Dal RNA alle proteine: la traduzione TRADUZIONE: SINTESI DI PROTEINE Trascrizione: copiare un messaggio usando lo steso linguaggio (o quasi). Traduzione: copiare un messaggio usando un linguaggio diverso: Il codice gene4co Replicazione del DNA Riparazione del DNA Ricombinazione gene4ca Sintesi del RNA Trascrizione Sintesi delle proteine Traduzione Biotecnologie Agro-­‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Dal RNA alle proteine: la traduzione Il codice geneHco è faKo di parole di tre leKere (basi): codoni 4 nucleoHdi in gruppi di 3: 4 x 4 x 4 = 64 parole 20 aminoacidi Questo codice è quasi universale, a eccezione di alcune differenze in mitocondri e alcuni protozoi e funghi. Biotecnologie Agro-­‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Dal RNA alle proteine: la traduzione Come è stato decifrato il codice geneHco? Primi anni sessanta. -­‐  Prima di tuKo, si è creato un sistema acellulare (cell free system) per studiare la sintesi di proteine in assenza di tuY gli altri componenH cellulari. Come? Prendendo i componenH del citoplasma di E. coli e centrifugando ad alta velocità per tenere solo la parte solubile: ribosomi e molecole; gli mRNA baKerici si distruggono con una ribonucleasi. -­‐  Secondo, si sono creaH polinucleoHdi faY di solo U (e poi solo A e solo C), e si sono aggiunH al sistema acellulare, insieme ad amminoacidi radioaYvi isolaH, uno per esperimento. Così si sono capiH tre codoni: UUU (fenilalanina), AAA (lisina) e CCC (prolina). -­‐  Terzo, si sono creaH tripleKe di nucleoHdi, e usandoli uno a uno insieme a ribosomi e amminoacidi isolaH, si è capito tuKo il codice geneHco. Biotecnologie Agro-­‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Dal RNA alle proteine: la traduzione Un polinucleoHde si può leggere in tre maniere, a seconda se si comincia dal primo, dal secondo o dal terzo nucleoHdi a fare i codoni, ma in ogni mRNA c’e soltanto un messaggio correKo che produce una proteina funzionale: c’e un solo modulo di le;ura correKo (reading frame). Biotecnologie Agro-­‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Dal RNA alle proteine: la traduzione Gli RNA transfer (tRNA): adaKatori per appaiare ogni codone al suo amminoacido. Lungi ˜80 nucleoHdi, un stremo lega il codone appaiando tre nucleoHdi: l’an4codone. L’altro stremo (3’) lega il amminoacido codificato dal anHcodone. Biotecnologie Agro-­‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Dal RNA alle proteine: la traduzione Ci sono più tRNA di 20: -­‐  Alcuni amminoacidi legano più di un Hpo di tRNA (anHcodoni diversi ma ‘sinonimi’). -­‐  Alcuni tRNA legano più di un codone, legando più specificamente i primi due nucleoHdi ma essendo meno esigenH per il terzo nucleoHde (appaiamento oscillante). Esempio: arginina: AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, CGU 64 codoni ˜40 tRNA 20 ammino
acidi Biotecnologie Agro-­‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Dal RNA alle proteine: la traduzione Il secondo adaKatore per decifrare il codice geneHco: le amminoacil-­‐tRNA sintetasi. Sono gli enzimi che legano il giusto amminoacido al corrispondente tRNA (o tRNAs). Sono in grado di riconoscere sia delle sequenze nei tRNA che la struKura del amminoacido a legare, e usano energia (ATP) per catalizzare la formazione di un legame ad alta energia. Legame ad alta energia tRNA sintetasi Biotecnologie Agro-­‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Dal RNA alle proteine: la traduzione Biotecnologie Agro-­‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Dal RNA alle proteine: la traduzione Già ne abbiamo il messaggero e i tRNA pronH, ora ci manca la macchina molecolare per meKerli insieme: i ribosomi. Biotecnologie Agro-­‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Dal RNA alle proteine: la traduzione I ribosomi sono faY di proteina (proteine ribosomiche) e rRNA (RNA ribosomico), che si trascrive nei nucleoli, dove si assemblano le subunità ribosomiche: -­‐  Subunità maggiore -­‐  Subunità minore Subunità maggiore Subunità minore Biotecnologie Agro-­‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Dal RNA alle proteine: la traduzione Biotecnologie Agro-­‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Dal RNA alle proteine: la traduzione Le due subunità si legano fra di loro aKorno a un mRNA, e si slegano alla fine della traduzione. Nel ribosoma ci sono un sito di legame per il mRNA e tre siH per i tRNA. Sito A: amminoacil-­‐tRNA Sito P: pep4dil-­‐tRNA Sito E: exit (uscita) Biotecnologie Agro-­‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Dal RNA alle proteine: la traduzione LA SINTESI DELLE PROTEINE Comincia dall’estremità 5’ del mRNA. Le due subunità si legano al mRNA e cominciano la sintesi. I siH A, P ed E si occupano due alla volta. Arriva un tRNA-­‐aa nuovo (4) che si appaia al codone nel sito A, subito dopo il codone precedente. Biotecnologie Agro-­‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Dal RNA alle proteine: la traduzione Messi uno accanto all’altro, gli aa ai posH P e A vengono legaH in maniera covalente (legame pepHdico), grazie all’azione enzimaHca della subunità maggiore del ribosoma e alla energia liberata dal legame fra tRNA e amminoacido (3). In questa configurazione, l’estremità carbossilica del amminoacido in P si lega alla’estremità amminica del amminoacido in A: la proteina si sinteHzza dall’estremità ammino a quello carbossile. Biotecnologie Agro-­‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Dal RNA alle proteine: la traduzione Dopo la formazione del legame pepHdico, la subunità maggiore si sposta verso l’estremità 3’ del mRNA. Il tRNA dove l’ulHmo amminoacido è stato incorporato e legato al polipepHde in crescita si sposta dal sito A al sito P, e il tRNA vuoto dal sito P al sito E. Biotecnologie Agro-­‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Dal RNA alle proteine: la traduzione La subunità minore si sposta a seguito di quella maggiore, rendendo accessibile il sito A al prossimo tRNA-­‐aa in arrivo. Biotecnologie Agro-­‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Dal RNA alle proteine: la traduzione Col arrivo de un nuovo tRNA che entra nel sito A si ricomincia il ciclo da capo. I ribosomi degli eucarioH fanno questo ciclo due volte al secondo: allungano la catena polipepHdica di due amminoacidi al secondo. Quelli dei procarioH vanno anche più velocemente. Queste reazioni sono aiutate da faKori proteici: fa;ori d’iniziazione, allungamento e terminazione . Biotecnologie Agro-­‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Dal RNA alle proteine: la traduzione Biotecnologie Agro-­‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Dal RNA alle proteine: la traduzione Biotecnologie Agro-­‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Dal RNA alle proteine: la traduzione Il ribosoma è faKo 1/3 di proteina e 2/3 di RNA, ed è il rRNA ad avere un ruolo centrale nella struKura e nella funzione del ribosoma: è un ribozima. Gli rRNA formano il cuore del ribosoma, le proteine si legano sulla superficie, stabilizzando gli rRNA e aiutando nei cambiamenH conformazionali necessari per la sua aYvità cataliHca. I siH A, P ed E e il sito cataliHco sono faY da rRNA. Nel sito cataliHco, le interazioni fra i rRNA e i tRNA avvicinano e orientano i due amminoacidi che si devono unire per legame pepHdico, per procedere alla catalisi di questo legame. StruKura di due dei rRNA e una proteina della subunità maggiore ribosomiale Biotecnologie Agro-­‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Dal RNA alle proteine: la traduzione Biotecnologie Agro-­‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Dal RNA alle proteine: la traduzione Biotecnologie Agro-­‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Dal RNA alle proteine: la traduzione In più deKaglio: l’inizio della traduzione nei eucarioH. TuKe le proteine cominciano da un codone d’inizio: AUG, al quale corrisponde il amminoacido Met. Il primo tRNA-­‐Met è il tRNA iniziatore, diverso d’altri tRNA-­‐Met, il unico in grado di legarsi alla subunità minore: -­‐ prima si legano i fa;ori d’inizio della traduzione, -­‐ dopo si lega il tRNA iniziatore, -­‐ e finalmente tuKo il complesso si lega all’estremità 5’ (riconosciuto dal cappuccio) di un mRNA per iniziare la traduzione. Biotecnologie Agro-­‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Dal RNA alle proteine: la traduzione Una volta legata al mRNA, la subunità minore si muove verso l’estremità 3’ in ricerca del primo AUG dove cominciare la traduzione. Quando lo trova, i faKori d’inizio si slegano e si unisce la subunità maggiore, completando il ribosoma. Col arrivo del secondo tRNA-­‐aa comincia la traduzione. Biotecnologie Agro-­‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Dal RNA alle proteine: la traduzione Nei baKeri i messaggeri non hanno un cappuccio 5’. In vece ci sono delle sequenze nucleoHdiche a monte del AUG che indicano l’inizio di ogni gene, e dove i ribosomi si legano. I messaggeri dei baKeri sono policistronici: ci sono diversi geni in ogni messaggero, ognuno con la sua sequenza d’inizio. Così la traduzione di ogni gene al interno del messaggero può cominciare indipendentemente degli altri. Biotecnologie Agro-­‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Dal RNA alle proteine: la traduzione Sia nei procarioH che nei eucarioH l’arrivo a un codone di terminazione (UAA, UAG, UGA) segnala la fine del messaggio. Non ci sono tRNA per legare quesH codoni. In vece si legano i fa;ori di rilascio, che modificano la procedura in modo di legare una molecola di acqua all’estremità C-­‐
terminale della proteina, che è finita. La proteina si stacca dal ribosoma, il ribosoma si separa dal mRNA e le subunità si staccano. Biotecnologie Agro-­‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Dal RNA alle proteine: la traduzione A un solo messaggero si aKaccano diversi ribosomi, partendo dal codone d’inizio e man mano che il ribosoma precedente avanza lungo il messaggero. Così si formano i poliribosomi, che sinteHzzano tante coppie della proteina simultaneamente. Biotecnologie Agro-­‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Dal RNA alle proteine: la traduzione Biotecnologie Agro-­‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Dal RNA alle proteine: la traduzione I ribosomi baKerici e quelli eucariHci hanno piccole differenze. Queste sono state sfruKate dai funghi per creare delle tossine in grado d’inibire la sintesi di proteine baKeriche: molH degli anHbioHci. Tetraciclina Ostacola il legame del amminoacil-­‐tRNA al sito A del ribosoma ba;erico Streptomicina Impedisce il passaggio del ribosoma dalla modalità d’inizio a quella d’allungamento; induce pure errori di codifica Cloramfenicolo Blocca la reazione della pep4dil-­‐trasferasi sui ribosomi Cicloesimide Blocca la reazione di traslocazione sui ribosomi Rifamicina Blocca l’inizio della sintesi di RNA legando la RNA polimerasi Biotecnologie Agro-­‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Dal RNA alle proteine: la traduzione Quante copie di una proteina ci sono nella cellula dipende: -­‐della quanHtà che si sinteHzza -­‐di quanta proteina si distrugge Biotecnologie Agro-­‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Dal RNA alle proteine: la traduzione Meccanismi di regolazione della traduzione. -­‐  1. Repressione della traduzione mediata da proteine regolatrici che legano il mRNA nella regione 5’ non tradoKa. -­‐  2. Repressione della traduzione mediata da proteine che legano il mRNA nella regione 3’ non tradoKa. In alcuni casi lo fanno interagendo con i faKori d’iniziazione. Le proteine che legano il 3’UTR possono pure localizzare gli mRNA in posH specifici al interno della cellula, e questo può essere molto importante funzionalmente (ad esempio durante lo sviluppo embrionale). mRNA d’embrioni di Drosophila (blue) rilevaH per ibridazione in situ a fluorescenza (rosso: nuclei) Biotecnologie Agro-­‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Dal RNA alle proteine: la traduzione -­‐ 3. Micro RNA (miRNA): piccoli RNA a doppio filamento che regolano sia la trascrizione che la traduzione, interagendo con complessi proteici diversi in ogni caso. A livello del mRNA, i miRNA possono indurre la degradazione o soltanto inibire l’espressione, a seconda del mRNA bersaglio. Questo meccanismo è molto diffuso, e sembra importante come meccanismo veloce per regolare l’espressione genica. Biotecnologie Agro-­‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Dal RNA alle proteine: la traduzione -­‐ 4. Controllo globale della traduzione proteica: -­‐  Le cellule soKo stress possono ridurre la traduzione bloccando i faKori d’iniziazione della traduzione. -­‐  Le cellule sHmolate dai faKori di crescita possono aumentare i livelli di traduzione. Stress nutrizionale Stress del RER Stress ossidaHvo FaKori di crescita Biotecnologie Agro-­‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos Dal RNA alle proteine: la traduzione Il tempo fra sintesi e degradazione è la vita media della proteina. La degradazione è a carico di proteasi, che tagliano i legami pepHdici fino a ridurre le proteine ad amminoacidi. Queste si trovano: -­‐  Nei lisosomi. -­‐  Nel citoplasma, come componenH dei proteosomi, macchine per la degradazione di proteine con un centro cilindrico dove le proteasi si trovano all’interno. Le proteine che devono essere degradate dai proteosomi sono marcate con la ubiqui4na. Biotecnologie Agro-­‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos