE; CIO’ IMPLICHEREB BE DUE
COSE:
1.  GRANDE CONSUMO ENERGETICO DA PARTE DELLA CELLULA;
2.  tRNA AVENTI ANTICODONI DIFFERENTI DEVONO PORTARE LO STESSO aa.
IN REALTA’ QUESTA CONDIZIONE E’ VERA SOLO PER ALCUNI tRNA, PER LA MAGGIORPARTE
(NELL’UOMO ESISTONO INFATTI SOLO 48 ANTICODONI DIFFERENTI A FRONTE DEI TEORICI 61
POSSIBILI), PERO’, SUSSISTE IL FENOMENO DEL “VACILLAMENTO” DELLA TERZA BASE, PER CUI
SI POSSONO FORMARE LEGAMI ANCHE “NON ORTODOSSI” FRA IL NUCLEOTIDE IN POSIZIONE 5’
DEL tRNA E IL NUCLEOTIDE IN 3’ DELL’mRNA.
• Adenilazione aminoacido
• AMP rilasciato e legame
al tRNA
• Rilascio aminoacil tRNA
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La maturazione del trascritto primario
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I microRNA
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Le componenti del macchinario di traduzione
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Il meccanismo della traduzione
Le fasi della traduzione nei procarioti
1)  Inizio: la subunità minore del ribosoma si lega al messaggero. Il primo tRNA (quello della fMET)
con anticodone complementare alla tripletta AUG, che rappresenta il segnale di inizio, si lega in
corrispondeza del codone. Questo scatena il legame della subunità maggiore e l’inzio della
trascrizione.
2)  Allungamento: il ribosoma si sposta in direzone 3’ sul mRNA. I tRNA si lagano uno dopo l’altro ai
codoni che via via vengono incontrati dal ribosoma mentre “legge” il filamento ribonucleotidico. Il
ribosoma catalizza di volta in volta il legame tra l’aminoacido già presente all’interno del sito attivo
ed il nuovo aminoacido appena entrato nel ribosoma allungando la catena proteica nascente di un
aminoacido alla volta.
3)  Terminazione: Quando il ribosoma incontra un segnale di stop nessun tRNA si lega al sito attivo
del ribosoma. Si lagano invece specifici fattori di terminazione proteici che interrompono la
traduzione e facilitano la destabilizzazione del complesso.
La Fase di inizio nei procarioti
1)  Le subunità minori libere (non legate a subuinità maggiori) e legate al fattore proteico di inizio IF-3
sono ingrado di legarsi all’RNA messaggero in corrispondenza di una regione particolare
contenente:
•  Un esanucleotide chiamato sequenza di Shine-Dalgarno (AGGAGG) complementare ad un
tratto dell’RNA ribosomiale 16s
•  Un codone di start AUG a circa 10 basi dalla sequenza Shine-Dalgarno
2)  Il fattore proteico di inizio IF-2 si lega in corrispondenza di un sito particolare del ribosoma, il sito
P che è ancora nel suo stato parziale perché è costituito soltanto dalla subunità minore. Il legame di
IF-2 permette l’attacco del primo aminoacil-tRNA, quello della formil metionina chiamato fMettRNAf
3)  Questo complesso permette alla subuinità maggiore di legare la subunità minore già posizionata
sull’mRNA. Il complesso viene facilitato da un altro fattore proteico chiamato IF-1
4)  L’associazione delle due subunità provoca il rilascio di tutti i fattori proteici di inizio (IF)
Soltanto il fMet-tRNAf è capace di legarsi al sito P parziale ed è questo il motivo
perché il primo codone AUG viene riconoscuto da questo aminoacil-tRNA
mentre gli AUG interni vengono riconosciuti dal Met-tRNA m
L’inizio della traduzione nei procarioti
fMet
Large
subunit
E
P
A
La traduzione inizia col riconoscimento
dell’mRNA da parte della subunità minore.
Il legame del tRNA della fMET (con
anticodone complementare ad AUG) permette
il legame della subunità maggiore.
UAC
5’
GAG...CU-AUG--UUC--CUU--AGU--GGU--AGA--GCU--GUA--UGA-AT GCA...TAAAAAA
Small mRNA
subunit
3’
La Fase di allungamento nei procarioti
1)  All’inizio della fase di allungamento il sito P si trova occupato dalla formil-metionina legata al suo
tRNA, il sito A è disponibile per l’interazione di un nuovo aminoacil-tRNA a patto che l’anticodone
sia complementare al codone successivo all’AUG
2)  L’aminoacil-tRNA entra nel sito A soltanto se legato ad un fattore di allungamento: EF-Tu. Questo
fattore deve trovarsi nella sua forma “carica” cioè legato a GTP.
3)  Una volta dentro il sito A, la subuinità maggiore del ribosoma catalizza l’idrolisi del GTP in GDP il
che fornisce l’energia per creare il nuovo legame peptidico tra il nuovo aminoacido a la fMet.
4)  L’EF-Tu scarico (col GDP) si stacca e va a finire nel citoplasma dove viene RICARICATO da un
altro fattore di allungamento (EF-TS), tornando ad essere disponibile per il legame ad un altro
aminoacil-tRNA
5)  Nel frattempo il ribosoma effettua la TRASLOCAZIONE. Scorre sull’RNA messaggero verso la
direzione 3’ spostando il tRNA iniziatore nel sito E e il tRNA legato al peptide nascente nel sito P. Il
sito A è di nuovo libero per la interazione di un nuovo aminoacil-tRNA
6)  La fase di allungamento si itera dal punto 1
La fase di allungamento
Un nuovo aminoacil tRNA
(complesso tra tRNA ed il suo
aminoacido corrispondente)
entra nel sito A del ribosoma. Il
suo anticodone è complementare
al codone che si trova in
corrispondenza del sito A. Il
primo aminoacido (la metionina)
presente nel sito P si troverà
quindi vicino ad un nuovo
aminoacido appena trasportato
dal suo tRNA. La subunità
maggiore del ribosoma catalizza
il legame di questo nuovo
aminoacodo con la metionina. Il
legame della metionina con il
suo tRNA viene rotto.
La fase di allungamento
A questo punto abbiamo un tRNA “scarico” nel sito P,
un tRNA legato alla catena nascente (di due aminoacidi,
al momento) nel sito A. Il ribosoma si sposta a sinistra
sull’mRNA: il tRNA vuoto viene liberato nel citoplasma,
il tRNA legato a 2 aminoacidi viene spostato nel sito P
ed il sito A è di nuovo disponobile per l’attacco di un
nuovo aminoacil-tRNA.
Il processo viene iterato allungando ogni volta la catena
nascente di un aminoacido, seguendo le istruzioni scritte
sul messaggero.
La fine della traduzione
Quando il ribosoma, legato alla catena proteica nascente,
raggiunge un codone di stop, invece di un aminoaciltRNA, nel sito A si lega un fattore di terminazione. La
proteina nascente lascia il suo tRNA, il ribosoma si
destabilizza e la sintesi della proteina finisce.
La traduzione negli eucarioti
La traduzione procede in maniera abbastanza simile negli eucarioti anche se ci sono alcune
piccole differenze.
Il tRNA iniziatore per la metionina, sebbene sia strutturalmente e funzionalmente diverso da
quello utilizzato nei codoni AUG interni trasporta una metionina non modificata.
I fattori accessori sono più numerosi
Il riconoscimento della regione di attacco della subunità minore non è mediato dalla sequenza di
Shine-Dalgarno ma dalla presenza del cap il 5’. Una serie di proteine formano dei complessi
che interagendo permettono al ribosoma di posizionarsi in maniera corretta.