29/02/2012
Il rischio per la salute della popolazione
correlato con l'assunzione di prodotti
fitosanitari attraverso la dieta, è un
problema del tutto attuale.
http://europa.eu
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Il Regolamento (CE) n. 369/2005 del 23 febbraio 2005 del Parlamento e del
Consiglio introduce il concetto di LMR.
Il regolamento fissa i quantitativi massimi di residui antiparassitari che possono
trovarsi nei prodotti di origine animale o vegetale destinati al consumo umano o
animale
In tutti quei casi in cui non è stato ancora fissato un LMR specifico, il tenore
massimo di residui antiparassitari ammesso negli alimenti è pari a 0,01 mg/kg
Il numero di molecole da monitorare è molto elevato si parla tranquillamente di
“centinaia” di sostanze da monitorare (…e sono comunque poche !)
ANALISI MULTIRESIDUALE
• La preparazione del campione riveste un ruolo sempre più importante
– Consumo di solventi,reagenti e soprattutto velocità
• L’analisi dei pesticidi sta sempre più abbandonando i classici rivelatori cromatografici (NPD, ECD, UV, PDA, FL, ecc.) per passare a quelli più specifici di Massa
– Meglio se in grado di effettuare esperimenti MS/MS
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Analisi multiresiduali
~200 principi attivi mediante tecnica LC-MS/MS
~200 principi attivi mediante tecnica GC-MS/MS
Tipi di matrici principalmente analizzate
Matrici vegetali
Alimenti
Estratti secchi
(le piu’ complesse)
Droghe vegetali
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MATRICI VEGETALI
(In particolare gli estratti secchi)
Contengono numerose sostanze e pertanto costituiscono delle miscele molto complesse dal punto di vista chimico. EFFETTO MATRICE
Soppressione ionica o Incremento ionico
Gli analiti di interesse in tali miscele sono generalmente presenti in tracce
Estrazione di tali analiti
Purificazione prima di procedere all’analisi strumentale
Sviluppare un metodo analitico che permetta di ridurre al minimo l’effetto matrice, senza effettuare ulteriori passaggi di purificazione.
Multiple Reaction Monitoring
(MRM) ‐ Quantitation
Sistema cromatografico: UHPLC shimadzu
Colonna: C18
Fase mobile: gradiente acqua/metanolo
Durata corsa cromatografica: 17 min 4
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Cos’è che permette a questo spettrometro di massa di ridurre efficacemente l’effetto matrice? Turbo VTM Gas Entrainment Ion Source
IonSpray position (horizontal)
IonSpray voltage
Turbo has an extended temperature range (750oC) and gas range is 0‐12 L/min
High curtain gas setting will attenuate signal
Extended source exhaust
housing
Room Air
Room Air
Drain with Fixed High Suction
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Electrospray Ionization Theory (positive mode shown)
Ion Spray Voltage (IS)
LC Gas 1 (GS1)
Flow
Droplet
Solvent molecule
Gas 2 (GS2)
& Heat (TEM)
+
Ion of interest
Curtain Plate
Curtain Gas(CUR)
+
+
+ ‐ +
+
+
+ ++
+
+
++‐ +++
++
+
+‐+++
+
+
+
+
Orifice
(DP)
1. Formation of Charged Droplets
2. Evaporation
3. Ionic repulsion w/clustering
4. Ions enter Mass Analyzer
Dati preliminari usando Ginkgo biloba come matrice per valutare l’effetto matrice
Matrice (1g)
Matrice (1g)
Matrice (1g)
Estrazione liquido‐liquido
Volume finale: 1 mL
Spike
(TQ)
10 ng/mL
Spike
Volume finale: 10 mL
(1: 10)
10ng/mL
Spike
Volume finale: 20 mL
(1: 20)
10ng/mL
Analisi strumentale
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Dati preliminari usando Ginkgo biloba come matrice (ES. Carbosulfan e Cinerina I) Aggiunta
AGGIUNTA
RECUPERO
ng/mL
RECUPERO
ng/mL
TQ
1:10
1:20
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Es. Fensulfothion oxon sulfone
LMR
LMR
0.25
0.5ng/mL
ng/mLIN
IN
SOLUZIONE
SOLUZIONE
I LIMITI MASSIMI DI RESIDUI (LMR) ≤ 0.010 mg/Kg
Matrice rappresentativa degli estratti
ottenuti dalle foglie
Matrice rappresentativa degli
estratti ottenuti dalle radici
Matrice rappresentativa degli estratti
ottenuti dai rami, fiori e infiorescenze.
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Matrice (1g)
Aggiunte da 50 e 100 µg/Kg
Estrazione liquido‐liquido
Purificazione prima dell’analisi strumentale
Volume finale: 20 mL
Analisi strumentale
Estratti ottenuti dalle foglie
Composto (LC‐MS‐MS)
(2,4,5‐Trichlorophenoxy)acetic
(2,4‐Dichlorophenoxy)acetic
4‐(2,4‐Dichlorophenoxy)Butanoic acid
Acephate
Acetamiprid
Acibenzolar‐S‐methyl
Acrinathrin
Aldicarb
Bensulfuron methyl
Bentazone
Benzoilprop ethyl
Benzthiazuron
Bromacil
Cadusafos
Carbaryl
Carbendazim
Carbofuran
Diphenamid
Diuron
DNOC
Edifenphos
Fenoxycarb
Fenpyroximate
Fensulfothion oxon sulfone
Fensulfothion sulfone
Formothion
Fosthiazate
Furathiocarb
Imidacloprid
Methamidophos
Methiocarb
Methomyl
Metsulfuron‐methyl
Oxasulfuron
Oxycarboxin
Paraoxon‐methyl
Pasaoxon‐ethyl
Prosulfocarb
Prosulfuron
Pyraclostrobin
Pyrazoxyfen
Thiametoxam
Thiodicarb
Tolyfluanid
Triasulsuron
Tribenuron‐methyl
Tricyclazole
Trifloxystrobin
Estratti ottenuti dalle radici
Recupero medio
%
76,7
91,7
CV
%
9,6
6,9
62,1
88,6
87
94,7
73,5
76,6
109,9
77,1
87,4
75,1
72,2
95,3
100,5
81,2
77,9
99,2
74,9
88
94,2
76,7
80
105,1
91,2
123,4
109,6
89,9
95,2
87,4
82,7
93,3
97,5
103,6
98,8
95,6
90,2
81,4
108,3
81,6
86,5
96,2
112,9
105,9
94,2
102,5
75,6
79,5
3,9
5,3
8,4
10,4
12,6
11,1
5,9
5,9
5,9
4,4
13,2
7,8
6,4
5
6,1
6,7
5,1
5,9
4,8
10,6
6,6
8,6
6,9
8,2
8,7
7,7
6,5
4,7
6,1
4,2
6,5
6,2
7,2
8,3
7,6
4,9
7,1
6,3
6,5
6,6
7,7
6,6
9,3
9
3,4
6
Composto (LC‐MS‐MS)
Acetamiprid
Aldicarb sulfone
Bromofenoxim
Carbendazim
Carbofuran‐3‐hydroxy
Imidacloprid
Metamitron
Methamidophos
Metsulfuron‐methyl
Monocrotophos
Acephate
Acibenzolar‐S‐methyl
Acifluorfen
Acrinathrin
Aldicarb
Carfentrazone ethyl
Chlorfluazuron
Chlorotoluron
Chloroxuron
Chlorphacinone
Cinerina I
Cinerina II
Dimethomorph mixture
Dinocap
Dinoseb
Dinoterb
Diphenamid
Fenoxycarb
Fenpyroximate
Fensulfothion oxon sulfone
Fensulfothion sulfone
Fosthiazate
Furathiocarb
Haloxyfop
Hexaconazole
MCPA
Mecarbam
Mecoprop
Methabenzthiazuron
Tebufenozide
Tebufenpyrad
Tebuthiuron
Teflubenzuron
Tricyclazole
Trifloxystrobin
Triflumuron
Quinmerak
Quinoxifen
Recupero medio
%
81,1
91,6
84,2
86,4
84,8
73,9
82,7
110,5
86,4
97,5
96,2
103,5
105,3
90,3
103,6
98,8
97,3
98,8
84
100,5
116,9
106
86
110,3
85,5
85,5
97,4
104,7
68,7
99,3
72,6
104,2
98,2
100,3
55,5
101,7
102,7
95
98,3
109,6
82,9
95,4
102,5
88,8
88,5
120,4
100,8
84,5
Estratti ottenuti dai fiori
CV
%
8,1
5,8
14,1
4,3
3,8
9,9
9,9
1,6
3,1
2,8
2,4
8,4
28,5
6
3,8
3,4
2,9
1,3
2,6
8,6
2,7
6,1
2,4
19,8
4,4
5,2
4,4
4,2
8
4,8
3,2
2,6
2
12
4
7,4
3,2
12,7
2,4
3,2
4,9
4,9
16,9
2,3
2,9
30,8
7,1
6,1
Composto (LC‐MS‐MS)
Asulam
Azimsulfuron
Azoxystrobine
Bentazone
Benthiocarb
Benzoilprop ethyl
Benzthiazuron
Dichlorprop
Dicrotophos
Diethofencarb
Dimethomorph mixture
Dinocap
Dinoseb
Dinoterb
Fenthion oxon sulfoxide
Fenthion sulfoxide
Fipronil
Flamprop isopropyl
Furathiocarb
Haloxyfop
Hexaconazole
Hexaflumuron
Hexythiazox
Methiocarb
Methomyl
Neburon
Nicosulfuron
Omethoate
Oxamyl
Oxasulfuron
Prochloraz
Propachlor
Propaquizafop
Propham
Propyzamide
Prosulfocarb
Prosulfuron
Pymetrozine
Quinmerak
Quinoxifen
Quizalofop‐ethyl
Rimsulfuron
Sulcotrione
Tebufenozide
Tebufenpyrad
Tebuthiuron
Tricyclazole
Recupero medio
%
109,9
95
73,5
95,6
74,4
90,2
103,8
118,9
88,6
70,5
70,5
91,5
88,6
85,1
94,5
82,2
77,6
85,8
84,1
95
78,5
81,9
84,1
81
91,9
73,7
88,2
98,6
87,8
79,8
71,6
84,9
84,1
113
77,3
86,3
73
77,1
85,8
74,8
81,4
86,5
89,9
85,1
90,8
77,9
71,8
CV
%
28,3
3,4
2,9
4,2
8,4
4,5
6,5
4,7
2,1
3
2,6
4,4
6,1
4
3,3
5,4
6,2
2,6
2,2
9,2
6
9,8
5,8
3,4
3,7
5,9
2,9
3,6
3
5,7
3,6
4,9
3,1
6,6
2,4
2,1
6,2
6,3
6
1,9
1,7
1,9
5,2
4,1
4,2
4,7
3,8
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Esempi di cromatogramma
aggiunta da 50 µg/Kg ( equivalenti a 2,5 ppb in soluzione) Fensulfothion oxon sulfone:
spike da 0.5 ppb e relativa accuracy in matrice idrofila
Standard
Bianco
Spike
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29/02/2012
Fensulfothion oxon sulfone:
spike da 0.25 ppb e relativa accuracy in matrice idrofila
Area
Standard
Bianco
Spike
Methomyl: spike 0.5 ppb e relativa accuracy in matrice lipofila
Standard
Bianco
Spike
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29/02/2012
Methomyl: spike da 0.25 ppb e relativa accuracy in matrice lipofila
Standard
Bianco
Spike
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29/02/2012
Esempio dell’ Ethiofencarb
Standard
Bianco
Campione
Spike
La sua sensibilità permette di poter effettuare diluizioni tali per cui l’effetto matrice risulta pressoché nullo.
Accoppiato ad un sistema UHPLC garantisce maggiore volocita’ di analisi e una maggiore affidabilita’ del dato analitico.
Per le sue caratteristiche AB sciex triple quad 5500 risulta essere uno strumento versatile e sicuramente adatto ad effettuare analisi multiresiduali su matrici molto complesse come gli estratti vegetali.
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Ringraziamenti
• Prof. Luigino Maggi
•Dr. Stefano Fiorina
• Dr. Stefano Maggi
•Dr. Daniele Bedogni
• Dr. Guido Premoli
• Dr. Paolo Piccinini
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