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ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE~',
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DELL'UMBRIA E DELLE MARCHE\,:., .""'; :/
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DELIBERAZIONE
DEL
DIRETTORE GENERALE
nO 295 del: 22/11/2012
Oggetto:
integrated
Ricerca
ana/ytica/,
Finalizzata anno
2010 - RF-2010-2311608
in vivo and in vitro approach
"An
to characterized
po/ybrominated dipheny/ ethers (POBEs) in /ta/ian musse/s : abasie for a
Toxic Equiva/ent Factors (TEF) proposar
" Principal investigator Roberta
Galarini - codice RF0012010 -CUP D91J2000670001.
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DELIBERAZIONE
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GENERALE
PREMESSO che in data 24 ottobre 2012 è stata stipulata la convenzione n. 293/RF2010-2311608 tra il Ministero della Salute - Dipartimento della sanità pubblica e
dell'innovazione - Direzione generale della ricerca sanitaria e biomedica e della
vigilanza sugli Enti e l'Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche,
allegata al presente atto per fame parte integrante e sostanziale, per l'esecuzione del
progetto di ricerca Finalizzata anno 2010 "An integrated analytical, in vivo and in vitro
approach to characlerize polybrominated diphenyl ethers (PDBEs) in Italian mussels:
a basic for a Toxic Equivalent Factors (TEF) proposal;
CONSIDERATO che tale Progetto di ricerca ha come Principal investigator Roberta
Galarini e che con il presente atto si prowede ad incaricarlo per tutto ciò che attiene
alla gestione operativa dello stesso;
PRESO ATTO che la ricerca ha la durata di anni tre, con inizio dal 1 dicembre 2012 e
termine il 30 novembre 2015;
VISTA la dichiarazione di regolarità tecnica rilasciata dal Responsabile
Ricerche, Convenzioni e Progetti Speciali, per quanto di competenza;
dell'U.o./)
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VISTA la dichiarazione di utilità per il servizio pubblico rilasciata dalla Dr.ssa Roberta
Galarini, in qualità di Principal investigator del progetto;
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DATO ATIO che il ricavo di competenza per l'Istituto, fissato in €uro 239.200,00
(fuori dal campo di applicazione dell'IVA), è rilevato al conto economico n. 41121501,
come risulta dall'attestazione del UOGEFIUB;
ATTESO che il ricavo
risconto contabile in
previste nel progetto
regione dell'Umbria n.
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contabilizzato nel conto suddetto sarà oggetto di rilevazione di
ragione dei costi sostenuti per l'espletamento delle attività
di che trattasi, in applicazione del principio contabile della
7 "Ratei e Risconti" - punto 7.1. della casisitica:
DATO ATIO di prevedere di utilizzare le risorse, pari ad €uro 152.200,00 secondo il
piano economico della ricerca, così ripartito:
€uro 75.000,00 per il personale non dipendente;
€uro 8.000,00 per le missioni;
€uro 48.000,00 per il materiale di consumo;
€uro 7.400,00 per Pubblicazioni e convegni;
€uro 13.800,00 (spese generali);
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OGGETIO: Ricerca finalizzata anno 2010 - RF-2010-2311608 "An integrated ana/~lJ~:~~'~;/
in vivo and in vitro applOach to characterize polyblOminated diphenyl ethers (PDBEs) in Italian
musse/s: abasie for a Toxic Equivalenl Faclors (TEF) proposal." Principal investigator
Roberta Galarini - codice RF0012010 - CUP D91J2000670001;
IL DIRETIORE
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DATO ATTO che il costo fissato per le unità operative:
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Università degli Studi di Teramo - Dipartimento di Scienze degli Alimenti è dt~,'
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Istituto Superiore di Sanità - Dipartimento Santà Pubblica Veterinaria e Sicurezza
Alimentare - Reparto di Tossicologia Alimentare e Veterinaria è di €, 53,000,00 al
conto economico 52211369 "Quote per partner ricerche e progetti speciali"
il parere favorevole del Direttore Sanitario per la parte di competenza ai
sensi e per gli effetti dell'art, 12, comma 2, lettera a), delle ~gg~ion:li
~,5/97 e
n,20197 e s,Lm, ed ai sensi dell'art, 10 dello Statuto dell'Ente;/" ~
I
ACQUISITO
il parere favorevole e di legittimità del Direttore Amministrativo per la
parte di competenza ai sensi e per gli effetti dell'art, 12, comm
lettera a), delle
leggi regionali n,5197 e n.20197 e s,Lm. ed ai sensi dell' rt.
I S atuto dell'Ente;
ACQUISITO
I
I
_
Tutto ciò premesso
DELIBERA
1. di dar corso al progetto di Ricerca Finalizzata anno 2010 - RF-2010-2311608 "An
integrated analytical, in vivo and in vitro approach to charac!erize polybrominated
diphenyl ethers (PDBEs) in Italian mussels: a basic for a Toxic Equivalent Fac!ors
(TEF) proposal." Principal investigator Roberta Galarini - codice RF0012010 CUP D91J2000670001, che avrà scadenza 30 novembre 2015;
2. di stabilire che ai fini dell'aggregazione dei costi per la rendicontazioni viene
assegnato al progetto il codice aziendale RF0012010 e che lo stesso dovrà
essere utilizzato per lo scarico di tutti i costi imputabili alla ricerca, ivi compresi i
costi relativi al personale. A tal fine si stabilisce di trasmettere la presente
delibera, oltre che alla Dr.ssa Roberta Galarini, ai fini della corretta imputazione
dei costi ai seguenti settori: UOAP, UTEPQ, UTG, UOGEF, UB, UOGBSL, UAB,
UASE per gli adempimenti di competenza finalizzati all'imputazione dei costi al
progetto stesso - gli atti amministrativi inerenti la ricerca dovranno essere
trasmessi all'UO GRPS;
3. di incaricare il Principal investigator dell'UO Dr.ssa Roberta Galarini per tutto ciò
che attiene la gestione del Progetto e la corretta imputazione dei costi;
4. di precisare che il ricavo di competenza per l'Istituto, fissato in €. 239.200,00 (fuori
dal campo di applicazione dell'IVA), è rilevato al conto economico n, 41121503;
5,
che il ricavo contabilizzato nel conto suddetto sarà oggetto di rilevazione di
risconto contabile in ragione dei costi sostenuti per l'espletamento delle attività
previste nel progetto di che trattasi, in applicazione del principio contabile della
regione dell'Umbria n. 7 "Ratei e Risconti" - punto 7,1, della casisitica;
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7.
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di prevedere di utilizzare le risorse, pari ad €uro 152.200,00 secondo il piano .
economico della ricerca, cosi ripartito:
€uro 75.000,00 per il personale non dipendente;
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€uro 8.000,00 per le missioni;
€uro 48.000,00 per il materiale di consumo;
€uro 7.400,00 per Pubblicazioni e convegni;
€uro 13.800,00 (spese generali);
di prevedere il costo per le unità operative:
Università degli Studi di Teramo - Dipartimento di Scienze degli Alimenti è di €.
34.000,00 al conto economico 52211369 "Quote per partner ricerche e progetti
speciali"
• Istituto Superiore di Sanità - Dipartimento Santà Pubblica Veterinaria e Sicurezza
Alimentare - Reparto di Tossicologia Alimentare e Veterinaria è di €. 53.000,00 al
conto economico 52211369 "Quote per partner ricerche e progetti speciali"
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partner ricerche e progetti speciali";
e che gli stessi sono rilevati sulla competenza economica dei rispettivi esercizi in
relazione alla durata temporale del progetto medesimo.
GF
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DIPARTIMENTO
DELLA SANIT A' PUBBLICA E DELL'INNOVAZIONE
DIREZIONE GENERALE DELLA RICERCA SANlTARJA E BIOMEDICA E DELLA VIGILANZA SUGLJ ENTI
Convenzione tra il Ministero della Salute e Istituto Zoo pro filattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche per
laregolamentazione dello svolgimento dei programmi della Ricerca Sanitaria relativi all'anno 2010, afferenti l'Area
Biomedica Ricerca Finalizzata (ORDINARIO)
Convenzione
n.2931RF -2010-2311608
Premesso che
a seguito di quanto disposto dall'art. 12 e dall'art. 12 bis del D. Lgs. 30 dicembre 1992 n.502, come modificato e
integrato dal D. Lgs. 229/99, concernenti il finanziamento a carico del Ministero della Salute dei progetti di ricerca
presentati dai Destinatari Istituzionali, individuati dalla normativa stessa, si rende necessario, ai fini dello
svolgimento dei programmi di ricerca finalizzata per l'anno 2010, approvati dalla Commissione Nazionale per la
Ricerca Sanitaria nella seduta del 17 maggio 2012, disciplinare i conseguenti rapporti di collaborazione e finanziari;
il Ministro della Salute di concerto con il Ministro dell'Istruzione dell'Università e della Ricerca, su proposta della
Commissione Nazionale per la Ricerca Sanitaria e sentita la Conferenza Stato Regioni, nell'ambito del Programma
per la Ricerca Sanitaria, ha emanato in data 23 settembre 2011 il Bando della Ricerca Finalizzata 2010;
con il Decreto Direttoriale del 27 settembre 2011, registrato dall'Ufficio Centrale di Bilancio presso questo
Ministero - decreto n. 5292 del 03 ottobre 2011- è stata impegnata la somma complessiva di € ~85.627.000,00=
(ottantacinquemilioniseicentoventisettemilalOO)
sul capitolo n.3398 p.g.1 "Spese per la ricerca finalizzata in
attuazione degli obiettivi prioritari, biomedici e sanitari del Piano Sanitario Nazionale" per la ricerca finalizzata
2010;
con Decreto Direttoriale del 13 giugno 2012, registrato dalla Corte dei Conti il 7 settembre 2012 al Reg. 12 - foglio
384, sono stati ripartiti i fondi assegnati ai progetti di ricerca finalizzata 20 lO, per complessivi ~83.127.000,00=
(ottantatremilionicentoventisettemilalOO), così come approvati dalla Commissione Nazionale per la Ricerca Sanitaria
nella seduta del 17 maggio 2012, tra cui è previsto lo svolgimento del Progetto RF-20IO-2311608 "An integrated
anaIytical, in vivo and in vitro approach to characterize poIybrominated diphenyI etbers (PBDEs) in italian
musseIs: a basis for a Toxic Equivalent Factors (TEF) proposal." presentato dal Destinatario Istituzionale
Istituto Zooprofilattico Sperimentale deIl'Umbria e delle Marche. Per il predetto progetto è stato autorizzato un
finanziamento da parte del Ministero della Salute pari a €239.200,OO (duecentotrentanovemiladuecento/OO);
IL MINISTERO
DELLA SALUTE
rappresentato dalla Dr.ssa M. Novella Luciani - Direttore dell'Ufficio IV della Direzione Generale della Ricerca
Sanitaria e Biomedica e della Vigilanza sugli Enti
Istituto Zooprofilattico
Sperimentale
dell'Umbria
e delle Marche
(nel prosieguo denominato Destinatario Istituzionale)
Rappresentato da
~{ç.\ ~\-WA)\.Jq ~V6l?lN-L
.
stipulano e convengono quanto segue:
Articolo .J
La presente convenzione regola l'affidamento da parte del M inistero della Salute - Direzione Generale della
Ricerca Sanitaria e Biomedica e della Vigilanza sugli Enti - al Destinatario. Istituzionale del Progetto di ricerca
finalizzata dal titolo "An integrated analytical. in vivo and in vitro approach lO characterize po/ybromina/ed
diphenyl e/hers (PBDEs) in i/alian musse/s: a basis for a Toxic Equivalent Factors (TEF) proposal." che viene
finanziato dal Ministero della Salute per un importo di €239.200,00 (duecentotrentanovemiladuecenlo/OO) con
imputazione all'u.p.b. 3.1.2.10. ricerca scientifica capitolo 3398 P.G.l.
1
Articolo 2
Il Destinatario Istituzionale ed il Principal Investigator svolgeranno il progetto secondo guanto riportato nel
piano esecutivo presentato e approvato da guesto Ministero ed in ottemperanza a guanto previsto dal Bando per la
ricerca sanitaria 20] O di cui in premessa.
Sono allegati alla presente convenzione e ne costituiscono parte integrante: il predetto piano esecutivo, le
dichiarazioni indicanti le Unità Operative coinvolte nel progetto, la dichiarazione del Destinatario Istituzionale in cui
si precisa che il Responsabile Scientifico svolgerà in via esclusiva la propria attività presso la struttura del SSN
individuata
dal Destinatario
Istituzionale
medesimo,
il cronoprogramma,
unitamente
aHe schede
finanziarie
rimodulate.
Articolo 3
La ricerca avrà la durata di tre (3) anni e dovrà avere inizio entro trenta (30) giorni dalla ricezione da parte
del Destinatario Istituzionale della nota con la guale il Ministero della Salute - Direzione Generale della Ricerca
Sanitaria e Biomedica e della Vigilanza sugli Enti - comunicherà l'avvenuta approvazione e registrazione della
presente convenzione.
Il Destinatario Istituzionale dovrà comunicare la data d'inizio della ricerca, con nota sottoscritta dal
Coordinatore Scientifico e dal Legale rappresentante del Destinatario Istituzionale medesimo.
Gli adempimenti previsti ai commi l e 2 del presente articolo costituiscono presupposti indispensabili per
avviare la procedura di cui al successivo
art. 4.
Il monitoraggio e la verifica del raggiungimento degli obiettivi del progetto di ricerca di cui alla presente
convenzione sono affidati alla Direzione Generale della Ricerca Sanitaria e Biomedica e della Vigilanza sugli Enti.
Le parti convengono che, nel caso il Destinatario Istituzionale sia accreditato ad operare sulla rete del
Workflow della Ricerca, le comunicazioni, relative a tale convenzione, saranno effettuate unicamente attraverso il
sistema di monitoraggio delle ricerche presente su tale rete.
Articolo 4
La prima rata sarà pari al 40% del finanziamento totale di cui all'art. I della presente convenzione.
La procedura per il pagamento della stessa sarà avviata successivamente alla comunicazione da parte del
Destinatario Istituzionale della data di inizio attività della ricerca, di cui al comma 2 dell'art.3, con contestuale
richiesta del pagamento.
La successiva rata pari al 30% sarà erogata dopo la presentazione ed approvazione della relazione, di cui al
successivo art. 5, ed il rimanente 30% dopo l'approvazione della conclusione del progetto, secondo le modalità
stabilite dal successivo art. 7 della presente convenzione.
Articolo 5
Il Destinatario Istituzionale dovrà trasmettere, anche per guanto previsto dall'articolo 4, al Ministero della
Salute, Direzione Generale della Ricerca Sanitaria e Biomedica e della Vigilanza sugli Enti, allo scadere dei 18 mesi
dall'inizio della ricerca e comunque non oltre i sessanta (60) giorni da tale termine, una relazione sullo stato
d'attuazione complessivo della ricerca, sottoscritta dal Responsabile Scientifico e dal Legale Rappresentante.
La predetta relazione, oltre a contenere la descrizione dell'attività svolta dalle singole Unità Operative, dovrà
anche essere preceduta da una sintesi, a cura del responsabile scientifico del progetto, che descriva nella globalità lo
stato di avanzamento dei lavori di ricerca.
Nel caso il Destinatario Istituzionale non adempia a guanto previsto dai precedenti commi, la Direzione
Generale della Ricerca Sanitaria e Biomedica e della Vigilanza sugli Enti ha facoltà, previa comunicazione
preventiva, di attivare le procedure per la sospensione del finanziamento ed il recupero delle somme erogate
comprensive
degli eventuali interessi legali maturati.
Nel caso in cui la relazione non sia considerata dalla Direzione Generale della Ricerca Sanitaria e Biomedica
e della Vigilanza sugli Enti idonea a dimostrare lo stato di avanzamento della ricerca, secondo guanto previsto nel
piano esecutivo approvato, l'Ufficio preposto provvederà a richiedere chiarimenti ed integrazioni al Destinatario
Istituzionale che dovrà fornire risposta entro i successivi 30 giorni.
Nel caso i chiarimenti pervenuti non consentano all'Ufficio
stesso trasmetterà la documentazione ana Commissione Nazionale
di esprimere un motivato parere favorevole
per la Ricerca Sanitaria per le valutazioni
lo
di
competenza, dandone comunicazione al Destinatario Istituzionale. E' facoltà del Destinatario Istituzionale presentare
le proprie controdeduzioni prima del1a seduta di valutazione della CNRS. Il Destinatario Istituzionale, s'impegna fin
d'ora ad accettare quanto sarà deciso dalla Commissione
stessa.
Articolo 6
Durante lo svolgimento della ricerca potranno essere richieste modifiche al piano esecutivo. Tali modifiche,
comunque, non dovranno stravolgere l'impianto complessivo del documento originario allegato al presente accordo.
Le proposte di variazioni, corredate dalle motivazioni fomite dal responsabile della ricerca dovranno comprovare
che le modifiche stesse siano richieste per assicurare il raggiungimento
degli obiettivi e che risultino indispensabili
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per tale finalità. Le richieste .in questione dovranno essere sottoposte all'approvazione del Mifistero '~elliJ'iSalute -~~
DIrezIOne Generale della RIcerca Santtana e BIOmedIca e della VIgIlanza sugh EntI - ~on nota:,.fi'rma~a daI:::)
Responsabile Scientifico e dal Legale Rappresentante del Destinatario Istituzionale ed avranI1ò',effetto s"Olc,,"
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reventual.e apPl~ovazione.
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S, precIsa che le eventuah modIfiche apportate non devono in ogni caso comportare uK:a.'!.m.~l1to""del
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finanziamento a carico del ministero.
Articolo 7
A conclusione del progetto di ricerca, per il pagamento del saldo, dovrà essere inoltrata, non oltre sessanta
(60) giorni dalla data del termine della ricerca, al Ministero della Salute - Direzione Generale della Ricerca Sanitaria
e Biomedica e della Vigilanza sugli Enti - una relazione conclusiva che dimostri esaustivamente la coerenza
dell'attività svolta con il programma esecutivo approvato, gli obiettivi raggiunti e i documenti prodotti e le relative
pubblicazioni realizzate, nonché il resoconto economico complessivo delle spese sostenute.
La predetta relazione, oltre a contenere la descrizione dell'attività svolta dalle singole unità operative, dovrà
anche essere preceduta da una sintesi, a cura del responsabile scientifico del progelto, che descriva nella globalità il
risultato della ricerca.
Sia lo. relazione che il resoconto economico dovranno essere inviati seguendo 1'eventuale modulistica
predisposta dalla Direzione Generale della Ricerca Sanitaria e Biomedica e della Vigilanza sugli Enti tramite il
workf1ow della ricerca, al fine di consentire il monitoraggio da parte della Commissione Nazionale della Ricerca
Sanitaria. L'eventuale documentazione di supporto dovrà rimanere a disposizione della Direzione Generale della
Ricerca Sanitaria e Biomedica e della Vigilanza sugli Enti presso il Destinatario Istituzionale che provvederà alla
relativa custodia.
Nel caso il Destinatario Istituzionale non adempia a quanto previsto dai commi I, 2 e 3 del presente
articolo, la Direzione Generale della Ricerca Sanitaria e Biomedica e della Vigilanza sugli Enti, previa
comunicazione preventiva, attiverà le procedure per lo.sospensione del finanziamento, richiedendo contestualmente
la rendicontazione delle spese sostenute, per le conseguenti valutazioni economiche.
Nel caso in cui la relazione non sia considerata dalla Direzione Generale della Ricerca Sanitaria e Biomedica
e della Vigilanza sugli Enti idonea a dimostrare lo slato di avanzamento della ricerca secondo quanto previsto nel
piano esecutivo approvato, l'Ufficio preposto, provvederà a richiedere chiarimenti ed integrazioni al Destinatario
Istituzionale che dovrà fornire risposta entro i successivi 30 giorni.
Nel caso i chiarimenti pervenuti non consentano all'Ufficio di esprimere un motivato parere favorevole lo
stesso trasmetterà la documentazione alla Commissione Nazionale per la Ricerca Sanitaria per le valutazioni di
competenza, dandone comunicazione al Destinatario Istituzionale. E' facoltà del Destinatario Istituzionale presentare
le proprie controdeduzioni prima della seduta di valutazione della CNRS. Il Destinatario Istituzionale, s'impegna fin
d'ora ad accettare quanto sarà deciso dalla Commissione stessa.
Articolo 8
Il Ministero della Salute - Direzione Generale della Ricerca Sanitaria e Biomedica e della Vigilanza sugli
Enti - in via autonoma o sentita la Commissione Nazionale per la Ricerca Sanitaria, ha facoltà di chiedere
chiarimenti e può disporre verifiche durante lo svolgimento della ricerca.
Articolo 9
Il termine della ricerca potrà essere prorogato dal Ministero della Salute - Direzione Generale della Ricerca
Sanitaria e Biomedica e della Vigilanza sugli Enti -, per un periodo massimo di mesi 12 dalla data di scadenza
iniziale, a seguito di formale, motivata e documentata richiesta del Destinatario Istituzionale inoltrata a firma del
Responsabile Scientifico e del Rappresentante Legale, non oltre i novanta (90) giorni precedenti la data di scadenza
della presente convenzione.
Articolo lO
La presente convenzione, vincolante all'atto della sottoscrizione per il Destinatario Istituzionale, sarà tale per
il Ministero della Salute solo dopo la sua approvazione e registrazione da parte dei competenti organi di controllo.
Articolo Il
La proprietà degli studi, dei prodotti e delle metodologie sviluppati nell'ambito del progetto è regolamentata
dalla normativa vigente in materia, salvo particolari accordi stipulati tra le parti firmatarie del presente atto, ferma
restando la possibilità dei soggetti istituzionali del Servizio Sanitario Nazionale di fruirne, previa richiesta alle parti
firmatarie. Nel caso il contraente intenda trasferire ad altri soggetti qualsiasi diritto, anche parziale, relativo alla
ricerca in questione, ai risultati della stessa o ad eventuali brevetti derivati deve farne esplicita richiesta al Ministero
della Salute - Direzione Generale della Ricerca Sanitaria e Biomedica e della Vigilanza sugli Enti -. Qualsiasi
documento o prodotto, ivi comprese le pubblicazioni
scientifiche,
inerenti al progetto deve contenere l'indicazione
che gli stessi sono stati ottenuti con il finanziamento del Ministero della Salute.
3
Il Ministero della Salute applicherà una decurtazione pari al 5% (cinque per cento) del finanziamento
complessivo, qualora dalle verifiche effettuate risultasse non attuata la precedente disposizione.
Le parti convengono che il Ministero della Salute potrà dare direttamente diffusione pubblica, anche
attraverso il proprio sito web, dei risultati della ricerca sia in forma completa che sintetica e delle pubblicazioni
scientifiche da essa derivate.
Articolo l2
I beni e gli strumenti necessari per l'esecuzione del presente progetto, possono essere posti a carico dei fondi
ministeriali qualora acquisiti a mezzo leasing, noleggio ovvero in comodato d'uso, per un periodo pari alla durata
originale del progetto.
E' fatto divieto di utilizzare i fondi del Ministero della Salute per l'acquisto diretto di apparecchiature e materiale
inventariabile e per il pagamento di quote parte stipendiali a !àvore del personale dipendente.
Per il tempo strettamente necessario all'esecuzione del progetto, sono ammessi unicamente contratti di lavoro
subordinati o parasubordinati.
Ogni diversa regolamentazione al riguardo, deve essere adottala con apposito atto scritto fra le parti firmatarie della
presente convenzione, da recepire con motivato decreto da sottoporre al visto di competenza degli Organi di
Controllo.
Articolo 13
Le parti contraenti prendono atto che il finanziamento del presente progetto ricade nella gestione dei fondi
per il finanziamento delle attività di ricerca o sperimentazione, delle unità previsionali di base 3.1.2.10. "Ricerca
Scientifica" capitolo 3398, di pertinenza del centro di responsabilità "Dipartimento della Sanità pubblica e
dell'Innovazione" - Direzione Generale della Ricerca Sanitaria e Biomedica e della Vigilanza sugli Enti dello stato
di previsione del Ministero della Salute, in relazione a quanto disposto dal D.lgs. 502/92 e successive modifiche ed
integrazioni.
Articolo 14
Le parti si impegnano all' osservanza, per quanto di rispettiva competenza, delle disposizioni inerenti la
tracciabilità dei flussi finanziari c.ontenute nell'art.3 legge 13 agosto 2010 n.136, e successive modifiche ed
integrazioni.
Si richiama particolare attenzione, al disposto del comma 5 ove si fa esplicito riferimento al Codice Unico
di Progetto (CUP), di cui alla legge 16/01/2003 n.3. A tal fine il Destinatario Istituzionale si impegna a comunicare
al Ministero della Salute Direzione Generale della Ricerca Sanitaria e Biomedica e della Vigilanza sugli Enti, il
numero .di Codice Unico di Progetto (CUP) al momento della comunicazione di cui all'articolo 3 comma 2 della
presente convenzione.
Roma, lì
'24 OTT. 2012
PER IL DESTINATARIO ISTIT
IONALE
Istituto Zooprofilattico Sperim fale dell'Umbria e delle
Marche
PER IL MINISTERO DELLA SALUTE
/ Il Direttore dell'Ufficio IV
/ Dr.ssa M. Novella Luciani
Direzione Generale della Rieerta~rSa, m,'taiìa e Biomedie, a c
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RICERCA FINALIZZATA
Ricerca Giovani Ricercatori a~"R.icercaFinalizzata
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diphenyl ether~\(}:ifSPES) in
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Principal investigator:Roberta Galarini
Istitution:lstituto
Zooprofilattico
Sperimentale
deU'Umbria
e delle Marche
A. PRINCIPAL INVESTIGATOR PROFILE
NAME
INSTITUTION ANO POSITION TITLE
Galarini Roberta
Istituto Zooprofitattico Sperimentale dellUmbria e delle
Marche. Head cf Residue Laboratory
EOUCATIONITRAINING
OEGREE
YEAR(s)
University - 80100na
OeQree cum laude
University- Perugia
Specia lisation
1989
2000
FIELO OF STUOY
Industriai Chemistrv
Chemistry and food
technoloQies
A.A Personal Statement
Coordinalion cf the project. PBDEs analytical methods set-up and validation.
A.B Position
and Honors
A.B.1 POSITONS
INSTITUTION
A.S.2 Awards
.
DIVISION
LOCATION
POSITION
FROM
YEAR
TOYEAR
University
Istituto di Scienze
Chimiche
Urbino
Nuclear Magnetic
Resonance specialist
1990
1993
University
Istiluto di Scienze
Chimiche
Urbino
Nuclear Magnetic
Resonance soecialist
1993
1994
1994
2000
2005
2000
2005
2011
IZS Umbria e Marche
Chemistrv laboratorv
Perugia
Chemist assistant
IZS Umbria e Marche
Chemistrv Laboratorv
Perugia
Head Chemist
IZS Umbria e Marche
Residue laboratory
Perugia
Head Chemist
and Honors
A.B.2.1 Official
H index
13
A.B.2.2 Awards
and Honors
A.B.2.3 Other CV Infonnations
Experieneed in analytical chemistry applied to the food safety, speeifically in development and validation of laboratory procedures for residues
determination by GC, HPlC, AAS, GC-MS, lC-MS/MS.
Good knowledge of the institutional and legai framework of the nalional residues plans, in terms of laboratory activities and interaction with
institutions (Ministry of Health, National Institute of Health, veterinary inspectors) involved in food safety
Skilled in intemational accreditation
control of ana/ytical dala.
process following ISOIIEC 17025 requiremenls
and in statistical methocls applied lo validation and quality
On-going education was achieved participaling to several national and intemational conferences and training courses, mostly in chemical residues
control in food and feed.
Author or co-author of more than 100 scientific publications (intemational
chemistry applied lo food safety.
and national joumals or conferences proceedings), mostly in analylical
Short Time Expert in a personnel training lwinning project in POland (2006, National Reference laboratory
in the frame of Commission Decision 2002l657/EC.
Chairman in two Working Groups of the Istituii Zooprofilattici Sperimentali
laboratory validation of confirmatory methods for the determination
(2010); 2) Guidelines for single-Iaboratory
of Pulawy) on Ihe validation procedures
Network for the issuing of specific guidelines: 1) Guidefines for single-
of non authorised substances according to Commission Decision 2002/657/EC
va/idation of immunochemical
screening methods according to Commission Deeision 2002/657/EC
(2004).
Lecturer in several training courses of the national health system and of the universities dealing manly with veterinary drugs and environmental
contaminants residues in foOO and feed.
Principal Invesligator in six Nalional granted research projecls (Ricerche Correnti) and partner in several National granted research projects
(Ricerche Correnti and Finalizzale).
Supervisor of about 10 degree Ihesis in Chemistry and Pharmaceutical
Selected peer.reviewed
publications(in
A.C.1 max 5 best publications
chronological
with bibliographic
Technology, Biology and Veterinary Sciences_
order). Do not include
data,IF,N of Citations
manuscripts
unti I date ofthe
submitted
Propasal
or in preparation.
Project
NAME
IF
NA o citation
Scortichini G_. Annunziata L., Di Girolamo V., Buratti R., Galarini R.
Vafidation of ao enzyme-linked immunosorbent assay screening for
quinolones in egg, poultry muscle and feed samples Analytica
Chimica Acta, 637, 273-278. 2009
3.757
10
....
'j
::~>
>: "('/
...... . .' .. _.--#-"
Project Code:RF-2010-2311608
\
..zi)
2010 - Projef~Comp!,et~~,
Stato definItIvo
Project Title:An integrated analytical, in vivo and in vitro approach to characterize polybrominated
"
Galarini R., Fioroni L., Angelucci F., Tovo G.R., Crislofani E.,
Simultaneous delermination of eteven quinolones In animaI feed by
liquid chromatography with f1uorescence and ultraviolet absorbance
detection Journal of Chromatography A, 1216, 8158-8164, 2009
4101
10
Caprioli G., Cristalli G., Galarini R., Giacobbe D., Ricciulelli M., Vittori
- S., Zuo Y., Sagralini G., Compari50n of two different isolalion
melhods of benzimidazoles and their melabolites in the bovine liver
by solid-phase extraclion and liquid chromalography-diode arrray
detection Joumal of Chromaloaraohv A, 1217,1779-1785,2010
4.194
2
Galarini R., Fioroni L.. Moretti S., Pettinacci L., Dusi G, Developmenl
and validalion of a multi-residue liquid chromatography-landem
mass
spectrometry confirmatory method for eleven coccidioslats in eggs
Analvtica Chimica Acta, 700. 167-176, 2011
4.31
O
Galarini R., Buratti R Fioroni L.. Contiero L. Lega F. Development,
validation and data quality assurance of screening melhods: A case
studv Analv1ica Chimica Acta, 700. 2-10, 2011
431
O
A.C.2 max 5 best publications
Project
of the same topic of the project proposal
with bibliohraphic
unti I date of the proposal
NAME
IF
NA o citation
Elia A. C., Galarini R, Taticchi M. I., Dorr A. J. M., Mantilacci L.
Antioxidanl Responses and Bioaccumulalion in Ictalurus melas under
Mercury Exposure Ecotoxicology and Environmental Safety, 55, 162167,2003
0.983
62
Elia A. C., Galarini R, Dorr A.J.M., Carnevali O., Fioroni L, Taticchi
M. I. Polychlorinated biphenyls and antioxidant enzymes in liver of
Cyprinus carpio from lake Trasimeno Italia n Joumal of Zoology, 72,
1.7,2005
0643
4
Elia A. C., Galarini R, Dorr A.J.M. Taticchi M.I. Bioaccumulation of
Heavy Metals, Organochlorine Pesticides, and Detoxication
Biochemicallndexes
in Tissues of Iclalurus melas of lake Trasimeno
Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 76, 132139,2006
0.505
7
Elia A.C., Galarini R, Dorr A.J.M., Taticchi M.L Heavy metal
contamination and antioxidant response of a freshwater bryozoan
(lophopus crystallinus Pali., Phylacto{aemata) Ecotoxicology and
Environmenlal SafetV: 66,188-194,2007
2.014
7
Elia A.C., Dorr A.J.M .• Galanni R Companson of organochlorine
pesticides, PCBs, and heavy metal contamination and of detoxifying
response in lissues of Ameiurus melas trom Corbara, Alviano, and
Trasimeno la;(~~, Italy, Bulletin of Environmenlal Contamination and
Toxicoloav, 78 6 , 463-8,2007
0.56
2
A.C.3 max 5 most recent publications
with bibliohraphic
data,IF,N of citations
unti! date of the Proposal
NAME
IF
Projeet
NÀ o citation
Gamba V., Terzano C., Fioroni L., Morelli S., Dusi G., Galanni R.
3.757
Oevelopment and validalion of a confirmalory method for lhe
determination of sulphonamides in milk by liquid chromatography with
diode arrav detection Analytica Chimica Acta, 637, 18-23, 2009
8
Galarini R., Fioroni L., Angelucci F., Tovo GR .. Cristofani E.,
Simultaneous determination of eleven quinolones In animai feed by
liquid chromatography with f1uorescence and ultraviolet absorbance
detection Joumal of ChromatOClraphv A, 1216, 8158-8164, 2009
4.101
10
Caprioli G., Cristalli G., Galanni R, Giacobbe D., Ricciulelli M., Villori
S., Zuo Y., Sagratini G., Comparison oftwo different isolalion
methods of benzimidazoles and their metabolites in the bovine liver
by solid~phase extraction and liquid chromatography-diode arrray
delection Journal of Chromatoaraphy A, 1217, 1779-1785, 2010
4.194
2
Galanni R., Fioroni L., Moretti S., Pettinacci L.. Dusi G. Development
and validation cf a.multi-residue liquid chromatography-tandem mass
spectrometry confirmatory method far eleven coccidiostats in eggs
Analvtica Chimica Acta, 700, 167-176, 2011
4.31
O
Galarini R, Buratti R Fioroni L., Contiero l. lega F. Development,
validation and data quality assurance of screening methods: A case
studv Analvtica Chimica Acta, 700, 2-10, 2011
4.31
O
B BIOGRAPHICAL
B.A Personal
data,IF,N of citations
SKETCH CONTRIBUTORS
NAME
INSTITUTION AND POSITION TlTLE
Arianna Piersanti
Istituto Zooprofilattico
Senior Chemist
Sperimentale Umbria e Marche
statement
Analytical methods set-up and validation. Mussels harvesting campaign and PBDEs analysis.
B.B Positions
and Honors
B.S,1 POSITIONS
INSTITUTION
DIVISION
IZS Umbria e Marche
IZS Umbria e Marche
LOCATION
POSITION
Chemistrv laboratò"rv
Peruaia
Contract Chemist
1999
2000
Chemistrv laboratorv
Ancona
Chemist
2000
2005
FROM
YEAR
TOYEAR
IZS Umbria e Marche
Organic contaminants
unii in the Centro di
Referenza per il
controllo chimico e
microbiologico dei
molluschi bivalvi
Ancona
Head of the Organic
contaminants Unii
2005
,
2011
I.
.-
B.B.2 AWAROS ANO HONORS
.;
.:"'0
B.8.2.1 Official H Index
5
B.B.2.2 Awards and Honors
1997 Degree in Chemistry al the Universily of Bologna
1997 Master af Philosophy (Science) al the University cf Birmingham
1997 Qualification
as chemisl for the entry to the chemisls list, University cf Bologna
1997 Assignment
of a PhD position al the University of Venezia associated with the University of Ferrara.
2002 Specialization
in Chemistry and Food Technologies
allhe University of Perugia
Other CV informatioo
1995-1996 Research in organic synthesis applied lo supramolecular
Chemistry of the University of Birmingham.
1996-1997 Research in photochemistry
and electrochemistry
chemistry under the supervision of Prof J.F. Sioddart at the School of
in the group of Prof Vincenzo Balzani at the University of Bologna
1997-1999 The PhD grant was funded by the European Vinyl Corporation (EVC) Porto Marghera, Venezia and the activity was in controtling the
levels of Persistent Organic Poltutants (PCDD/F, PCS, IPA) in industriai emissions.
Since the end of 1997 the activities focused on analyticai chemistry, applied to environment and food, and dealing, particularly, with organic
contaminants.
Experienced in analytical melhods development and validation using PLE, SPE, SPME, GPC sample preparation techniques and GC with selective
detectors, GC-MS, HPLC-DAD for the instrumental analysis.
On-going education was achieved atlending numerous training courses in the field of analytical chemistry and foOO safety and national and
interna'tional conferences.
Author or co-author of several scientific publications (intemational
applied to food safety.
or national journals and conferences proceedings),
mostly 00 analytical chemistry
Lecturer in several training courses of the nationai health system and of the universily dealing manly with persistent organic contaminants,
pesticides, food additives and biogenic amines.
Partner in National granted research projects (Ricerche Correnti) and Principai Investigator in 2001 (Ricerca Corrente).
B BIOGRAPHICAL
B.A Personal
SKETCH CONTRIBUTORS
NAME
INSTITUTION
Monia Perugini
Università degli Studi di Teramo, Facoltà Medicina
Veterinaria. Confirmed researcher
ANO POSITION TITlE
statement
In vivo paDE toxicological
B. B Positions
studies using zebrafish as mode!.
and Honors
B.B.1 POSITIONS
INSTITUTION
OIVISION
LOCATION
POSITION
FROM
YEAR
TOYEAR
Università degli Studi
di Teramo
Veterinary
Pha~~~~gy
and
Toxicol
Unit
Teramo
PhO
2001
2004
Università degli Studi
di Teramo
Veterinary
Pharmacology and
Toxicoloav Unit
Teramo
researcher
2005
2011
B.B.2 AWAROS ANO HONORS
B.B.2.1 Offidal
H Index
6
B.B.2.2 Awards
and Honors
2000 Degree cum laude in Veterinary Medicine at the University of Teramo
2004 PhO in Veterinary Pharmacology and Toxicology at the University or Napoli
2005 Researcher in Veterinary Pharmacology
and Toxicology, University of Teramo
2008 Confinned researcher in Veterinary Pharmacology
and Toxicology, University of Teramo
Other CV information
1998-2000 Research in foOOmicrobiology in the group of Prof A. lanieri, at the University of Teramo.
2003 PhO stage in ecolossicology
IFREMER, Arcachon (France).
and bioassays lechniques, under the supervision of Dr. E. His, laboratory of "Environnement
2004-2011 Teaching in: Residual Toxicology of AnimaI Food Products - Risk Assessment; Veterinary Pharmacoiogy:
Pharmaceutics at the University of Teramo.
2005-2011 Reviewer for international joumals: Environment Internalional, Environmental
Ressources"
Velerinary Pharmacology
Poltution, Meat Science, Estuarine, Coastal and Shelf
and
\
Science, Fresenius Environmental
Environmental
Environmental
BulJetin, Joumal of Agricultural, Food Chemistry, Chemosphere,
Biological Traee EJement Researeh,
Seience and Pol1ution Research, Food and Chemical Toxicology, Journal of Food Nutrition and Research, Polish Journal of
Studies.
Since the end of 2000 the research activity was focused on toxicology, ecotossicology
foOO and environment.
and analytical chemistry particularly organic contaminants in
Author or co-author of 57 scientific publications of whìch 1B in inlernational scientific journals and 30 in proceedings of inlernational
congresses.
or national
Author of 7 chapters of international books and of 1 chapter of an Italia n veterinary medicine book.
Experienced in analytical ehemistry: method development and validation using PLE and SPE sample preparation teehniques and GC-MS and
HPLC for the instrumental analysis.
Experienced in ecotossicology:
and sea urchin larvae.
Experienced
in pharmacology:
environmental
bioassays techniques and appticalion. Toxieity studies of persistent organic compounds
using oyster
in vitro evaluatlon of compounds altering the funetion of smooth musele in the bronchial tissue of horses with chronic
obstructive pulmonary disease. In vitro evaluation of the contractile response of intestinal strips of rainbow lrout to serotonin and histamine and the
effect of eosinophil degranulation.
On-going education was achieved participating to numerous workshops and seminars in the field of food toxicology and foOO safety and to national
and international conferences.
Partner in Programmi di ricerca di Rilevante Interesse Nazionale (PRJN) in 2002.
B BIOGRAPHICAL
8.A Personal
SKETCH CONTRIBUTORS
NAME
INSTITUTION ANO POSITION TITLE
Sabrina T ait
Istituto Su eriore di Sanità - Conctract researcher
statement
In vitro PBDEs toxicological
8.B Positions
B.B.l
studies on human celi tines
and Honors
POSITIONS
INSTITUTION
OIVISION
LOCATION
POSITION
FROM
YEAR
TOYEAR
Istituto Superiore di
Sanità
Enterovirus Unit
Roma
Contract Researcher
2001
2005
Istituto Superiore di
Sanità
Food and Toxicology
Unit
Roma
Contract Researcher
2005
201~
B.B.2 AWAROS ANO HONORS
8.8,2.1 Official H Index
3
8.8.2.2 Awards
and Honors
2000 Degree in Chemistry at La Sapienza University of Rome
2000 Qualifìcation as chemist for the entry to the chemists lisi, La Sapienza University of Rome
2005 Second level Master cum laude in Bioinformatics al La Sapienza University of Rome
Other CV information
2001-2005 Research in natural and synthetic antivirals modes of aclion against enteroviruses under the supervision of Doci- Lucia Fiore al lhe
Enterovirus Unit of the Istituto Superiore di Sanità.
2005-2011 Research in endocrine disruptors effects and modes of action in the Food and Toxicology Unit (headed by Prof. Alberto Mantovani) of
the Istituto Superiore di Sanità
Since the end of 2005 the research activity was mainly focused 00 the study of endocrine effects 00 reproduction and development,
especiaJly on
target organs like brain, placenta and male extemal genitalia following exposure, respectivety, lo the pesticide chlorpyrifos, the plastic addictive
Bisphenol A and differenl mixtures of Polychlorinated Biphenyls.
Since 2008 involved in the PREVIENI Project founded by the Ministry of Environment, whose aim is to perform a biomonitoring
study in 4 different
areas by analysing some endocrine disrupting leveJs in serum of couples affected by infertility, their clinical profite and some biomarkers of earty
exposure in leucocytes at gene expression level.
Experienced in celi and molecular biology techniques such as Gel electrophoresis,
PCR, DNA Sequencing, RNA transfection, recombinant DNA, Microarray.
Western Blot, ELISA, Immunocytochemistry,
PCR and Real-time
On-going education was achieved participating to numerous workshops and seminars in the field of food toxicology and food safety and to national
and intemational conferences.
Author or co-aulhor of several publications (international or nalional joumals and conferences proceedings) on antivirus research (2001-2005),
reproductive/developmental
toxicology and foOOsafety (2005.2011).
Involved in several Ministry of Health (Ricerche Finalizzate), an ISS-NIH, and several European granted research projects within the 7th Framework
programme.
C Rationale,AIMS
ANO IMPACT
C1 BackGround
Polybrominated diphenyl ethers (P8DEs) are a class of emerging substances used worldwide as f1ame relardants in electronic appliances, textiles,
furnishings and various other consumer products. There are theoretically 209 PBDE congeners, although the commerciai products predominantly
consist of: penla-BDEs (PeBDE), used in epoxy or phenol resins, polyeslers, polyurethane foam and textiles; octa-BDEs (OcBDE), employed in
/<>. '~;~;!G;':~'
...
:)~..,\
/, .~<
,".
acrylonitrile butadiene styrene, polycarbonate and thennoset; deca-BDEs (DeBDE) used in most !ypes of synthetics material~_'i'~~luding\exti!'esand
polyester far printed circuit boards [1J.
\ ;;""
Since PBDEs are added lo the products rather than be chemicalJy bound lo them, they can be slowly and continuously
releaskdduring their
\'
.
'
manufacturing, while in use, or after their disposal. The disposal of plastics is probably the mai n source of PBOEs in the environment and, as a
resull of their ehemical stability, they are globally Iransported and distributed. PBDEs are persistent and have very low water
'-'r.
solubìlity,;h.igh,binding.
affinity lo particles and tendency to accumulate in sediments. The presence of PBDEs in biota is likely to be a result of their lipophilìciìya~d'"''''::'~'~'
resistance to degradation {1, 2].
Furthermore, it has been demonstrated that congeners with less than seven bromine atoms are more bioaccumulative
exhibiting large biomagnification faclors through the food chain.
than lhe heavier PBDEs,
Generally, PBDEs seem to cause toxic effects al low doses. The most sensitive end poi n! of PBDEs toxicity in vivo is related to thyroid function,
wilh induction of thyroid hyperplasia and alteration of thyroid hormones production in rats and mice [3, 4). Moreover, PBDEs share with co-planar
polychlorinated
biphenyls (PCBs) and dioxins the Aryl Hydrocarbon Receptor (AhR)-mediated
enzymes, such as 1A1, 1A2 and 3A1 [5,6]. Several pure di. to hepta-brominated
agonists or anlagonists
in a congener-specific
induction of some hepatic cytochrome P450
PBDEs congeners are able to interact with AhR in vitro as
manner. Relalively recenl reports indicate that exposure lo low concentrations
of these chemicals
may result in irreparable damage lo the nervous and reproductive systems. Earty-life exposures lo PBDEs at relatively low levels can also lead lo
delays in sensory-motor
devetopmenl,
of vertebra le developmental
hearing deficits, as well as changes in activity levels and fear responses f7J. An ideai organism for the study
biology is zebrafish, (Danio rerio) which has favorable characleristics
'Invesligale endocrine disruption and neurobehavioral
effecls exerted by environmental
Sioce liver is a main targel organ of PBDEs action, ao elective modello
represented by human liver celliines.
the use of human colon celllines
and il is considered a goOO in vivo frsh model to
contaminants.
study in vitro toxicity of these compounds, especially at molecular level. is
Moreover, due to the primary importance of the digestive system as food and food contaminants
processar,
may help to elucidate further PBDEs mechanism not yet investigated.
So far, no Toxicily Equivalency Faetors (TEFs) have been defined for PBDEs congeners.1t
is, therefore, needed to explore comprehensive
toxicological parameters to establish TEF values in order to assess P8DEs risks for human heallh.
Among food, fish and shellfish, highly contribule lo P8DEs human intake, especially if characterised
areas [8]. Mussels are a significant vehicle of dietary exposure because lhey can concentrale
filler large volumes of water.
by high fat content and grown in contaminated
chemicals (102-105 times) as a result oftheir ability lo
Several studies were performed in emerging counlries Iike China, India and Korea,. where a massive disposal of electronic equipment is carned
over, as wetl as in northern Europe and USo in order lo analyze PBDEs levels in mussels and sediments. So far, no dala are stili available
conceming
PBDEs contamination of mussels grown on Italia n coasts and specffically in a landlocked sea lìke the Adriatic.
To detect PBDEs in biologicat samples it is needed lo reach sUb-ppb levels, therefore sensilive and specific analytical procedures are required. Gas
chr~matography
coupled to mass spectrometry is the elective analytical lechnique in PBDEs analysis. Recently, in the field of micro-pollutants
analysis, the use of MS/MS has been considered a valuable approach altowing lo minimize malrix interferences
with good precision enabling sufficienl sensitivity and selectivily [9,10].
[1] De Wit, C. 2002. Chemosphere,
and reach very Icw detection limils
46: 583-624.
[2J Alaee, M. 2003. Environment Intemalionat, 29: 683-689.
[3] Fowles, J.R. 1994. Toxicology, 86: 49-61.
[4] Damerud, P.O. 1996. Organohalcgen
Compounds,
[5] Meerts, I.A.T.M. 2001. Environmenlal
Health Perspectives,
29: 316-319.
109: 399-407.
[6] Fery, Y et al. 2009. Toxicotogy, 264: 45-51_
[7] Branchi, I. 2002. Neuro Toxicity, 23: 375-384.
[8] Domingo, J.L. 2004. Journal of Chromatography
[9) Covaci, A. 2003. Environment
Inlemalional,
A, 105: 321-326.
29: 735-156.
[.10JVonderheide, A.P. 2009. Microchemical Journal, 92: 4957.
C2 Aims
The overall objective of lhis inlerdisciplinary
project is to improve Ihe known-how and the risk assessment on brominated f1ame retardants as
PBDEs, for human and wildlife health. The developmenl
as well as the evalualion of their bioaccumulation,
of new lools for detection and monitoring of PBDEs in mussels (Mytilus galloprovincialis)
reproductive,
neurological, hepatic and enteric effecls on in vivo and in vitro models, will be the
principal aim of the project. For this purpose, the project will use ao integrated approach by combining chemical, cellular, molecular and histological
lechniques for which each cf the contributors has recognized experience.
By integrating information on exposure. fate and toxicity af P8DEs, this project aims to provide a highly significant contribution lo integrated risk
assessment of this class of compounds, for humans and aquatic environment safety. Moreover, the integralion of data on a multidisciplinary
will serve to propose a TEF approach for PBDEs toxicity c1assifrcation
basis
C3 Main Expected Resulls and Impact
The overal! objective of the project is to provide comprehensive
information on PBDEs spread in the Italian aquatic environment Ihrough the
investigalion of mussels conlaminatian as well as to fili some gaps on the knowledge of their toxicity_
Specific expected results of this study are to:
- implement validated and high throughput analytical methods for the delermination
of PBDEs at sub-ppb level in mussels, fish and feed;
- define the background concentrations and congeners profile of PBDEs in mussels sampled along the Italian coast and particularly in the Adriatic
Sea;
- enable comparison
with PBDEs international data;
- investigate the PBDEs concentrations at specific potential point source like sewage Ireatment plant outfalls, rivers outlel, induslrialised
areas etc;
-,evaluate possible developmenlal malformations, changes in behavlaur and de.ath incidence foltowing PBDEs exposure during the early-life stages
of zebrafish, when fish are usually mosl sensitive to organic contaminants.
- compare the toxicity of a lower brominated congener (BDE-47) and a higher brominated congener (BDE-209), moreover investigating possibte
1
':',:~
addictive/synergistic
effects exerted by the PBDEs mixture of the 8 EFSA dielary relevanl congeners;
- investigate the effect of freeze-dried
mussels intake as a sum of toxiclprotective
actions;
- study of the zebrafish liver, gonad and lhyroid histology following exposure lo PBDEs;
- identify possible innovative cellular biomarker of exposure and/or effect as rodlet cells and macrophage aggregales
- identify further and stili not documented
(MAs and RCs) in zebrafish;
liver, as weU as colon, human molecular targets and modes of action following exposure to PBDEs of
human hepatic (HepG2) and enteric (DLD-1) celliines Ihrough the exploration of their complete gene expression profile;
- indenlify early biomarkers cf exposure on human liver and colon celllines following both PBDEs and freeze-dried mussels exposure, this one
representing
an in toto malrix, therefore areaI food intake in human diet;
- propose a TEF approach for PBDEs toxicity classification by integrating the overal! data produced by the project.
Thus, the project will provide important results which will serve as a basis for improvement of the quality of life by appropriate
management actions_
D ORIGINALlTY
regulatory and
OF THE PROPOSAL PROJECT
Since the last decade, the occurrence of PBDEs was widely exploiled in several European and Asiatic countries and in USA, in Italy very little has
been done on the topic and therefore only few infonnation have been collected
effects related lo Ihese compouods.
Polybrominated
00
the environmentallevels,
There is a lack of information on P8DEs contamination
dielary exposure and toxicological
levels in Italian food, indeed in the Scientific Opinion on
Diphenyl Ethers (PBDEs) in Food issued by EFSA in the fast August no data were submitted fram Ilaly_ Therefore, there is the need
to improve the knowledge on PBDEs contamination
paltems and levels in arder lo evaluate human and wildlife exposure and lo assess the related
risk which could, at Ihe end, bring to the definition of residue limits to be fulfilled by the European Commissiono
The use of mussels as sentinel organisms for the assessment of!he levels of persistent organic poflutants (POPs) and also of inorganic
contaminanls
in the environmenl
has been frequently used worldwide (Mussel Wateh Projects). However, none of Ihese sludies has been
conducted in Italy sioce now, especially on PBDEs, therefore valuable results are expected to come oul from this survey within the project.
Moreover mussels, olher their use as iodicators enabling the measurement of cootaminants accumulation because of their sessile characteristics,
are mainly a food and therefore Iheir examinatioo may provide important information
00
the possible human exposure to PBDEs as a consequence
of consumption.
Therefore sensitive and specific anatytical procedures are required to measure concenlrations
chromatography
is the elecled separation technique which, coupled with tandem mass spectrometry is bringing to the replacemenl
costly HRGC-HRMS
by the HRGC-MS/MS
al the sub ppb level. Gas
methocls for trace anafysis of micropoflutants in various environmentat
of the more
matrices, since il provides
comparable selectivity and sensitivity. A more accessible and less expensive GC-MS/MS (triple quadrupole) method will be used as valuable
analytical approach for the detennination
(SOP).
of P8DEs in fish, rnussels and feed with !he aim to issue a validated Standardized
The toxicological profile cf many PBDEs is 100 incomplete and insufficient to pericrm an adequate human and-ecological
Operating Procedure
risk assessment.
In this
project the studies 00 zebrafish will be conducted improve the understanding of the toxic effects and poleotial health risks cf P8DEs, in parlicular by
investigating the developmental
malfonnalions
and behavioural changes during the earty-life stages, as well as the histological modifications
in
gonads, liver and thyroid. The analysis following exposure to single PBDEs, namely BDE-47 and BDE-209, and to a PBDEs mixture ofthe B more
relevanl congeners identified by EFSA, will also contribute to better investigate possible addilive/synergistic
effects of Ihese compounds.
PBDEs occur in Ihe environment in complex mixtures, !he identification of biological and toxicological structure-activity
importance for understanding
biological or toxicological
relalionships
As these
is of great
the mixture laxicity cf this group of chemicals. In addilion, there is very liltle information available regarding useful
markers of low-Ievel exposure to PBDEs and, in this context, the use of rodlet cells (RCs) and macrophage
(MAs) may represenl a somehow innovative and interesting approach. Particular attention will be given to Ihe associaticn
aoy signs of paraphysiological
aggregates
of these biomarkers with
or pathological degeneration of liver, tyroid and gonads induced by chronic exposure to PBOEs. In particular,
numeric and/or, morpho-densilometric
paramelers related to MAs, such as mean, mode, minimum and maximum levels of grey, area, perimeter,
circularity and fractal dimensions wifl be correlated lo time of PBDEs exposure. PBDEs mode of action, likewise dioxins and dioxin-like PCBs, has
been mainly related to Iheir interaction with AhR with consequent induction of importanl liver enzymes such as Phase I cytochrome
P450 mainly
belonging lo 1A 1, 1A2 and 3A 1 families. Other mechanisrns at human liver level have been poorly invesligaled whereas effects 00 other organs of
the digestive syslem have noi been coosidered at all, despite the importaoce of this system in foocl and food contaminants
comprehensive
evalualion of possible effects at molecular level
00
humao in vitra cellular models of liver and colon origino These celliines
8-EFSA more rele.vant congeners at environmentally
processing. Therefore, a
Ihese orgaos is advisable and will be periormed within this praject by using
!WO
will be exposed either lo BDE-47 or BDE-209 as well as to a mixture of the
realistic concentrations
as delermined in mussel samples. This aspecl is fundamental
in order
to mimic areai exposure scenario. In addition, both celllines will be exposed also to the freeze-dried mussels lo compare the effects of PBDEs as
purified compounds
and wilhin food using the in tolo matrix, where polential protective factors may exists. The analysis of the gene expression
profiles in these samples wifl highlighl molecular larget stili noi investigated moreover helping to define possible biomarkers of early PBDEs
exposure in two main larget organs.
Results from this study will fili gaps in the knowledge af human exposure to PBDEs and in the fulure may be used in combination
toxicological data to delermine health standards.
with emerging
E Methodology
E1 Study Design
The project will involve the analytical study of the PBDEs in mussels and then, once known the nalural conlamination
and in vitro (human celllines) studies will be periormed.
levels, the in vivo (zebrafish)
The project will be divided into!wo Work Packages (WP), an Analytical WP and a Toxicological WP and seven phases (P).
WP1: Analytical studies
P1 (1-12 months): development
and validalion of GC-MS (MS/MS) analytical melhods for!he analysis of the eight PBDE congeners
EFSA of primary interest (B-EFSA congeners: BDE-28, -47, -99, -100, -153, -154, -183 and -209)_ Elaboralion of the SOPs.
P2 (6-18 months): harvesting of mussels samples from the Adriatic Sea cost and samples preparation.
considered by
/~~:."~;~~~~
i~:ç/\-'c::'.' ' '~'}; .~.',_.:~ ~-~\
P3 (12-18 months): analysis of mussel samples and assessment of lhe contamination levels
P5 (18-32 months): quantificalion
in vivo experimental
of single PBDEs and PBDEs mixlure in feed and in whole zebrafish tissues {treated and<untreated),,foltowing
l~~~<,- .
steps.
\>i".
P7 (32-36 months): Elaboration of resulls and dissemination.
WP2: Toxicological
.J
\-~:'-".
Studies
'-. -'.
u'A'
;
P4 (1B-32 months): toxicological studies using zebrafish as in vivo model. Exposure of zebrafish to dietary relevant levels of sinfilè-BBDÉs
and BDE-209). PBDEs mixture (B-EFSA congeners) and freeze-dried mussels via diet. Evaluation of endocrine and neurobehavioral
histological modificalions
the .: ~
(BDE-47
effects,
and identification of cellular biomarkers.
P6(1B-32 months): toxicological studies using two in vilro models: human hepalocellular
carcinoma (HepG2) and human coloreclal adenocarcinoma
(OLD-1) ceJl/ines. Cells exposure to dietary relevant levels of single PBDEs (BDE-47 and BDE-209), a PBDEs mixture of the 8-EFSA congeners
and freeze-dried
mussels. Evaluation of the effects by gene expression profiling.
P7 (32-36): Elaboration of results and dissemination.
E2 Preliminary Data
We don't have worked yet on PBDEs mussels contamination
consolidated
assessment or in vivo and in vitro PBDEs toxicological studies, however we have
experience on PCBs which share with PBDEs some structural and toxicological characteristic.
In 2003-2004 the IZS Umbria e Marche was involved in a PCBs survey in mussels from the Marche (11]. Eighteen PCB congeners were measured
lo estimate the total PCBs concenlrations
and lhe contamination
pattems. The predominant congener was always the H6CB-153 followed by
H6CB-138. They, together, made up 35-40% of total PCBs in all sampling sites.
The effects of three PCBs mixtu"res, one dioxin-lIke and two non-djoxin like PCBs, were evaluated on a human cellular model far fetal male external
genitalia development
[12). Treated cells were analysed for their gene expression profiles: the three mixtures modulated different patterns of genes
moreover highlighting that the two mixtures of officialty c1assified non-dioxin like PC-Bs actual1y have different modes of aetion. The results suggesl
that the official PCBs classification may be revised taking into account differenl modes of aclion within non-dioxin like PCBs
E3 Bibliographic
Data
Relative scarce are the data available on PBDEs mussels contamination
showed that the three,prevalent
in Mediterranean
Sea. Mussels (Mitylus edulis) from the French coasl
congeners were BDEs 47, 99 and 100 [13]. M. edulis collected in Korea reported a similar pattem with BDE-47, the
dominant congener, followed by -99 and 100 [14]. In M. edulis from Bo Sea (China), the BDE~209 reported the highest concentratlon
[15]. No data
in mussels from Italian coasts were found.
Only few sludies explored PBDEs effects on development, reproduction or neurobehavior
in zebrafish. Data on long+term chronie exposure at
relatively low doses are lacking and the few information available are on the evaluation of toxic effects upon exposure to single PBDE congeners.
HepG2 are largely used in the scientific community to study hepatic toxicological effect. However, regarding PBDEs, only the interactions with the
AhR and the activation of eytochrome P450 enzymes have been investigated in this celliine
[16]. Para ilei mechanisms,
such as oxidative damage
[17] or interaction wilh the Pregnane X receptor [18] have been poor1y studied, whereas other possible modes of action, such interactions with other
nuclear receptors, have not been investigated at ali. No data are available on DLD-1 cells, an in vitro model from the colon. No gene expression
profiling has been perfonned on both celilines following PBDEs treatments especiaJly at environmentally
[11] Piersanli, A. 2006. Organohalogen
relevant concentrations.
Compound. 68:1951-1954.
(12] Tail, S. et al,. 2011. Reproductive Toxicology. 32:1-14.
[13] Johansson,
I. 2006. Chemosphere,
[14] Ramu, K. 2007. Chemosphere,
[15] Zhen Wang. 2009. Chemosphere,
[16] An, J et al. 2011. Environmenlal
(17J Fe<y, Y el al. 2009. Toxìcology,
64: 296305.
148: 562-569.
74: 896901.
Toxicology, 26(6):591-599.
264(1-2):45-51
(18] Lundgren, M. et al, 2009. Toxicol Lett, 184(2):107-113.
E4 Work Melhodology
Analytical determinations
Methods development
Focus will be on the analysis of the mentioned 8-EFSA PBDEs congeners at sub-ppb levels. Samples wil1 be freeze-dried and then the
conlaminants
extracled using Pressurized Liquid Extractor (PLE)_ Clean.up methodologies
Chromatography
like Selid Phase Extraction and Gel Permeation
will be applied. The analytical methods wlll be set up following the performance criteria reported in 1883J2006/EC for dioxin-like
PCBs and dioxins as well as the principles cf green chemistry.
Methods validation
The analytlcal methods will be validated in mussel, fish tissue and feed to estimate lheir main performances characteristics:
and intralaboratory
reproducibility),
precision (repeatability
trueness, limit of detection (LOD), limit of quantification (LOQ), specificity, ruggedness and measurement
uncertainty. The validation pian will involve repealed experiments at different spiking levels in the whole measurement field.
Mussel Sampling
The harvesting will be canied over twenty sampling points c1assified alon9 the Marche coast for the mussel survey in the frame of 853/2004/EC and
854/2004/EC.
Each point will be sampled five times during each sampling campaign and two campaigns will take pIace in a year: once in the pre-
spawning and once in the post+spawning periodo Each sample will be made of specimens of the same dimensions (presumably same age) selected
on the basis of the shell length.
PBDEs analysis
PBDE concentrations
will be measured in the sampled mussels, in commerciai feed, in contaminated feed and in freeze-dried
mussels used as
source of exposure for toxicological trials. Zebrafish tissues will be also analysed before, during and after dietary exposure lo PBDEs. Ali the
analysis will be performed in batehes with the appropriate quality controls.
In vivo toxicological
tests
Animals
PBOEs exposure tests will be done using zebrafish (Oanio rerio), as recommended
Oevelopmenl
by the Organization for Economie Cooperation and
(OECO) guidelines. Wild-!ype adult zebrafish will be initially purchased from a commerciai source and maintained in a laboratory
environment far one month prior to breeding. Embryos and larvae witl be obtained by natural mating in spawning tanks and raised in optimal
conditions.
Experimental design
Tests wHllast 240 days post hatching (dph). From 4 dph to 20 dph larva! fish witl be fed with commerciaI fish powder. The exposure will start from
20 dph and 1 rnonth after the exposition Ihe behavioural text wilt be done. The fish will be euthanized and analysed at fixed urne interval (lO (20dph),
t 30 (50dph), t 70 (90dph), t 220 (240dph)). For Ihe PBOEs treatecl diets BOE 47, BOE 209 and the PBOEs rnixture wilt be added lo a commerciai
formulaled fish food. Far each PBOEs standard Ihree trials will be prepared: one group fed with untreated feed (controJ) a second fed with PBOEs
contaminated
feed (testing group) and a third group fed with feed contaminateci by the solvent used lo prepare the P8DEs solulions (solvent
contrai). The concentrations of P8DEs in food witl be dose to median concentration measured in mussels in WP1. The last zebrafish group wilt be
fed by freeze-dried mussels collected during the sampling campaign.
Histological preparation and gametogenesis
analysis
Fish liver will be sampled for ali fish, according to experimental design, and processed for light microscopy and TEM. Quali-quantitative
analysis of
RCs and MAs witt be performed ali over the treatment period at fixed time interval (tO, t3D, t70, 1220). Moreover, gonads and thyroid will be also
scanned for pathology and assessed for their development.
In vitro loxicological
tests
Celi cultures and lreatments
The human hepatocellular
carcinoma (HepG2) and colorectal adenocarcinoma
recl, with 10% fetal bovine serum, 2mMI-glutamine,
(OLO.1) celliines will be grown in RPMI1640 medium wilhout phenoJ
100Ulml penicillin and 100g/ml streptomycin. Cells witr be maintained at 3rC and 5% C02.
Freeze-dried mussels wi1l be reconstituted, filtered to obtain sterile solutions. Mussels and P8DEs standards will be properly diluted in culture
medium. 80th celliines
will be exposed to BOE-47, BDE-209, 8-P8DEs mixture, reconstituted freeze-dried mussels or medium alone as control.
PBOEs concentrations
used will be as those detected in Italian mussels. Treatments will be performed in triplicate, far 72h in arder to mimic a
chronic exposure. Then, cetls will be trypsinized, collectecl, added of a Iysis buffer preventing RNA degradation and stored at -80 GC.
RNA extraction and microarray analysis
Total RNA will be exlracted from each sample. A gene expression profiling will be performed using Agilent Whole Human Genome microarrays
featuring - 40.000 genes. Experiments will be performed following a dye-swap design. Control and Ireated samples wiU be co-hybridized on
microarray slides and incubated at 65 GCfor 17h in a rotating incubator. Slides will be then read far their fluorescence
in an Agilent scanner. Data
will be analysed by bioinfonnatics tools to detennine the list of differentially expressed genes, as well as the pathways and networks indicating interrelations among groups of modulated genes.
Real-time PCR
Microarray results will be validaled by performing Real-time PCR on a subset of modulated genes. Reactions will be performed on RNA sample
retrotranscribed
to cONA in presence of specific primers. Experiments will be performed in duplicate on a Stratagene MX5005P Ihermocycler
inslrument. ResuJts will be analysed far their significance with the JMP 7.0 statisticaJ software.
ES Possible
Criticai
Aspects
The first crilical poinl could be the harvesting in the winler due to the unfavourable almospheric conditions. In order lo avoid the lacking of single
samples we will collect mussel in a Japse of 20 days. The second criticai poinl could be the mortality of zebrafish during Ihe first phase. For this
raison, we have decided to start the exposure texts from 20 dph, when the larval survivorship is more stable. A criticai issue in in vitra toxicological
experiments may be the filtration and the solubilisation lo a proper dilution, to be used in celi treatments, af freeze-dried
mussels. The same
procedure, as applied to infant fOITTlUlasin the European Network of Excellence CASCAOE (155 as Partner), will be used.
E6 Milestones
Milestone
(M)
M1 (12th month): SOPs for the analysis of PBOE congeners in fish, feed and mussel tissues; beginning cf the harvesting campaign, analysis and
preliminary resuJts.
M2 (18th month): ending of the harvesting campaign; analysis and results; In vivo and in vitro toxicological studies slart; midterm report of the
research project.
M3 (24th month): preliminary results of in vivo and in vitro toxicological studies and on PBOEs.
M4 (32nd month): fina I results of in vivo and in vitro toxicologicaJ studies;
M5 (36nd month): research final report; diffusion of results by pubJication of papers and oral presentation at symposia.
F TOOLS;INSTRUMENTS
ANO COLLABORATION
The Institution which will supervise and coordinale the activities of the project IS the Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche
(IZS-UM), an Italian governmental velerinary agency founded in 1936 and operating in the frame of the National Health System. The IZS-UM fs part
of a network of ten similar institutions operating in other regions of the nalional tenitory. The ffelds of in!erest are manly the animai health and the
food safety invoJving the synergic collaboralion
of differenl competences: veterinary, chemical, biological, biotechnological,
epidemiological
elc. The
IZS-UM among many other structures and laboratories has its self labora!ories operating in the field of analytical chemistry applied to food anatysis
and involved in the control of drugs and anabolic residues, persistent organic pollutants, pesticldes, micotoxins, biotoxins, inorganic conlaminanls
in
feed and food of animai origino The chemistry laboratories have quite advanced technical equipment both in the field of sample preparation and in
the instrumental analytical delermination:
Accelerateci Solvent Estractors (ASE), Gel Permeation Chromatography
(GPC) syslems, Microwave
ovens, automalic syslem far Solid Phase Extraction (SPE) cleanup and automatic dilutors. The analytical instruments available in the IZS-UM
laboralories are: Gaschromatographic
systems (GC) wilh seleetive detectors.like Electroncaplure
Oetectors (ECO), Nitrogen Phosphorus Oetectors
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(NPD). Flame lonization Detectors (FIO), single quadrupole and ionie trap Mass Speetrometers
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(MS); Iiquid ehrOmaIOgrap~;~ystem;-;~'~~~)
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with
Diode Array (DAD) and Fluorescence Detectors and triple Quadrupole MSs. Far the determination of inorganic contaminant~~he IzS-Ùiv1.f[as an
Inducled Ccupled Plasma MS (ICP~MS). The researchers working in the institution are ali well skilled in the topics of activity à~:p~Sides
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Ihe' .:..,-...,.~.I
oile'or
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institutional control of the compliance to lows of the food samples laken in lhe frame of offiGial monitoring programs, the researèh:r:epre;ients
..•..... ~- -, ...••••
the foremosl aims therefore the researchers have a150 experience in managing research projects.
'
. o.'
",
The network of the Italian Isituti ZooprofilaHici Sperimentali grves the opportunity of an effective exchange of experience and expertise among the
ten institutions. Moreover the scientific and experimenta! collaboralion
involves many other organizations,
among which universities, CNR, 155,
research centres and reference laboratories.
In the Ancona department of the IZS-UM has been recognised in 2003, by the Minislry of Health. lhe National Reference Laboratory for the
Biological and Chemical Control of Bivalve Mussels and therefore a lot of work is done on the topic of chemical and bacterial analysis of mussels
(Gazzella Ufficiale della Repubblica Italiana N. 81 del 07 Aprile 2003)_ The Ancona laboratories of lhe IZS-UM are also involved in lhe classification
and in the syslematic
survey of the areas where harvesting of mussels and clams far commerciai use is authorised.
The project will involve the collaboration of researchers of the Teramo University, Veter;nary Medicine experts in toxicology and anatomical
pathology and lhe researchers of the Istituto Superiore di Sanità (ISS) experts in food safety and endocrine disruptors risk assessment by in vitro
toxicological studies. The Teramo group includes veterinary researchers with expertises in phannacotogy,
toxicology, anatomical pathology and
histology proven by numerous publications in indexed and impacted journals. The engagement into the project of researchers belonging to different
scientific disciplines ensure a multidisciplinary
approach. The contribulion of Teramo group will be focused in planning and conducting chronic
toxicity trials on fish, in the study of toxicological
pathology and in the identification of cellular biomarkers of effect. The Teramo group has its self
taboratories operating in the field of b;ology, toxicology, anatomical pathology and veterinary medicine. The laboratories are well equipped to
implement in vivo toxicological
experimeols with ali the necessary technical facilities available.
ISS is the main ins!itution of the National Health System as regards human health. Among the departments within ISS, the Dept. of Veterinary
Public Health and Food Safety is especially involved in chemical and microbiological risk assessmenls
in feed and food being also the National
Focal Point of the European Food Safety Agency (EFSA). In particular, researchers in the Food and Veterinary Toxicology Unit focus their activities
on the evaluation of potential adverse effects on human health following exposure to a number of compounds acting as endocrine disruptors. The
laboratory is fully equipped to perform celi and molecular experiments and analysis. moreover possessing highly cost facilities for microarray and
Real-time PCR assays.
G RELEVANCE ANO IMPACT FOR THE NATIONAL HEALTH SYSTEM (SSN)
The European Commission
(EC), as already mentioned, asked the European Food Safety Authority (EFSA) to give a scientific opinion on PBDEs in
food and in August 2011 the EFSA Panel on Contaminants
Diphenyl Ethers (PBDEs) in Food [19].
in the Food Chain (CONTAM) published the Scientific Opioion 00 Polybrominaled
Following the advice of the CONTAM Panel, a monitoring program was carried out starting trom 2006 and results obtained from the analysis of 19
PBDE congeners in 3971 foOOsamples were provided to EFSA by eleven European countries, covering the period tram 2001 to 2009. No data
were submitted from Italy because of a lack of information: the PBDEs contamination
level in Italian food has been. to dale, poorly investigaled.
Moreover, among the eight PBDE congeners (BDE-28, -47, -99, -100, -153, -154, -183 and -209) considered to be of primary interest for dietary
exposure, relevant toxicity data were available oniy for BDE-47, -99, -153 and -209, therefore lhe risk assessment could be managed only for them.
The EFSA Scientific Opinion strongly recommend to continue lhe surveitlance of PBDEs and to pertorm any further toxicological study on PBDEs
taking into account the most relevant congeners to human exposure. The EC is currently eonsidering the establishment
of maximum residue Iimits
for these pollutants and is encouraging Member States to carry oul measurements to define the low background levels. The Tolerable Intake Level
(Tolerabie Daily or Weekly Intake, TOlfTWl) has not been detennined for PBDEs by expert bodies such as the European Food Safety Aulhority,
because there is yet insufficient information available on their toxicity and their occurrenee in food.
It is, therefore, necessary to inerease the knowledge 00 PBDEs contamination
improve the toxicological
levels in the Italian environment and in food matrices as well as to
assessment of these emerging contaminants. As a matter of fact without knowing PBDEs contamination
levels it is not
possible to make a risk assessment for the Italian populalion. The study of mussels as sentinel organisms can be of great help in the assessment of
the aquatic environment.
Overall, this project will g;ve a great contribution
in the establishment of PBDEs contamination
levels in primary senlinel organisms like mussels in
Adriatic Sea. Moreover, relevant contribution lo the elucidation of PBDEs potential adverse effecls on human and wildlife will come trom both in vivo
and vitro toxicological studies.
A valuable tool to discriminale
among PBDEs potential and relative toxicities would be the establishment of toxicological parameters to define
accepted Toxicity Equivalency Factors (TEFs) for the different congeners. The TEF approach is of great importance in the risk assessment of
chemical contaminants
and is a very usefullool
compounds). This interdisciplinary
definition.
at regulatory level, but il is available only for some classes of substances (dioxin and dioxin-like
study which will provide exposure, loxicological and mechanistic data may really serve as a basis for the TEFs
[19] Scientific Opinion of EFSA panel on Polybrominated
Diphenyl Ethers (PBDEs) in Foed.
H:COMPLIANCE WITH THE CALL OBJECTVES
Ves or No
yes
Reasons
The present project deals with developing new reliable analytical methods for PBDEs analysis, their measurement
accumulation capacity and the exploitation of their toxicological properties by in vivo and in vi!ra studies.
I PROPOSAL BUDGET
in mussels to study lhe
COSTS
L1ST OF PROJECT OVERALL
COSTS
Permanent
slaft
Researcher
Contracts
Missions
Ins1ruments and 10015 (Leasina - Reol\
Consumables
Published works,Meetinns
IT Services
200000
110000
15000
135000
72000
5000
110000
15000
135000
72000
5000
24000
5000
566000
24000
5000
366000
and data bases
Overheads
Coordination Costs
Total
L1ST OF PROJECT COSTS
PROPOSED FOR FUNDING TO
THE MOH
Ministero della Salute
Direzione Generale della Ricerca Sanitaria e Biomedica e della Vigilanza sugli Enti
Rlmodulazione Ricerche Finali:z:zate
Mod,RF-RIM-Globale
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Progetto:
PROGETTO
Settore
Destinatario Istituzionale
Responsabile Progetto.
FINANZIAMENJOAPPROVATOI
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An integrated analytlcal, in vlvo aod in vitro approach'to chmetenzepolybro'mlnateo
dipt1enyl erhers CodIce
tPBDEsj in ftalian mussels;a oasis fcìràJoxic Equjvai~nh~'i:t5t?1'tWh)rop(\~~k
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listìtuti zcìCÌjJrotììattlclSpe'lìmèilraln:;\.:,';;
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IStitùto z9oj:lrcìfiìattlca Sperimentale 'dèll'Ui'n6'riaè'òèlle;Màréhe
Roberta Gala,in]
RIEPilOGO
Allegato
1 Regioni
e Altri
RF 2010-
2311608
239200.001
€
•
RIPARTlZIONE'FINANììAMENTO'
VOCI DI SpE~A
:l,tlO ooa.Od
Missioni
-€
-€
cA ttrezzatu re (Leasi rig.Affitto)
€
Consumi
€
Pul:lblicazioni Convegni
€
U700.00
16000:00
79200.00
10700.00
Elaborazione
€
€
21600,00
€
€
239 20P,,00
Personale aContratto
Dati
Spese Generali (Overhead)
Spese Coordinamento
Totale
O
IlResponsabiledel Progetto:
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Il Legale Rappresentante:
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Pabl;Ìllcaii'()~i~éORiì~IÙ:\L
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Spese Gènéali (Ov:èr1)~iJ:~}'
Sp~se'pq()rdlnà'rrìerito•
Totale
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Il Responsabilede1l'U01:
Il Respbr'lsabiìe,dell'rogettb:
";",:C,:::.
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iLéll!ì~OR~
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Il Leg"le Rappresentante:-.I~f','",,,,,',,,,
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Ministero dèlJaSalute
Direzione Generale della RicercaSanitaria e Biomedica e della Vigilanza sugli Enti
Rlmodulazione Ricerche finalizzate
MODRF.RIM-UOZ
Anintegratedanalytical,in
vivo andin" vitro
aPproach
io~charaeterize:p,:~lybrQmln~'te~
diphenyl.
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U02 .
•
Progetto; . e!hers(PBDEs) in ltal!ao mussels;abas~sfor aTòxi~@~f;~I~!~l~E~R~~jJgnPfPp~s~I;:
DipartimentO ,diScienzedegliAlime'nti .
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., .
Denominazione
, Università'dègli studi di Teramo
IVlOniaPe(l,lginl
Istituto
Responsabile U.O.
4
"
-
a Contratto
Missioni
Attrezzature
(Leasing-Affitto)
€
,c , ..
€
2000.00
16000.00
' 11000;00
2,600.00
€
€
Consumi
Pubblicazioni
Convegni
€
Elaborazione
Dati
€
Spese Generali
Totale
(Overhead)
.
Il Responsabiledell'UOZ:
kw .•...
Il Responsabiledel Progetto:
Il. DIRETTORE GENERALE
Il LegaleRappresentante:
(Dr. SìWanoSfllcrin'
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RIPARTIZJONE
FINÀNZIAMENTO., '
VOCI DISPESA
Personale
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34000:00
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Codice
Pro~e,tto:
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Il Responsabile del'p,rrigetlo:'
Il Legale Rappresèr1ta'nte:
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. Allegato,2
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Direzione Generale Rig!.rca Sa~i.~rlq.e Biqmedica li dellçl VigNanza Enti
BANDO pROGETTI DI RICERCA
GIOVANI RICERCA TORI- RICERCA F/!'IALIZZA TA 2010
Project Title:
.
,
".' .
An integrated analytical, in viva .flnd in lIifio
approach to characterize potybrominatèd
.....',
diphenyt ethers (PDBEs) in Itafian in!J~€I.£ ..:./
abasie for a Toxic Equivatent Factors
TEF
ro osaI.
IstitUto Zooprofi/atlieo Sperimei1tale
dell'Umbria e delle Marche
Project Code: RF-201Q;;~311'608
DATI DEL PRINCIPAL INVESTIGATOR E DEI COORDINATORI UNITA' OPERATIVE
.
Cogilome
Dati di Nascita
l
Codice Ascaie
GALARINI
24/0311965
i
GLRRRT65C64LSOON
Nome
ROBERTA
.
.
RIFERIMENTI PROFESSIONALI
.lstiIUò looPròfilallìaì Sperìmen1aledélFUnibriae delle MarChe
$edelavoro
Pòsizione Attuale ,,'
Besponsabie CélitroVarlClazione e Sviluppo Metodi (CSVM3)
IndirizzoLavoro
Via G.Salvell1ini,
Sede svolgimento
del
elio
.IstitutoZòèProfiIatliooSpetirnentale deR'Umbriaede!le Marche
n01, 0612& Perugia'
T~IefOnÒ;
,.075.343272
Cellulare
Fax
075 - 3433050
EVENTUALI UNITA' OPERATIVE
U.O.1
, Islituzkine
Divisione
Responsabile U.O,
IndirizzoLàVaro
IStilulOZogprofilallico Speiitnentale deIl'Urriì:xìa El delle.Mat<:tre
UltJoratoilPCoi1ll'olbchimioo e bionÌonito.
Arianna
io
RIersanli
Via Cu. a.di Posatora,
Telefono'
.
071-41760
360100 Ancona
Fax
071-42758
E-mail
,:[email protected]
U.O.2
. UnivelSilà déglìsl:udi di T eremo
Istiluzione
Facoltà di-lVledìcinaVeteririaria -Di arti mento di Sciénze d
Divisione
Responsabile U.O.
Monia Pini;
:Viale Cris i 212, 64100 Teramo
IndirizzoLavoro
Telefono
0861-266988
Fax
0861-266968
li Alimenti
E-mail
mperugini@unite,it
U.O.3
Istiluzione
Divisione
ResponsabileU.O.
IndirizzoLalioro
,1stitiito superioie di sanità .
'Dipartimento' Sanità Pubblica Veterinaria
Tossicolo
ia Alimentare e Veterinaria
Sabrina Tatt
Viale R ina Elena 299 00161 - Roma
TelefuiJo
Fax
06- 4990353006
- 49387101
Principallnvestigator
(Firma)
~:~
/
e Sicurezza
Alimentare
- Reparto
E-mail
sa brina. [email protected]
.
\
O<-/~d4Y~
Direzione
Generai~-"RÌèfir'Ea'~(rhjt~i-fa
e Biomedica.
'edella Jligilanza Enti
. . BÀ",P.9:1}~OGmIDì
RICERCA
GIOVANI RICERCA TORfO'RICERCA FINALIZZATA 2010
Institution:
Istituto Zooprofilattico Sperimentale
dell'Umbria e delle Marche
~,,,,,,-'
;5:;~;~;:~'";-;'~_'~#::;,
Project Coqe: ''''~7-''=''''RF;~2010;:<3'11608
"l'."'-
,;,
c.,'
-
Project Titie, An integraled analytièal, in ~I\lo and in
.',
vitro'approach to characterize polybromjnatE~d
",:'~/
diphenylethers (PBDEs) in Italian mus~els:'a oasic' < ,,'
for a Toxic Equivalenl Factors (TEF) proposa1:-"':'_'-' .
•
Princlpallnvestlgator:
OISTRIBUZION~,,~~~~;~~~~~OGETTO
COMPI.-ETO
Roberta Galarini
1 Personale a Contratto:;:,,:,": ,.
W Gontratti:3Me~f(::6nfràlio'Tòf~li: 60
'.
.
Professionalità aCoriiià!téi~.tàlireato in disciplinechimichel Tecnico di laboratorio
TOlalèCosto1 OoOOO!€~ii;jit~.;.'. .
2_Missioni
Elencazioo
N'4~Spese(jì:vr~g9ìo
istopatologica/Uit",.
ottenuti nel corsO; HéJI '.
Totali.MÌssi6ìÌic:1'1iùòY;
3:Appa'écchiatU
n
t,.
Sistema'GOriipie(.',nagiÌ)é
~MjsSìol1r e~Gosto :....Motivazione
Y
~:;":':giò':per
rfunionicon il PI e le UUOO, per sopralluoghi, per il supporto all'interpretazione'
'r l"parteCipanone a Convegni nazionali t intémazionali con presentazione dei risultati)'
'.
.
'011" (Leaslrìg:Rent): TIpologia Apparecehiaturà Mesi Contratto. Motivazione
(micto'soopiooltico con obì~ttM planacromatici, videocamera, interfaccia di
connèssionè~",é((:
Comprensiva:,afsoftw~iré per I~ géstro'ne~della_Videocame~1di acquisizione, analisi dì
inìmagln~';::_:~~J-~~
.<é:àr....
nòIeggjò'.con riscatto it:'>-l2' m~L Motivazione:' acquisizione dati
biometricUrriò,nct
ic)p:e statrsfiCa rìspettp ai fattori -rD9'nitorati -,(tfpologia' di esposizione e 'tempo diesposizione);' ~.
"
ToH,li'CostoK'
€ ,.
,
4aCOMSUMI:!,Reàgentifi",StandàrQ
".nellticinativi e l)Ìarcati"solventi':: materiali per la purificazion!, colonne
gàscromatograflc
~QMS~MS;~Acq'uistq
di vetrini mkro'array; reàgenti per: microarray, colture cellulari),
H
'
estrazioneema'ni
",RéaHime Pc.R. KItcOmmercialiper analisi di citotossicità edi Iivellì di ma,catori
funzionali;:',',),
,'~
.TotahCosto Rea en
.....<
4b CONSUMI',' MOAAlli'Aniì\laIF'N',cAriimàli;
:Tipologia,D.e;;crizione
25Ò esempialiia~llitilà'Jàìlnolti'&subà(jmii)di Danio rerio (zeoraftsh - Pisces) riprodotto in callivilà in vasche a ricircolo dà.
80 litri(totalei1Z"vàs'çlièi;per)igrilpPi. $peijmejitali:gruppo controllo e 3 traltamenti di cui 2 con mangime contaminalO con 2
concentrazionìdiffèée!1ti.:e'ug~oon mangìme nalurale).
Totali Còstò'!'iIodèni'Àniiij,jIi£00'6€.' .
4cCONSUMI.;~~b~.!'ll,!!il~,S[ip'oIOgia S~bcontratti Costo per subcontrtilttQMotivazione
Analisi morfo,.blomemctìe (numerò rodletealls, numero, forma densità ottica,aggregati dei maerofagi, istopatologia) di
preparati istologiciÌiiitochlì1Ìiciè ulltastrtitt~rali (TEM)dei seguenli <lrgani e tessuti: fegato, tiroide e gonadI.
TOtaliCosto SUbcqntratti 1500Q €
41:1CONSUMI Costi Pazienti: TipoJogia, Descrizione e Motivazione
Totali Costo' Pazienti
4e:. Costi Pùbblicazi'oni: .N Pubblica4ioni Stimate e Motivazione Costo
ll
Totale Costi Pubblic;iZioni
4f. Costi AltroSpecincare TIpologia e Quantità
5, Convegni: N' e tjescrizione Convegni Stimalfe Motivazione Costo
N" 1: organizzazione evento accreditatoECM per ia diwigazione dei risullati del progetto
N' 13: partacipaZione a Conv<I9ninazionali I intemazionali con presentazione dei risultati ottenuti nel corso della ricerca
(pagamento quote di'lScriziori!l)
otale Costi Conliéril10700 €
6..Elaborazìoni.D~Hi:Sèivizi' rr -$tatistici e Basi dati: Tipòlogia, Desctizione.e Motivazione
Totali SeNiLi IT
7~Costi di -CoordinamentO;
Descrizione" Costi e MotivazJcine
TolaleCostì Coordinamento
,
Principal Investigator
Afiornfu '
(Or•.,sUIIario se
Rappresentante legale (Firma)
Pagina 1
\
Allegato 38
g
,
'
'
,-,~A&.~.~
Direzione Generale
Ricerc,a
SG1J/tarfa e,J!.ìàmediçç:f(della-,Vigl1anza
End
BANDO PROGETTI DfRICERCA
,GIOVANI
RICERCATORIRICERCAF/NALIZZATA
2010
.
.
.
- '. ,
.
-'
..
Project Tit/e:
.,
An integrafed ana/ytica/, in vivo'afId in vitra
approach fo characferize polybro!nìna/ed
diphenyl efheis (PBDEs) in italian 'riicrSsels: a '
basic far a Tòxic Equivalent FacfOrs (TEF)
ofOoosal,
-- -CordinaUon Institution:
Istituto zooprofil~tlico Sperimenla/e dell'Umbria e
delle M~rche
Principallnvestigator:
Roberta Galarini
Proiect Code: RF-20fO-2311608
"
-:,
,
DISTRIBUZIONEB()DGET;pROGçTTO
.•
.
:--.
U.O.:
"
,
Arianna Piersanti
U.O. N.1
,:'.,'~ ~,~~;/'
_"
pen?~i!"azi~lle.\;~!?4jp""7lstitl,Ìto~ooprofilattico
,
Responsàbile
,
Sperimentale dell'Umbria e delle Marche
'(~)l~
;"-~;~_~_:~_~~-~'
~:- "
1 P,_erse, -, 'naie, . a Cor.trattri:tij;,t>---'~-<
,
• "":-.'"~'
__ "'_.".r~";_"'*
_ _~ -,:
.
•
.
N'Contratti:2-,MesIContra~o;Tota":
54,,'
,
ProfeSsionalità Coriììl.ttO"Laite%.to in disciplinechimicheiTecnico di laboratorio
Totale Costo 750dèY',.J;~,[J;(:~
'
, ce
".
2 Missioni Elencàzione",N
ionj.e,£ost,o-!;;Motivazione
,
W2SC;S~"se divi~~.~iBfìtt
Òggi9~r ~."iot'ri
li PI e le UUOO. sopralluoghi e p~rtéCipazlone'a Convegni nazionali
r,JnleTaZlo,n:lIl},?-I:'};~"'s~,!
_~U:,~t¥>nutì.nel cor:so della flcerca
Totale Costi Mlsslom 8000
' , ""JL,'
3. À1>parecchiature:;"SIrumentazione(t:easing-Rent);
TIpologia App~recchiatura Mesi Contratto - Motivazione
Totali,jC6Sto '. >'are'tOt1it:ritire~~{~i'bl,;;'~5~~.';,:.
4a PO~,~YMIL ~~'~.,g~~t~~H._~Ii,~~q~St~{l~~I~i
a!1aUti.cinativi e marcati- solventi - materiali per la purificazione colonne
gascr;or,!'ll<?gl<lfictt~;~~\'l'."s~~6\IL~f~~~S,
'.
'
TotaltCosto Re~ enW'.:l3000,,~
", ','
, 4b, CONSUMt: M()d"IIihì1linalgN"'f¥\.~iln,.TìPologia;Descrizione
Totali.Co~ioModellìAnimàli~,"','0;;'::::~ :o~-/(~~\ _ c,,..
_.",
4è CONSUMI: Subcontiattì;.Tipòiogia'SfibCoritrntli
CoSto' per subcontratto Motivazione
'
Analis;'morfò-biom~tr1$e:'(nliìn,¥i&«'ro:alè);reìIS,crlùméro,forma densità ottica aggregati dei macrofagi. Istopatologia) di
preparati istologiciFl$!0ciJ.lfìil\çi,èultriistruttUIJlIi
(TEM)dei seguenti organi e tessuti: fegato, tiroide e gcni'di.
Totali,Costo $ubroritraltì:150ooc
"
',',
'
'
4d CONSUMI Costi, Pazienti: TIPÒIOgia,O",S,crizionee Motivazione
a
"?"
c-: .;'.
Totali Costo Pazienti
4e. Costi Pubblicazioni;
N° Pubblicazioni Stimate e Motivazione Costo
Totale Costi PubblicaZioni
4f. Cosli Altro Specificare Tìpoloijì,ieQuariìità
5. Convegni:
NQe descrizione
Convegni
Stimati e Motivaziòne Costo
N' 1: organizzazione evemoaccredl!àìo,ECM per la ,divulgazione dei risultati det progetto
N° 8: partecipazione à Convegni nazionali f intemat.iOnali con presentazione dei risultati ottenuti nel corso della ricerca
(pagam~nto quote di Iscnzione)
Totale Costi Conv nì.7400
6. Elaborazioni Dati Sèrvizi IT-Statistir;;ie B,a~idati: Tipologia, Descrizione e Motivazione
Totali Servizi IT
7. Costi di Coordinamento
(solo UO 1): Descrliione, Costi e Motivazione
Tot~le Costi Coordinamento
Pagina 1
o
~
,
.Allegati\' 3B
'
.
.
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t~~£'~~AY
Direzione,Generale
Ricerca
Sanitaria
e BiQmedit~,è dellaVìgUanza
Enti
BANDO PROGETTI DI RICERCA
,
GIOVANI RICERCATORI ~RICERCA FINALIZZA TA 2010
Projec(Code: RF-2010-2311608
.
;
~
.
,
D/STRIBUZIONÉ
."
BUDGET pROGETTO U.O. N.2
~
I
.'
projeetTlt1e:
\"
An integrated analytical, in vivo and Iii ~Itro approach,' :
to characlenze polybfÒminated dfphenytethe[JL';';;-(PBDEs) initalian ,~~ssels: a basic for a Toxic
Eouivalent Faclors TEFi DroDosal
Cordlnallon Institution:
Istituto Zooprofilattico
SDerimenlale dell'Umbria e delle Marche
Principaf Jnvestigator:
Roberta Galarini
ResDonsabile U.O.: Monia Pervoini
DenorPinazione 1)0 N"2•,Univel'Sità'degli Studi.(!iTeramo- Facoltà di Medicina VeterinariaDipartimento di sèienze
degli
Alimllnti
.
.
-"~'
'-
1 Personale a contrattò:
. .~'
N" Contratti: ~ Mesi Contralto Totali:,
,Professionalità
Gontraìto: '
TotaleCPsto,.
.,
2' Missioni "E1enCazfone N" Mission; e Costo _Motlvazicmè
, N'lO: Spese di vìaggio,.vilto eaìlOggioperriunioni
conilPI e le UUOO. per" supporto all'interpretazì'one1slopatologica e
ultrastrulttlrale e per la partecipazione a ConÌlegni nazioriali / intemazionali con presentazione dei risultali ottenuti nel corso
,dellafÌCeÌ'Ca
.,'"
".,,'
".~'",
.:'
'"
TotaIH,lissioni.2000'
,
'.
,'.
'.'
.
.'
,
3, Appanlcèhlatùrè
e s~rurnerltazione{l~sing-Ren~J'TipologiaAPpareccl\iatura
Mesi COntralto~Motivazione",:
Sistemà ,-completo di'analisi,j:lr.immagina',\microscopio
ottico con obiettivi planacromatiCi; videacamera, intetf.ìeeia di
,oonne;ji;ìone con ,l'p, woìi<s!Jltion .&lmprelÌ~1va <ji software per la gestione della videocamera, di acqursizione, anaUsi di
immagine
e elabOrazione' 'statislical-:';'
. noleggio' con riscatto a 12.;mesi.
Motivazione,
acquisizion~' dati
bìomètiìcj/morfome!rid
ed é1ab9razio~e ;'statistica' rispelto' ai faltori monitorati (tipologia di esposizione e tempo di
a
esposlz1.0ne).
".0.',
.
TDIa", C;oìrto Annarecchialure
- :;;:-
'.
,
.
1.6000 .
4aCO_~SUMI;.
R~?~nti .,9_~-~Ione-.
'ff~
""'«.-"~
,"
ConslJffiabili d'l labomtoriç: reag~nti, solventi organici, alooli, acidi, basi, sali. materiale monouso. strumentario da
di."ozione e da labOratorio (spatoÌe,pinzeiforbièi,
bisturi)
'Totali C'Osto Reaoenti 5000' ,';.' .
'. <
.,.
4b CONSUMI ,Mo<l.elli Anim;ili- N' 'mmal;;Tipolo9Ia,
Descrizione
'250 èsemplari (adùlfj; avannolt;;subadulti)'d(
Dao;o rerio (zebrafish ~ Pisces) riprodotto in cattività in vasçhe
ricircolo da
80 litri (tot'lie 12 vasche, per 4: gryppi sperimi!nli!lf:gruppo
controllo e 3 traltarnenti di cui 2 con mangime contaminato con 2
concentrazioni differentl e uno"cb'" mangime natùràle).
Totali C9sto Modelli Mimali 6000
'
a
.T
.,'.,
'
.
4e CONSUMI. Subcontratti: T'1'ologia Subcontrat1i Còsto per subcontratto Motivazione
Totali Costo SubcontratlÌ
.
'4d'CONSUMI CòSti PaZienli:Tipolcigia,. Oescrizionee;Motivazione
T"taii Costo Pazienti
~
40. Costi PubblicaZiòni: W Pubblicazioni Stimate è Moìivazione Costo
Tolale COsti PubbliéaZioril
4f. Costi Altro Specificare Tipologla e, Quantità
Totale Costi Altro
5. Coòvegni:N"
e-descrizione Convegni Slimati e Motivazione Costo
N" 3:Jscrizioni per: la 'partecipazione a Coflvegni n?zionaH I internazionali con presentazione dei risultati ottenuti nel corso
della ncercà(pagamento
quote di iscrizione)
.
,
Totale'Costi Convenni 2000
.
6. Ela~o'razioni Dàti Servizi IT'StilIistiCie'6asj
dati: Tipologia. Descrizione e Molivazione
T olall Servizi IT
7. Costi di Coordinamento
(solò U01):DèsCrizioneCosti
e Motivazione
Totale Costi Coordinàinènto.
Principallnvestigator
(Firma)
Rappresentante legale (Firma)
r
Pagina 1
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"Sa.ni~. ~Obbl1caVetèrinatià.e
Pàgina 1
Allegato_ 4
Project Tltle:
I
Direzione Generale Ricerca Sanitaria e Biomedica e della Vigilanza End
BANDO PROGETTI DI RICERCA
GIOVANI RICERCATORI- RICERCA FINALIZZATA 2010
I
An integrated ana/ytical, in vivo and in v;fro approach
fo characterize polybrom;nated dipheny/ ethers
(PDBEs) in Italian musse/s: a bas;c for a Tox;c
Equ;valent Faclors (TEF) proposal.
Institution:
Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria
delle Marche
f Principallnvest;gator:
ProjectCode:RF-201~2311608
I Roberta
l-
-
e
Galarin;
MILESTONE
OBIETTIVI PREVISTI
•
1° anno
•
•
•
•
•
•
2° anno
•
•
•
Redazion~ di una procedura (SOP) di un metodo in GG-MS/MS per la
determinazione di PBDE nei tessuti e nei mangimi (WP1)
Inizio campagna campionamento delle cozze del Mare Adriatico (WP1)
Risultati preliminari delle analisi chimiche dei campioni di cozze per la ricerca
dei con eneri di PBDE
P1
Fine~campagna campionamento delle cozze del Mare Adriatico (WP1)
l'
Risultati definitivi delle analisi dei campioni di cozze per la ricerca dei
I
congeneri,di paDE (WP1)
Valutazione statistica dei livelli di contaminazione trovati (WP1)
AnaUsi chimiche dei campioni di mangime per gli studi tossicologici in vivo
(WP1)
Risultati preliminari degli studi tossicologici in vivo utilizzando come modello il ,
pesce zebrafish (WP2)
Risultati preliminari degli studi tossicologici in vitro sulle due linee cellulari
individuate (WP2)
Analisi chimiche sui tessuti dello zebrafish per la ricerca dei congeneri di
PBOE
1j_~
.~.~~
__
.~_._-----1
II
o
•
3° anno
•
•
Fine progetto
•
•
~.
__
~
Risultati finali degli studi tossicologici in vivo utilizzando come modello il
pesce zebrafish (WP2)
Risultati finali degli studi tossicologici in vitro sulle due linee cellulari
individuate (WP2)
Elaborazione dei risultati finali (WP1-2)
---------------~1
Divulgazione dei risultati: organizzazione di un evento accreditato ECM
(WP1-2)
Relazione finale
IL
DlRETIORE
(Dr.
Principallnvestigator
Silvano
GENERALE
SeueTÌ1li)
Rappres ntante
(Finna
l
~~
!
'" .:t '
.p.~rtmì€/~"n
iriii!l/r,!ted
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cìnalytitai,'i.~viV~:.ari/i iri~
'.vttr~1f~ìl'tiJ'1!Hafaéteniè'IJOlybI'omina
ted,;"
dipc;nytè'lh":f!'S"{PBDEs) italian mussels::abasis for
a Tm:ic.Equivalent Factors rrEF) proposal.
~~
••.••<!),j4;<--
"~:;,':,-
in
•
~
,
. -.' > -".):~";;.~-;--- -.
,,..A'~>_""~\-'
'Areci::X;Biòm~djca
'iriSiitutiòrif Istit£fto .Zoop~ofilatticoSperiinenttI/e
dé'ìivìrii#iitè'dcllèMarche
•
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';'2'¥~
Pro 'ect Code:RF!'2Òfo-23116Ò8
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'Deranil~{~ra":,~,,::,~/;~.~;:,,,~
~Ms~'di:Ne
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Unità_. Opemtiva
.' "., sarasWitala
_ H_'~"_- . - roèn::a:
-~.
, - Centro
---~-. 5Vilu'poevalrlazicre
p
.ILLEGALE RAPPRESENTANTE
me1Ixli
DESTINATARIO ISTiTUZIONALE
Denominaiione
deIIB11eOestìlafari:l lstitUzionaJe~
Istilulo zooprofìlatli:XlSperimen\aIe
deifUmbria e delle Marche
..
.
"Silvano Sevelinì
..NtmìnaIivo del
,_~ 1'i
CF SVRsVN 55M02F478H
~~.'.
~
.
è .
.."~
i Destinatario Is1ituzìonaleed è tenuta a
le della Ricerca Scìèn1ificae TecnoIogta - per eventuali oon1ro.lersieo
N°
1
2
,/
Oescrizione fttMtà
/,
~. i~
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Redàzlon, SO? J1'J'lloòoP80E 1~5S~I~"",nQI[11!
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CarTlJionaménlo cozze
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1-2'3
33'
36'
4
1-2-3
33'
36"
~
1-2-3
33'
36'
4
AnaBst chimIche
~.
feDE cozze
4 Vah.tazlone-s1a'tlstlC'S l;fel" conlamlh'~done
5 AnaHsl chimiche PB,DE ITElngllril per pes:i
G srùdJ tos~ttolOgftJ in vivo,l~le'br'aflsh
7 studi tosBlcologici In "ftrollnea cellularI.
8 Analisi chfrrliche P8BE tesslltJ lebraflsh
9 Elaborazione del risuttati finali
IO Divulgazione dal rispltatl
11 Relazione fnale
Ittillltà <fn"I!lIoB dì tipo ohimlco
FttMli d!lipo tl)$$ìel)!oglco (in IoivoAn lIilro'
8;;borJIl:ione dal
R
,:;:;:!:!:
lt;~flr;rrOFlEì3ENS1A!.S
~Sil1Xln<l &:v~. •
Rappresenta
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(F"
Principal Investigator
(Firma)
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~C~
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Titolo del progetto: Approccio analitico integrato con studi di tossicità in vivo ed in ~ìiiì'/pe~\"
y
caratterizzare gli eteri difenilici polibromurati (PBDE) nei mitili: base per proporre una scala di fattori di
tossicità equivalente (TEF).
Codice del progetto: RF-2010-2311608
Principal investigator: Roberta Galarini
Istituzione: Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Umbria e delle Marche
A. Profilo del Principal investigator
A.A Ruolo nel progetto
Coordinamento del Progetto. Sviluppo e vaiidazione di metodi per la detenminazione dei PBDE.
A.B Posizioni e Riconoscimenti
A B 1 Posizioni
Istituto
Università
Università
IZS Umbria e
Marche
IZS Umbria e
Marche
IZS Umbria e
Marche
Divisione
Istituto di scienze
chimiche
Istituto di scienze
chimiche
Laboratorio di
chimica
Laboratorio di
chimica
Laboratorio di
chimica
Dall'anno
all'anno
1990
1993
1993
1994
Urbino
Posizione
Speciaiista
Maanetica
Speciaiista
Maanetica
Peruaia
Assistente Chimico
1994
2000
Peruaia
Chimico responsabile
2000
2005
Peruaia
Chimico responsabile
2005
2011
Luoao
Urbino
in Risonanza
Nucleare
in Risonanza
Nucleare
'.
A.B.2 Premi e riconoscimenti
A.B.2.1 Official H index
13
A.B.2.3 Altre informazioni
Esperta in chimica analitica applicata alla sicurezza alimentare, in particolare nello sviluppo e validazione
di procedure di laboratorio per la determinazione di residui mediante GC. HPLC. AAS, GC-MS. LC-MS/MS.
Buona conoscenza del quadro istituzionale e giuridico dei piani nazionali residui, in termini di attività di
laboratorio e di interazione con le istituzioni (Ministero della Salute, Istituto Superiore di Sanità, ispettori
veterinari) coinvolte nella sicurezza alimentare.
Esperta nel processo di accreditamento internazionale secondo la norma iSO I iEC 17025 e nei metodi
statistici applicati alla validazione e al controllo qualità dei dati analitici.
La formazione continua viene effetuata partecipando a numerosi congressi nazionali ed internazionali per
lo più riguardanti il controllo di residui chimici in alimenti e mangimi.
Autore o co-autore di oltre 100 pubblicazioni scientifiche (riviste internazionali e nazionali o atti di
conferenze), per lo più nell'ambito della chimica analitica applicata alla sicurezza alimentare.
Coinvolta come esperto in un progetto di gemellaggio con la Polonia per la formazione del personale
(2006, Laboralorio nazionale di riferimento di Pulawy) sulle procedure di validazione dei metodi
conformemente alla decisione 20021657/CE.
Presidente in due gruppi di lavoro della Rete Istituti Zooprofilallici Sperimentali per il rilascio di specifiche
linee guida: 1) Linee guida per la validazione intra-Iaboratorio di metodi di conferma per la determinazione
di sostanze non autorizzate ai sensi della decisione 2002/657/CE
(2010): 2) Linee guida per ia
validazione intra-Iaboratorio dei metodi di screening immunochimici ai sensi della decisione
2002/657/CE
(2004).
Docente in diversi corsi di formazione del sistema sanitario nazionale e delle università che si
occupano principalmente di farmaci veterinari e residui di contaminanti ambientali negli alimenti e nei
mangimi.
Principal Investigator in sei progetti nazionali di ricerca finanziati dal ministero della salute (Ricerche
Correnti) e partner in diversi progetti di ricerca nazionali
(Ricerche Correnti e finalizzate).
Supervisore di circa 10 tesi di laurea in Chimica e Tecnologie Farmaceutiche, Biologia e Scienze
Veterinarie.
Principali pubblicazioni peer-reviewed (in ordine cronologico).
presentati o in corso di preparazione.
Non includere
manoscritti
A.C.1. max 5 migliori pubblicazioni con dati bibliografici, IF, numero di citazioni fino alla data della
Proposta Progettuale
IF
3.757
N" cilafion
10
4.101
10
Caprioli G_. Clislallì G_, Galarini R.. Giacobbe D., Ricàutelli M., Vittori
S., Zuo Y., Sagratini G., Comparison of twc different isalmo
methods of benzimidazoles and their metabofites in 100 bovine liver
by soIid-pnase extraction and fiqu~~roma1ograPhY-dìode
~
detectionJoumalofChromBt~~
A. 1217,1n9-1785.2D1
4.194
2
Galmini R.. Fioroni L., Moretti S., Petlinacd L, Dusì G. Oeve1opment
and validation of a multi-residue liquid d1romalography-tandem mass
sp~~~netTy confirmatory method far eteven coccidiostats in eggs
Ano .ca Chimica Acta 700 167-176 2011
4.31
O
Galarini R., Buratti R. FlOfOni L., Contiero L Le98 F_Oevetopment,
validation and data quality assurnnce of screemng methods: A case
study Analytica Chjmica Acta 700 2-10, 2011
4.31
O
NAME
Scortichini G., Annunziata L., Di Girolamo V., Buratti R.• Galarini R.
Validation of an enzyme-Jinked immunosorbent assay screening for
quinolones in egg. poulb'y musde end feed samples Ana1ytica
Chimica Ada, 637 27~27B 2009
Galarini R., Fiorom L., Angelucei F., Tovo G.R., Cristohmj E.,
Simultaneous -deterrnination of eleven quinolones In animai feed by
liquid chromatograp~lh
ftuOl~~m:eend uttraviolet absofbancB
delectionJournalol
matoom
A 1216 815B-S164 2009
A.C.2. max 5 migliori pubblicazioni dello stesso argomento della proposta progettuale con i
dati bibliohrafici, IF e numero di citazioni fino alla data della Proposta Progettuale
IF
NAME
0.983
ElmA. C_, GaJarini R, Tatiechi M.l., DOrr A. J. M., Mantilacd L.
Antioxidanl Responses and Bi08CQJmulation in Idalurus melas under
MerollY Exposure Ecotoxicology end Environrnental Safety, 55, 162-
flrdtation
62
167,2003
0.643
4
0.505
7
Elia A.C .• Galarini R., DOrr A.J.M., Teticchi M.l. Heavy metal
contamination and antioxidant response ot a freshwater bryoznan
(Lophopus aystalr~~s PaD., Phylactolaemata) Ecotoxicology and
Envu-oomental Sefe
66,188-194,2007
2014
7
Elia A.C .• D6rr A.J.M., Galarini R. Comparison oforganod'lIorine
pesticides. PCBs, and heavy metal contamination and cf detoxifying
response in tissues of Ameju~s mela~ from Corbara, ~not and
T rastmeno la~(~~:
ltaty, Bullenn of EnVtmnmental Contamlll3'tion end
056
2
Bia A.. C., Galanni R., 00rr A.J.M., Carnevali O." Fioroni L., Taticchi
M. I. Polychlorinated biphenyls and antioxidant enzymes in liver of
Cyprinus carpio from Lake Trasimeno ltalian Joumal of Zoology, 72.
1.7,2005
Bia A. C-o Galarini R., D6rr AJ.M. Tatieehi M.l. Bio8CaJmu1ation of
Heavy Melals, Organochlorine Pesliddes, end Oetoxication
Biodlemicallndexes
in TlSsues cf Ictalurus melas of Lake Trasimeno
Bulletin ofEnvironrnental Contamination and Toxicotogy, 76, 132-
139 2006
Toxicolonv 78 6
463-8 2007
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i•
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::, .:w:';~~'~ 2
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t'~
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~.::
\.'
A.C.3. max 5 delle pubblicazioni più recenti con i dati bibliohrafici,
alla data della Proposta Progettuale
NAME
IF
Gamba V.o Terzano C., Fioroni l., Morelli S., Dusi G.• GaJariniR
'd,
3.757
8
4.101
10
caplioli G., Cristalti G.• Golarini R, Giacobbe O., Ricdutelli M .• Vitlorl
S .• Zoo V., Sagratini G., Comparison of two different isolation
methods 01 benzimidazDles and thetr metabolites in the bovine liver
4.194
2
Galanni R., Ftororri l., Moretti S .• Pettinacci L, Dosi G. Development
and validation of a mutti-residue ~quid chromatogmphy-tandem mass
spectrnmetry c-onfirmatory' melhod for elevan coccidiostats in eggs
4.31
o
Gotarini R, Buratij R Froroni L, Contiero L lf!98 F Development,
validation and data qualitv assumnce of 'Screenlng methods: A case
4.31
o
DeveJopment
determinotion
diadea
and validation 01 a confirmatory method far the
of sufphonamides fn mi1k by liquid chromatography
deleciton
'caChimicaActa 637 1ll-23 2009
u.
j"
IF e numero di citaiiopifT?','/
N°
"
":."-
citation
with
Galanoi R.. Roroni L.. Angelucd F., Tovo G.R., Cristofani E..
Simultaneous determina1ion of eleven quroones In animal feed by
liquid chromatography
with 'nuorescence end ultraviolet absorbance
detectionJoumalof Chnomatogra A, 1216,8158-<l1642009
by soIid.phaseextractionandliquidchromatography-diode
arrray
detectionJoumalofChrom ra A 1217 1779.17852010
.
ChimicaActa,700,167.1762011
s1udyAna -
ChimicaActa 700,2.10,2011
B Sketch biografici
dei collaboratori
Nome
Arianna Piersanti
Istituzione e Posizione rico erta
Istituto Zooprofilatico Sperimentaie Umbria Marche.
Chimico es erto.
B.A Ruolo nel progetto
Sviiuppo e validazione di metodi per la determinazione dei PBDE. Campagna di campionamento dei
mitili e analisi dei PBDE
B.B Posizioni
e Riconoscimenti
B.B.1 Posizioni
Istituto
IZS Umbria e
Marche
IZS Umbria e
Marche
IZS Umbria e
Marche
Divisione
Laboratorio di chimica
Luo o
Perugia
Laboratorio di chimica
Ancona
Modulo Contaminanti Centro di Referenza per
il controllo dei molluschi
bivalvi
Perugia
Posizione
Chimico a
contratto
Chimico
Responsabil
e dell'unità
contaminant
i or anici
dall'anno
."_i
~;<,<>(:~.r~
.•..
,;
all'anno
1999
2000
2000
2005
2005
2011
B.B.2 Riconoscimenti
B.B.2.1 Official H index
5
B.B.2.2 Premi e riconoscimenti
1997 Laurea in Chimica presso l'Università di Bologna
1997 Master of Phiiosophy (Science) presso l'Università di Birmingham
1997 Abiiitazione alla professione di chimico, Universilà di Bologna
1997 Assegnazione di una posizione di dottorato di ricerca presso l'Università di Venezia, consorziata
con l'Università di Ferrara.
2002 Specializzazione in Chimica e Tecnologie Alimentari presso l'Università di Perugia.
Altre informazioni CV
1995.1996 Ricerca nell'ambito della sintesi organica applicata alla chimica supramolecolare sotto la
supervisione del Pro!. JF Stoddart presso la Scuola di Chimica dell'Università di Birmingham,
1996.1997 Ricerca in fotochimica ed elettrochimica nel gruppo del Pro!. Vincenzo Balzani presso
l'Università di Bologna
1997.1999 Il dotlorato di ricerca finanziato dalla European Vinyl Corporalion (EVC) Porto
f
~.:
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-:-:::1
'
'
/
Marghera, Venezia sul controllo dei livelli di inquinanti organici persistenti (PCDD I F, PCB, IPA)
nelle emissioni industriali.
Dalla fine del 1997 l'attività si è concentrata sulla chimica analitica, applicata all'ambiente ed agli
alimenti con particolare attenzione ai contamianti organici.
Esperta nello sviluppo e validazione dei metodi di analisi utilizzando tecniche PLE, SPE, SPME e
GPC di preparazione del campione e GC con rivelatori seiettivi, GC-MS, HPLC-DAD per l'analisi
strumentale.
La formazione continua viene effettuata frequentando numerosi corsi di formazione nel campo della
chimica analitica e della sicurezza alimentare e partecipando a conferenze nazionali ed
internazionali.
Autore o co-autore di numerose pubblicazioni scientifiche (riviste nazionali o internazionali €i atti di
conferenze), per lo più di chimica analitica applicata alla sicurezza alimentare.
Docente in diversi corsi di formazione del sistema sanitario nazionale e dell'università soprattutto
nell'ambito dei contaminanti organici persistenti, pesticidi, additivi alimentari e mmine biogene.
Partner in progetti di ricerca nazionali (Ricerche Correnti) e Principallnvestigator nel 2001 (Ricerca
Corrente).
B Sketch biografici
dei collaboratori
Nome
Monia Perugini
Istituzione e Posizione ricoDerta
Università degli Studi di Teramo. Facoltà
Medicina Veterinaria. Ricercatore confermato.
di
B.A Ruolo nel progetto
Studi tossicologici in vivo sui PBDE utilizzando come modello zebrafish.
B.B Posizioni e Riconoscimenti
B.B.1 Posizioni
Istituto
Università
degli Studi di
Teramo
Divisione
Unità di Farmacologia e
Tossicologia Veterinaria
Luoao
Teramo
Università
Unità di Farmacologia e
Tossicologia Veterinaria
Teramo
degli Studi di
Teramo
Posizione
PhD
dall'anno
all'anno
2001
2004
2005
2011
Ricercatore
B.B.2 Riconoscimenti
B.B.2.1 Official H index
6
B.B.2.2 Premi e riconoscimenti
2000 Laurea con lode in Medicina Veterinaria presso l'Università di Teramo.
2004 Dottorato di Ricerca in Farmacologia e Tossicologia Veterinaria presso l'Università di Napoli.
2005 Ricercatore in Farmacologia e Tossicologia Veterinaria, Università degli Studi di Teramo.
2008 Ricercatore Confermato in Farmacologia e Tossicologia Veterinaria, Università degli Studi di
Teramo.
Altre informazioni CV
1998-2000 Ricerca in microbiologia degli alimenti nel gruppo del Prof A. lanieri, presso l'Università di
Teramo.
2003 Dottorato di Ricerca in ecotossicology e tecniche di biosaggio, sotto la supervisione del Dr. E.
HIS laboratori "Environnement Ressources" IFREMER, Arcachon (Francia).
2004-2011 Insegnamento in: Tossicologia dei residui nei prodotti di origine animale - Valutazione dei
Rischi; Farmacologia Veterinaria, Farmacologia Veterinaria e Farmaceutica presso l'Università di
Teramo.
2005-2011 Reviewer per riviste internazionali: Environment International, Environmental Pollution,
Meat Science, Estuarine, Coastal and Shelf Science, Fresenius Environmental Bulletin, Journal of
Agricultural, Food Chemistry, Chemosphere, Biological Trace Element Research, Environmental
",')"''''~~'"'~\'~~;~A':'~
(1:;.~
~ ,-
~"ifti{'::
Science and Pollution Research, Food and Chemical Toxicoiogy, Journal of Food Nutrition\;~d
Research, Polish Journal of Environmental Studies.
Dalla fine del 2000 l'attività di ricerca si è concentrata sulla tossicologia, ecotossicology e chimica
analitica con particolare interesse alla presenza di contaminanti organici negii alimenti e
nell'ambiente.
Autore o co-autore di 57 pubblicazioni scientifiche di cui 18 su riviste scientifiche internazionali e 30 in
atti di congressi internazionali o nazionali. Autore di 7 capitoli di libri internazionali e di 1 capitolo di un
libro italiano medicina veterinaria.
Esperto in chimica analitica: sviluppo e validazione di metodi mediante tecniche PLE e SPE di
preparazione del campione e GC-MS eHPLC per l'analisi strumentale.
Esperta in ecotossicology: tecniche di biotest ambientali. Studi di tossicità dei composti organici
persistenti usando ostriche e larve di ricci di mare.
Esperto in farmacologia: valutazione in vi/m di composti che alterano la funzione della muscolatura
liscia del tessuto bronchiale di cavalli affetti da malattie polmonari ostruttive. Valutazione i/1 vitro della
risposta contrattile di strisce intestinali di trote alla serotonina e all'istamina e l'effetto della
degranulazione degli eosinofili.
La formazione continua viene effettuata partecipando a numerosi workshop e seminari nel campo
della tossicologia alimentare e la sicurezza alimentare ed a conferenze nazionali ed internazionali.
Partner in Programmi di Ricerca di Rilevante Interesse Nazionale (PRIN) nel 2002.
B Sketch biografici
dei collaboratori
Nome
Sa brina Tait
B.A Ruolo nel progetto
Studi tossicologici in vi/m sui PBDE utilizzando linee cellulari umane.
B.B Posizioni e Riconoscimenti
B.B.1 Posizioni
Istituto
Istituto
Superiore di
Sanità
Istituto
Superiore di
Sanità
Divisione
Unità enterobatteri
Unità Alimenti e
Tossicologia
Luoao
Roma
Roma
Posizione
Ricercatore a
contratto
Ricercatore a
contratto
dall'anno
all'anno
2001
2005
2005
2011
.
B.B.2 Riconoscimenti
B.B.2.1 Official H index
3
B.B.2.2 Premi e riconoscimenti
2000 Laurea in Chimica presso l'Università La Sapienza di Roma.
2000 Abilitazione alla professione di chimico. La Sapienza Università di Roma.
2005 Master di Secondo livello con lode in Bioinformatica presso l'Università La Sapienza di Roma.
Altre informazioni CV
2001-2005 Ricerca sul modo d'azione di antivirali naturali e sintetici contro enterovirus, sotto la
supervisione della Dott.ssa Lucia Fiore neil'Unità Enterovirus dell'Istituto Superiore di Sanità
2005-2011 Ricerca sugli effetti ed il modo d'azione degli interferenti endocrini nell'unità di
Tossicologia Alimentare e Veterinaria (diretta dal Dott. Alberto Mantovani) dell'Istituto Superiore di
Sanità
Dalla fine del 2005 l'attività di ricerca è stata incentrata sullo studio degli effetti endocrini sul sistema
riproduttivo e sullo sviluppo, specialmente su organi target quali cervello, placenta e genitali esterni
maschili, in seguito ad esposizione, rispettivamente, al pesticida c1orpirifos, al plasticizzante bisfenolo
A e a differenti miscele di Policloro Bifenili.
Coinvolta, dal 2008, nel progetto PREVIENI finanziato dal Ministero dell'Ambiente, il cui scopo è di
effettuare uno studio dì biomonitoraggio in 4 diverse aree analizzando i livelli serici di alcuni
interferenti endocrini in coppie affette da infertilità, il loro profilo clinico e l'espressione genica di alcuni
biomarcatori di esposizione precoce nei leucociti.
Esperta di tecniche di biologia cellulare e molecolare come elettroforesi, Western Blot, ELISA,
immunocitochimica, PCR e PCR Real-time, sequenziamento del DNA, trasfezione dell'RNA, DNA
ricombinante, Microarray.
La formazione e stata maturata partecipando a numerosi workshop e seminari nel campo della
tossicologia e della sicurezza alimentare, noncM a numerosi congressi nazionali ed intemazionali.
Autrice e co-autrice di numerose pubblicazioni (riviste intemazionali o nazionali e atti di convegni)
sulla ricerca di antivirali (2001-2005) e su tossicologia riproduttiva/dello sviluppo e sicurezza
alimentare (2005-2011).
Coinvolta in numerosi progetti di ricerca del Ministero della Salute (Ricerca Finalizzata), un progetto
ISS-NIH, e progetti Europei del
Programma quadro.
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C. Razionale,obiettivi
ed impatto
C1 Background
Gli eteri difenilici polibromurati (PBOE) sono una classe di sostanze emergenti utilizzate in tutto il
mondo come ritardanti di fiamma nelle apparecchiature elettroniche, nei prodotti tessili, nei mobili ed
in altri svariati prodotti di consumo. Teoricamente 209 sono i possibili congeneri di PBOE, sebbene i
prodotti commerciali siano prevalentemente composti da: penta-BOE (PeBOE), usato in resine
epossidiche o fenoliche, poliesteri, poliuretano espanso e tessuti; octa-BOE (OcBOE), impiegati in
polimeri a base di acrilonitrile-butadiene-stirene, policarbonato e poliestere, deca-BOE (OeBOE)
utilizzato nella maggior parte dei materiali sintetici tra cui prodotti tessili e circuiti stampati in
poliestere[1]. Poiché i PBOE sono aggiunti ai prodotti in forma di additivi anziché essere
chimicamente legati, essi possono essere rilasciati lentamente ed in modo continuo durante la loro
fabbricazione, l'uso e dopo lo smaltimento. Il processo di smaltimento delle plastiche è probabilmente
la principale fonte d'immissione di PBOE nell'ambiente e la loro stabilità chimica fa sì che essi siano
soggetti ad un processo di trasporto globale. I PBOE sono sostanze persistenti caratterizzate da una
scarsa solubilità in acqua, un'alta capacità di legarsi a particelle ed una tendenza ad accumularsi nei
sedimenti. La presenza dei PBOE nel biota è probabilmente strettamente correlata alla loro lipofilicità
e resistenza alla degradazione [1, 2].
E' noto che i congeneri con meno di sette atomi di bromo bioaccumulano più facilmente rispetto ai
PBOE più pesanti, esibendo fattori di biomagnificazione maggiori luingo la catena alimentare. In
generale, i PBOE sembrano causare effetti tossici a basse dosi. L'aspetto più rilevante della tossicità
in vivo dei PBOE é correlata alla funzione tiroidea, con l'induzione di iperplasia tiroidea e alterazione
della produzione di onmoni tiroidei in ratti e topi [3, 4J. Inoltre, i PBOE condividono con i
policlorobifenili coplanari (PCB) e le diossine il meccanismo di induzione del citocromo P450 di alcuni
enzimi epatici, come 1A1, 1A2 e 3A1, mediata dal recettore arilico (AhR) [5, 6]. Svariati congeneri di
PBOE con grado di bromurazione da di ad epta sono in grado, in vitm, di interagire come agonisti o
antagonisti con il recettore Ah in maniera congenere-specifica. Rapporti relativamente recenti
indicano che l'esposizione a basse concentrazioni di queste sostanze chimiche possono causare
danni irreparabili al sistema nervoso e riproduttivo. L'esposizione ai PBOE a concentrazioni
relativamente basse durante le prime fasi di vita può anche portare a ritardi nello sviluppo motorio e
sensoriale, deficit dell'udito, cosi come a cambiamenti nei livelli di attività e nella risposta alle paure
[7]. Un organismo ideale per lo studio dello sviluppo biologico dei vertebrati è lo zebrafish (Oanio
rerio), che ha caratteristiche favorevoli ed è considerato un buon modello per lo studio in vivo delle
alterazioni del sistema endocrino e degli effetti neurocomportamentali grenerati dall'esposizione a
contaminanti ambientali.
Poiché il fegato è uno dei principali organi bersaglio per i PBOE, un modello elettivo per studiare la
tossicità di questi composti, in particolare a livello molecolare, è rappresentato da linee cellulari
epatiche umane. Inoltre, data l'importanza primaria del sistema digerente, in quanto "processatore" di
alimenti, ma anche di contaminanti, l'uso di linee cellulari umane di colon può aiutare ad investigare
ulteriori meccanismi dei PBOE non ancora indagati. Finora non è stato stabilito nessun fattore di
tossicità equivalente (TEF) per i PBOE. È quindi necessario esplorare diversi parametri tossicologici
al fine di stabilire dei valori di TEF per i PBOE necessari per la valutazione del rischio per la salute
umana,
Tra gli alimenti, i pesci e i crostacei, possono contribuire fortemente all'esposizione dell'uomo ai
PBOE, soprattutto se caratterizzati da un elevato contenuto di grassi e cresciuti in aree contaminate
[8). Le cozze possono essere un significativo mezzo di esposizione alimentare perchè sono in grado
di concentrare le sostanze chimiche da 100 a 10000 volte a causa della loro capacità di filtrare grandi
volumi di acqua. Diversi studi sono stati condotti in paesi emergenti come Cina, India e Corea, in
quanto vi si effettua lo smaltimento di quantità massicee di apparecchiature elettroniche, ed anche in
Nord Europa e negli Stati Uniti con lo scopo di determinare i livelli di PBOE nei mitili e nei sedimenti.
Finora, non ci sono dati ancora disponibili riguardo alla contaminazione da PBOE di cozze allevate
lungo le coste italiane e in particolare in un mare chiuso come l'Adriatico.
Per rilevare i PBOE in campioni biologici è necessario raggiungere i livelli del sub-ppb, pertanto è
necessario adottare procedure di analisi molto selettive e caratterizzate da elevata sensibilità. La gascromatografia accoppiata alla spettro metria di massa è la tecnica di elezione impiegata per
analizzare i PBOE. Recentemente, nel campo dei micro-inquinanti, l'uso di sistemi MS/MS è
considerato un valido approccio e consente di minimizzare le interferenze della matrice e raggiungere
limiti di rilevabilità molto bassi con una buona precisione consentendo sufficiente sensibilità e
selettività [9,10).
[1] De Wit, C. 2002. Chemosphere, 46: 583-624.
[2J Alaee, M. 2003. Environment International, 29: 683-689.
[3] Fowles, J.R. 1994. Toxicology, 86: 49-61.
[4] Darnerud, P.O. 1996. Organohalogen Compounds, 29: 316-319.
[5] Meerts, I.A.T.M. 2001. Environmental Health Perspectives, 109: 399-407.
[6J Fery, Y et al. 2009. Toxicology, 264: 45-51.
[7J Branchi, I. 2002. Neuro Toxicity, 23: 375-384.
[8] Domingo, J.L. 2004. Journal of Chromatography A, 105: 321-326.
[9J Covaci, A. 2003. Environment International, 29: 735-156.
[10) Vonderheide, A.P. 2009. Microchemical Journal, 92: 4957.
C2 Obiettivi
L'obiettivo generale di questo progetto inter-disciplinare é quello di migliorare la conoscenza sui
ritardanti di fiamma poli-bromurati, quali i PBDE e la valutazione del rischio per la salute umana e per
la fauna selvatica. Lo sviluppo di nuovi strumenti per la misura e il monitoraggio di PBDE nei mitili
(Mytilus galloprovincialis), nonché la valutazione della loro capacità di bioaccumulo cosi come degli
effetti sul sistema riproduttivo, neurologico, epatico ed enterico in vivo e in vitro, saranno gli obiettivi
principali del progello. A questo scopo, il progello utilizzerà un approccio integrato combinando
tecniche di tipo chimico, cellulare, molecolare ed istologico per cui i partecipanti hanno riconosciuta
esperienza. Integrando le informazioni sull'esposizione, il destino ambientale e la tossicità dei PBDE,
questo progello si propone di fornire un contributo molto significativo ad una valutazione del rischio
per l'uomo e la sicurezza dell'ambiente acquatico. Inoltre, l'integrazione dei dati su base
multidisciplinare servirà a proporre un approccio TEF per la classificazione della tossicità dei PBDE.
C3 Risultati attesi ed impatto
L'obiellivo generale del progello è di fomire informazioni complete sulla diffusione dei PBDE
nell'ambiente acquatico italiano allraverso lo studio della contaminazione delle cozze e di colmare le
lacune di conoscenza sulla loro tossicità. I risultati specifici allesi da questo studio sono:
- lo sviluppo e la validazione di un metodo analitico molto efficiente per la determinazione dei PBDE a
livelli al di sollo del ppb in cozze, pesci e mangimi;
- definire le concentrazioni di fondo e il profilo di contaminazione dei congeneri di PBDE nei mitili
campionati lungo le coste italiane e in particolare nei mare Adriatico;
- consentire un confronto con i livelli ed i pallern dei PBDE riscontrati allivello internazionale;
- indagare le concentrazioni di PBDE in prossimità di specifiche sorgenti puntuali quali scarichi di
impianti di depurazione delle acque, foci dei fiumi, aree industrializzate, ecc;
_ la valutazione di possibili malformazioni, cambiamenti del comportamento e incidenza di morte in
seguito all'esposizione da PBDE durante i primi stadi di vita degli zebrafish, quando i pesci sono di
solito più sensibili all'esposizione ai contaminanti organici.
_ confrontare la tossicità di un congenere a basso grado di bromurazione (BDE-47) con quella di un
congenere altamente bromurato (BDE-209); indagare, inoltre, i possibili effelli additivi/sinergici
esercitati dalla miscela degli allo PBDE indicati dall'EFSA quali più rilevanti per l'esposizione
alimentare;
_ studiare l'effello dell'assunzione del liofilizzato di cozze dal punto di vista degli effetti
tossico/protellivi;
- studiare dal punto di vista istologico fegato, gonadi e tiroide dello zebrafish in seguito ad
esposizione a PBDE;
- identificare nuovi biomarker cellulari di esposizione e/o di effello nello zebrafish quali le cellule rodlet
e gli aggregati di macrofagi (RC e MA);
_ individuare ulteriori, e non ancora investigati, target molecolari e modi di azione dei PBDE, sia nel
fegato che nel colon, in seguito ad esposizione di linee cellulari epatiche (HepG2) ed enteriche (DLD1) analizzandone i rispellivi profili di espressione genica;
- identificare marcatori precoci di effetto su linee cellulari umane di fegato e colon in seguito ad
esposizione sia a PBDE sia a Iiofilizzato di cozze che, quale matrice in toto, rappresenta una reale
assunzione di cibo della dieta umana;
- proporre un metodo per la classificazione della tossicità dei PBDE mediante TEF, integrando i dati
complessivi prodolli dal progetto.
Il progetto fornirà pertanto risultati importanti, che serviranno come base per il miglioramento della
qualità della vita allraverso adeguate azioni di regolamentazione e di gestione.
D ORIGINALITA' DEL PROGETIO
Mentre negli ultimi dieci anni, i PBDE sono stati ampiamente studiati in diversi paesi europei, asiatici
e negli Stati Uniti, in Italia, è stato fatto molto poco e pertanto poche sono le informazioni raccolte sui
livelli di contaminazione ambientale, sull'esposizione alimentare e sugli gli effetti tossico logici di
questi composti. E' risconlrabile una mancanza di informazione sui livelli di contaminazione da PBDE
degli alimenti italiani tanto che nel rapporto dell'EFSA intitolato "Scientific Opinion on Polybrominated
Dlphenyl Ethers (PBDEs) in Food" dello scorso Agosto non sono riportati dati inviati dall'Italia. E'
pertanto necessario migliorare la conoscenza dei pattern e dei livelli di contaminazione da PBDE al
fine di valutare l'esposizione umana e della fauna selvatica e poter fare delle considerazioni in merito
al rischio correlato che in fine potrebbero portare alla definizione di limiti di residui da parte della
Commissione Europea.
Le cozze sono state spesso utilizzate, nel mondo, come organismi sentinella per la valutazione dei
livelli di inquinanti organici persistenti (POP) e di contaminanti inorganici nell'ambiente (Mussel Watch
Projects). Tuttavia, nessuno di questi studi è stato condotto in Italia fino ad ora, in particolare sui
PBDE, pertanto si ritiene che da tale progetto possano emergere risultati molto interessanti. Inoltre le
cozze, oltre ad essere organismi sessili ampiamente impiegate come indicatori per la misurazione
dell'accumulo dei contaminanti, sono principalmente un alimento e quindi il loro esarne può fornire
informazioni importanti sulla possibile esposizione umana ai PBDE in seguito al consumo di mitili. Si
richiedono pertanto procedure analitiche sensibili e specifiche per misurare le concentrazioni a livello
di sub-ppb. La gascromatografia è la tecnica separativa di elezione che, accoppiata con la
spettrometria di massa tandem sta portando alla sostituzione dei più costosi HRGC-HRMS con
metodi in HRGC-MS/MS per l'analisi di microinquinanti in varie matrici ambientali, in quanto fornisce
selettività e sensibilità comparabili. Verrà sviluppato un metodo analitico in GC-MS/MS facilmente
accessibile e meno costoso (triplo quadrupolo) dei metodi in massa ad alta risoluzione per la
determinazione di PBDE nel pesce, nelle cozze e nei mangimi ed in fine verrà redatta una procedura
operativa standard validata (SOP).
Il profilo tossicologico di molti PBDE è troppo incompleto e insufficiente per eseguire un'adeguata
valutazione del rischio umano ed ecotossicologico. In questo progetto gli studi sugli zebrafish
saranno effettuati proprio per migliorare la comprensione degli effetti tossici e dei potenziali rischi per
la salute a causa dell'esposizione ai PBDE studiando, in particolare, le malformazioni ed i
cambiamenti di comportamento durante i primi stadi della vita, così come le modifiche istologiche
delle gonadi, del fegato e della tiroide. L'analisi che segue l'esposizione ai PBDE singoli, quali BDE47 e BDE-209 ed alla miscela degli 8 congeneri più rilevanti individuati daIl'EFSA, contribuirà anche
ad indagare meglio I possibili effetti additivi/sinergici. Poichè questi PBDE vengono introdotti
nell'ambiente sotto forma di miscele complesse, l'identificazione di possibili meccanismi biologici e
tossicologici di tipo stnuttura-attività correlati è di grande importanza per la comprensione della
tossicità delle miscele di questo gnuppo di sostanze chimiche. Inoltre, vi sono molte poche
informazioni riguardo a possibili marcatori biologici e tossicologici per bassi livelli di esposizione ai
PBDE ed in questo contesto, l'uso di cellule rodlet (RC) e aggregati di macrofagi (AG) può
rappresentare un approccio innovativo e in qualche modo interessante. Particolare attenzione sarà
posta nell'associazione di questi marcatori con eventuali segni di degenerazione parafisiologica o
patologica del fegato, della tiroide o delle gonadi indotta da esposizione cronica a PBDE. In
particolare, parametri numerici e/o morfo-densitometrici relativi a MAs, quali media, moda, minimi e
massimi iivelli di grigio, area, perimetro, circolarità e dimensioni frattali saranno correlati al tempo di
esposizione a PBDE. Finora il modo d'azione dei PBDE, analogamente a diossine e PCB diossinasimili, è stato principalmente correlato alla loro interazione con il recettore AhR e con la conseguente
induzione di enzimi epatici importanti quali i citocromo P450 di fase I, in particolare quelli appartenenti
alle famiglie 1A 1, 1AZ e 3A 1. Altri meccanismi a livello epatico sono stati poco studiati mentre gli
effetti su altri organi del sistema digerente non sono stati considerati affatto, nonostante l'importanza
del sistema epatico nella trasformazione di alimenti e contaminanti. Pertanto, una valutazione
completa dei possibili effetti a livello molecolare su questi organi è consigliabile e verrà effettuata
all'interno di questo progetto utilizzando due modelli cellulari umani di fegato e colon. Queste linee
cellulari saranno esposte al BDE-47, al BDE-209, così come ad una miscela degli otto congeneri
indicati dail'EFSA quali più rilevanti a concentrazioni ambientali confrontabili con quelle determinate
nei campioni di mitili. Questo aspetto è fondamentale al fine di simulare uno scenario reale di
esposizione. Inoltre, entrambe le linee cellulari saranno esposte anche ai liofilizzati di cozze per
confrontare gli effetti dei PBDE come composti purificati o, utilizzando la matrice in toto, all'interno
della matrice in cui possono essere presenti potenziali fattori protettivi. L'analisi dei profili di
espressione genica di questi campioni evidenzierà bersagli molecolari ancora non indagati,
..
conlribuendo inollre a definire possibili biomarcalori di esposizione precoci dei PSDE in due principali
organi bersaglio.
I risullali di queslo sludio colmeranno le lacune nella conoscenza dell'esposizione umana a PSDE e,
. in fuluro, potranno essere uliiizzali in combinazione con i dati lossicologici emergenli per delerminare
gli slandard sanilari.
E Metodologia
E1 Study Design
li progello prevede lo studio analitico dei PSDE nelle cozze e successivamenle, una volla noli i livelli
di conlaminazione nalurali, lo sludio della tossicilà in vivo (zebrafish) e in vi/m (linee celluiari umane).
Il progello sarà suddiviso in due Work Packages (WP), uno di lipo anaiilico ed uno tossico logico e
selle fasi (P).
WP1: sludi analitici
P1 (1-12 mesi): sviluppo e validazione di un melodo GC-MS (MS/MS) per l'analisi degli olio
congeneri di PSDE considerali dall'EFSA di interesse primario (8- congeneri-EFSA: BDE-28, -47, -99,
-100, -153, -154, -183 e -209). Elaborazione di una procedura operaliva slandard (SOP).
P2 (6-18 mesi): raccolla dei campioni di cozze dalla cosla Adriartica e preparazione dei campioni.
P3 (12-18 mesi): analisi di campioni di mitili e valutazione dei livelli di conlaminazione.
P5 (18-32 mesi): quanlifica dei singoli PSDE nei mangimi e nei lessuli di zebrafish (lrattali e non
lrallali), a seguilo di esposizione a PSDE nell'ambito di esperimenli lossicogici.
P7 (32-36 mesi): Elaborazione dei risullali e diffusione.
WP2: sludi lossicologici.
P4 (18-32 mesi): sludi lossicologici in vivo usando gli zebrafish come modello. Esposizione degli
zebrafish a livelli rilevanli dal punlo di visla alimenlare di PBDE singoli (BDE-47 e BDE-209), in
miscela di PBDE (8-EFSA congeneri) e medianle liofilizzali di cozze attraverso la dieta. Valulazione
degli effetti al livello endocrino e neuro-comportamenlale, valutazione delle modifiche istologiche ed
idenlificazione di biomarcalori cellulari.
P6 (18-32 mesi): sludi lossicologici ulilizzando due modelli in vi/m: linee cellulari di epalo carcinoma
umano (HepG2) e adenocarcinoma colorellale umano (DLD-1). Esposizione delle cellule a livelli
rilevanli dal punlo di visla alimenlare di PBDE singoli (BDE-47 e BDE-209), di PBDE in miscela (8congeneri-EFSA) e PBDE conlenuli in cozze liofilizzale. Valulazione degli effelli medianle sludio del
profilo dell'espressione genica.
P7 (32-36): Elaborazione dei risullati e diffusione.
E2 Dati Preliminari
Il gruppo di lavoro non ha ancora mai lavoralo sulla valutazione della contaminazione da PBDE nelle
cozze e non sono mai slati effettuali sludi lossicologici in vivo ed in vi/m sui PBDE, ma ha una
consolidala esperienza sui PCB, che condividono con i PBDE alcune caralleristiche slrutturali e
lossicologiche. Nel 2003-2004 l'IZS Umbria e Marche è slalo coinvolto in un sondaggio sui PCB nei
milili dalle Marche [11). Diciotto congeneri di PCB sono stali misurali per slimare i livelli e pattern di
contaminazione le da PCB. Il congenere predominanle è sempre slalo il H6CB-153 seguilo da H6CB138. Essi, insieme, tenevano conIo del 35-40% della contaminazione da PCB totali in tulli i punti di
prelievo. Gli effelli di tre miscele di PCS, una diossina-simili e due PCB non-diossina-simili, sono stati
valutati su un modello cellulare umano per quanlo riguarda lo sviluppo felale di genilali eslerni
maschili [12]. Le cellule trallale sono slale analizzate per i loro profili di espressione genica: le Ire
miscele hanno modulalo pallern differenti di geni, evidenziando inollre che le due miscele
ufficialmenle classificale come PCB non-diossina-simili, in reallà hanno diverse modalilà di azione. I
risullati suggeriscono che la classificazione ufficiale dei PCB può essere rivista tenendo conIo di
differenli modalilà di azione all'inlemo dei PCS non-diossina-simili.
E3 Bibliographic Data
Relativamenle scarsi sono i dali disponibili sulla contaminazione da PBDE nei milili nel Mar
Medilerraneo. Nelle cozze (Mitylus edulis) prelevate lungo la costa francese i tre congeneri prevalenti
erano i SDE 47,99 e 100 [13J. Nei Mitylus edulis raccolti in Corea si risconlra un pallern simile con il
BDE-47, dominante, seguilo da -99 e 100 [14). Nei M. edulis prelevati nel mare di So (Cina), il BDE209 è quello che presenla le concentrazioni più elevate [15]. Non sono stati reperili dati sulla
contaminazione delle cozze prelevate lungo le cosle italiane. Solo pochi studi si sono occupati degli
effetti dei PBDE sullo sviluppo, la riproduzione o il neurocomportamenlo di zebrafish. Mancano dali di
esposizione cronica a lungo lermine a dosi relalivamenle basse e poche sono le infonmazioni
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disponibili sulla valutazione degli effetti tossici a seguito di esposizione a singoli con'g~~,~ridi PBlDE~
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HepG2 sono largamente utilizzate, nella comunità scientifica. per lo studio degli effetti Js!,S.Sico,logiei/
sul fegato. Tuttavia, per quanto riguarda i PBDE sono state studiate su questa linea cellulare 'sol6le
interazioni con il recettore Ah e l'attivazione di enzimi del citocromo P450 [16]. Meccanismi paralleli,
come il danno ossidativo [17] o l'interazione con il recettore X Pregnane [18] sono state poco
studiate, mentre altre possibili modalità di azione. come le interazioni con altri recettori nucleari, non
sono state studiate affatto. Non sono disponibili dati sulle cellule DLD-1, come modelli in vitro del
colon. Non sono stati effettuati profili di espressione genica su entrambe le linee cellulari a seguito di
trattamenti con PBDE a concentrazioni ambientali rilevanti.
[11] Piersanti, A. 2006, Organohalogen Compound, 68:1951-1954.
[12] Tait, S. et al,. 2011. Reproductive Toxicology. 32:1-14.
[13J Johansson, L 2006, Chemosphere, 64: 296305.
[14] Ramu, K. 2007. Chemosphere, 148: 562-569.
[15] Zhen Wang. 2009. Chemosphere, 74: 896901.
[16] An, J et al. 2011, Environmental Toxlcology, 26(6):591-599.
[17] Fery, Y et al. 2009. Toxicology, 264(1-2):45-51[18] Lundgren, M. et al, 2009. Toxicol Lett, 184(2): 107-113.
E4 Metodologia
di lavoro
Determinazioni analitiche.
Sviluppo Metodi.
L'attenzione verra concentrata sull'analisi dei citati 8-congeneri-EFSA di PBDE a livelli di sub-ppb. I
campioni saranno liofilizzati e poi i contaminanti estratti utilizzando la tecnica PLE (Pressurized Liquid
Extraction). Il clean-up verrà effettuato con tecniche tipo SPE (estrazione in fase solida) e GPC
(cromatografia di permeazione su gel). I metodi di analisi saranno sviluppati seguendo i criteri di
rendimento riportati nel regolamento 1883/2006/EC per quanto riguarda i PCB diossina-simili e le
diossine, nonché i principi della chimica verde.
Validazione dei Metodi
I metodi di analisi saranno validali in matrici come cozze, tessuto di pesce e mangimi per valutare le
performance del metodo: precisione (ripetibilità e riproducibilità intralaboratorio), esattezza; limite di
rivelazione (LOD), limite di quantificazione (LOQ), specificità, robustezza ed incertezza di misura. Il
piano di validazione comporterà esperimenti ripetuti a diversi livelli di contaminazione nel campo di
misura.
Campionamento cozze.
La raccolta sarà effettuata in più di venti punti di campionamento classificati lungo la costa
marchigiana nell'ambito dei piani di monitoraggio per il controllo delle acque per la molluschicoltura
secondo i regolamenti 853/2004/CE e 854/2004/CE. Ogni punto sarà campionato per cinque volte nel
corso di ogni campagna di campionamento e due saranno le campagne che avranno luogo in un
anno: una volta prima della fase riproduttiva e una seconda volta dopo la riproduzione. Ogni
campione sarà costituito da esemplari delle stesse dimensioni (presumibilmente della stessa età)
selezionati sulla base della lunghezza del guscio.
Analisi dei PBDE
Le concentrazioni di PBDE saranno misurate nei mitili campionati, nei mangimi commerciali. negli
alimenti per animali contaminati e nei liofilizzati di cozze utilizzati come fonte di esposizione per le
prove tossicologiche. I tessuti degli zebrafish verranno inoltre analizzati prima, durante e dopo
l'esposizione alimentare ai PBDE. Tutte le analisi saranno effettuate in batch contestualmente ai
controlli qualità,
T est tossicologici in vivo.
Animali
L'esposizione a PBDE verrà effettuata utilizzando lo zebrafish (Danio rerio),così come raccomandato
dall'Organizzazione per la cooperazione e lo sviluppo economico (OCSE). Gli zebrafish wild-type
adulti, verrano acquistati da una fonte commerciale e mantenuti in un ambiente di laboratorio per un
mese prima di allevarli. Embrioni e larve saranno ottenuti mediante accoppiamento naturale in
vasche di riproduzione e allevati in condizioni ottimali.
Disegno sperimentale
I test dureranno 240 giomi dopo la schiusa (DPH). Da 4 a 20 DPH le larve saranno alimentate con
polvere di pesce commerciale. L'esposizione avrà inizio dal 20 DPH e 1 mese dopo l'esposizione
verrà effettuato il test comportamentale. I pesci saranno sacrificati e analizzati ad intervalli di tempo
fissi (lO (20dph), t 30 (50dph), t 70 (90dph), t 220 (240dph)). Per le diete trattate con i PBOE, i
congeneri BOE 47, BOE 209 nonché la miscela dei PBDE, verranno aggiunti al mangime formulato
commerciale. Per ogni PBOE saranno allestite tre prove: un gruppo nutrito con mangimi non trattati
(controlli), un secondo alimentato con mangimi contaminali da PBOE (lrattati) e un terzo gruppo
alimentalo con mangimi contaminati dal solvenle impiegalo per preparare la soluzione dei PBOE
(controllo solvente). Le concenlrazioni di PBOE nel mangime sarà vicino alla concentrazione mediana
misurala nei mitili nel WP1. Un allro gruppo di zebrafish sarà alimentalo con i Iiofilizzati di milili
raccolti durante la campagna di campionamento.
Preparazione islologica e analisi della gametogenesi
Il fegato dei pesci verrà campionalo in tutti gli esemplari, secondo il disegno sperimentale, e
processato mediante microscopia ottica e TEM. Analisi quali-quantilativa di RC e MA verrà effettuata
per tutto il periodo di trattamento ad intervalli di tempo fissi (lO, t30, t70, 1220). Inoltre, gonadi e tiroide
saranno sottoposti a scansione per eventuali patologie e valutati per il loro sviluppo.
Test tossico logici in vitro
Colture cellulari e trattamenli
Le linee cellulari umane di epatocarcinoma (HepG2) e di adenocarcinoma colorettale (OLO-1)
verranno coltivate in terreno RPMI1640 senza rosso fenolo, con il 10% di siero fetale bovino, 2mMIglutammina, 100U/mi di penicillina e 100g/mi di streptomicina. Le cellule saranno mantenule a 3rC
in ambiente di COz al 5%. IIliofilizzao di cozze verrà ricostituito e filtrato per ottenere soluzioni sterili.
Cozze e standard di PBOE verranno adeguatamente diluiti nel terreno di coltura. Entrambe le linee
cellulari verranno esposte al BOE-47, BOE-209, alla miscela degli B-PBOE, al liofilizzato di cozze
ricostituito, o al solo terreno come controllo. Le concentrazioni di PBOE utilizzate saranno quelle
rilevate nei mitili Italiani. I trattamenti saranno effettuati in triplicato, per 72 ore al fine di simulare una
esposizione cronica. Le cellule saranno quindi trlpsinizzate, raccolte, addizionate di un tampone di lisi
per prevenire la degradazione dell'RNA e conservale a -80°C.
Estrazione dell'RNA e analisi microarray.
Da ogni campione sarà estratto i'RNA totale. SI effettuerà l'analisi dei profili di espressione genica
utilizzando i microarray Agilent contenenti - 40,000 geni rappresentativi dell'intero genoma umano.
Gli esperimenti saranno eseguiti seguendo un protocollo dye-swap (inversione dei fluorofori).
Controllo e campioni trattati saranno co-ibridati sui vetrini microarray e incubati a 65°C per 17h in un
incubatore rotante. I vetrini saranno Ietti per la loro fluorescenza in uno scanner Agilent. I dati
analizzati mediante strumenti di bioinformatica per determinare l'elenco dei geni differenzialmente
espressi, nonché le pathway ed i nelwork molecolari indicanti le interrelazioni tra gruppi di geni
modulati.
Real-Time PCR
I risuitati di microarray verranno validati eseguendo Real-time PCR su un sottoinsieme di geni
modulati. Le reazioni saranno effettuate su campioni dì RNA retrotrascritto a cONA in presenza di
prlmer specifici. Gli esperimenti saranno eseguiti in doppio su uno strumento termociclatore
Stratagene MX5005P. I risultati verranno analizzati per la loro significatività statisllca con il software
JMP 7.0
ES Possibili Punti Critici
Il primo punto critico potrebbe essere la raccolta in invemo a causa delle condizioni atmosferiche
sfavorevoli. Per evitare la mancanza di campioni singoli raccoglieremo cozze in un intervallo di 20
giorni. Il secondo punto critico potrebbe essere la mortalità zebrafish durante la prima fase
dell'allevamento. Per questa ragione, abbiamo deciso di awiare i testi di esposizione dal 20 OPH,
quando la soprawivenza larvale é più stabile. Un problema critico negli esperimenti in vitro
tossicologici può essere la filtrazione e la solubilizzazione ad una diluizione appropriata delliofilizzato
di cozze, al fine di utilizzarlo per i trattamenti delle cellule. Verrà utilizzata la stessa procedura
utilizzata nel Nelwork di eccellenza europeo CASCAOE (ISS come partner) ed applicata agli alimenti
per l'infanzia.
E6 Milestones
Milestone (M)
M1 (12° mese): SOP per l'analisi dei congeneri di P BOE nei tessuti dei pesci, nei mangimi e nelle
cozze; inizio della campagna di campionamento, analisi e risultati preliminari.
M2 (18°mese): fine della campagna di raccolta, ana lisi e risultati; inizio degli studi tossicologici in vivo
e in vitra; relazione di metà progetto.
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M3 (24 "mese): risullati preliminari degli studi t ossicologici in vivo ed in vitro sui PBDE:- -' ....
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M4 (32 "mese): risultati definitivi degli studi to ssicologici in vivo ed in vi/ro;
M5 (36" mese): relazione finale del progello; diffu sione dei risultati mediante pubblicazione .~ ...
presentazione dei risultati a congressi in forma di comunicazioni orali o posters.
F TOOLS: Stumenti e Collaborazioni
L'Istituzione che gestisce e coordina le allività del progello è lo Zooprofilallico Sperimentale
dell'Umbria e delle Marche (IZS-UM), un ente dello stato italiano che si occupa di veterinaria, fondato
nel 1936 e che opera nell'ambito del Sistema Sanitario Nazionale. L'IZS-UM è parte di una rete di
dieci istituzioni simili operanti in altre regioni del territorio nazionale. I campi d'interesse sono
principalmente la salute animale e la sicurezza alimentare nell'ambito delle quali vengono coinvolte in
collaborazione sinergica competenze diverse: veterinario, chimico, biologico, biotecnologico,
epidemiologo ecc ... L'IZS-UM oltre a molte allre strutture ha all'interno dei laboratori che si occupano
di chimica analitica applicata alla analisi dei prodotti alimentari e che effettuano controlli per quanto
riguarda i farmaci, i residui di anabolizzanti, gli inquinanti organici persistenti, i pesticidi, ie
micotossine, le biotossine, i contaminanti inorganici e cosi via in mangimi ed in alimenti di origine
animale. I laboratori di chimica hanno a disposizione attrezzature abbastanza avanzate, sia nel
campo della preparazione del campione che nella determinazione analitica strumentale: Accelerated
Solvent Estractors (ASE), sistemi di cromatografia di permeazione su gel (GPC), forni a microonde,
sistemi automatici per l'estrazione in fase solida (SPE) e diluitori automatici. Gli strumenti di analisi
disponibili nei aboratori dell'IZSUM sono: sistemi di gascromatografia (GC) con rivelatori selettivi
come rivelatori a cattura di elettroni (ECD), rivelatori ad azoto fosforo (NPD), rivelatori di ionizzazione
di fiamma (FID), spettrometri di massa a quadrupolo singolo o a trappola ionica (MS); sistemi di
cromatografia liquida (HPLC) con rilevatori a serie di diodi (DAD), a fiuorescenza e triplo quadrupolo.
Per la determinazione dei contaminanti inorganici l'IZS-UM ha un Inducted Coupled Plasma MS (ICPMS). I ricercatori che lavorano presso l'istituto sono tutti ben qualificati nell'ambito dei sellori
d'interesse ed accanto ai controlli ufficiali effettuati per verificare il rispetto dei limiti massimi di residui
in campioni di alimenti prelevati nell'ambito di piani ufficiali di controllo, la ricerca rappresenta uno dei
principali obiettivi, pertanto i ricercatori hanno anche esperienza nella gestione di progetti di ricerca.
La rete italiana degli Isituti Zooprofilattici Sperimentali offre la possibilità di un efficace scambio di
esperienze e competenze tra i dieci istituti. Inoltre, la collaborazione scientifica e sperimentale
coinvolge molte altre organizzazioni, tra cui università, CNR, ISS, centri di ricerca e laboratori di
riferimento. Nel reparto di Ancona deIl'IZS-UM è stato riconosciuto nel 2003 dal Ministero della
Salute, il laboratorio nazionale di riferimento per il controllo biologico e chimico dei molluschi bivalvi e
quindi molto lavoro viene svolto nell'ambito del controllo chimico e batteriologico dei molluschi bivalvi
(Gazzetta Ufficiale della Repubblica Italiana N. 81 del 07 Aprile 2003). I laboratori di Ancona dell'IZSUM sono coinvolli anche nella classificazione e nel monitoraggio delle zone in cui è autorizzata la
raccolta di cozze e vongole per uso commerciale.
Il progetto prevede la collaborazione di ricercatori esperti in tossicologia ed anatomia patologia della
facoltà di medicina veterinaria dell'Università degli Studi di Teramo e di ricercatori dell'Istituto
Superiore di Sanità (ISS), esperti in sicurezza alimentare e nella valutazione del rischio correlata alla
esposizione ad interferenti endocrini mediante studi tossicologici in vitro. Il gruppo di Teramo è
costituito da ricercatori veterinari con competenze in farmacologia, tossicologia, anatomia patologica
ed ;stologia come si può rilevare dalle numerose pubblicazioni su riviste indicizzate e di impatto. Il
coinvolgimento nel progetto di ricercatori esperti in differenti discipline scientifiche garantisce un
approccio multidisciplinare. Il contributo del groppo di Teramo riguarda la pianificazione e lo
svolgimento di studi di tossicità cronica su pesci, nello studio della patologia tossico logica e
nelll'identificazione di biomarcatori cellulari di effetto. Il gruppo di Teramo ha laboratori che operano
nel campo della biologia, tossicologia, medicina e anatomia patologica veterinaria, essi sono ben
attrezzati per effelluare esperimenti tossicologici in vivo. L'ISS è la principale istituzione del Sistema
Sanitario Nazionale in materia di salute umana. Tra i servizi all'interno della ISS, il Dipartimento di
Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare è particolarmente coinvolto nella valutazione dei
rischi chimici e microbiologici negli alimenti e negli alimenti ad uso zootecnico essendo anche il
National Focal Point dell'Agenzia Europea per la Sicurezza Alimentare (EFSA). In particolare, i
ricercatori dell'Unità di Tossicologia Alimentare Veterinaria concentrano le loro attività nella
valutazione dei potenziali effetti negativi sulla salute dell'esposizione umana a una serie di composti
che agiscono come interferenti endocrini. Il laboratorio è attrezzato per eseguire esperimenti di analisi
cellulare e molecolare; è anche in possesso di strumentazioni costose per effettuare microarray e
Real-time peR.
G RELEVANZA E IMPATTO PER IL SISTEMA SANITARIO NAZIONALE (SSN)
La Commissione europea (CE), come già detto, ha chiesto all'Agenzia Europea per la Sicurezza
Alimentare (EFSA) di fornire un parere scientifico sulla presenza dei PBDE negli alimenti e nel mese
di agosto 2011 il gruppo di esperti sui sui contaminanti nella catena alimentare (CONTAM) ha
pubblicato un parere scientifico sulla presenza di Polibromodlifenileteri (PBDE) nel prodotti alimentari
[19J. Seguendo i consigli del gruppo di esperti CONTAM, è stato effettuato un programma di
monitoraggio a partire dal 2006. Sono stati forniti all'EFSA i risultati ottenuti dall'analisi di 19
congeneri di PBDE in 3.971 campioni di alimenti da undici paesi europei dal 2001 al 2009. Non sono
stati presentati dati dall'Italia a causa della mancanza di infonmazioni: il livello di contaminazione da
PBDE negli alimenti è stato fino ad oggi, poco studiato in Italia. Inoltre, tra gli otto congeneri di PBDE
(BDE-28, -47, -99, -100, -153, -154, -183 e -209) considerati di interesse primario per l'esposizione
alimentare, dati sulla tossicltà erano disponibili solo per BDE-47, -99, -153 e -209, quindi, la
valutazione del rischio potrebbe essere effettuata esclusivamnete per loro. Il parere scientifico
dell'EFSA raccomanda di continuare la sorveglianza dei PBDE e di effettuare ulteriori studi
tossicologlci tenendo conto dei congeneri più importanti per l'esposizione umana. La CE sta
attualmente esaminando la possibilità di definire dei limiti massimi di residui per questi inquinanti.
Non si è ancora arrivati alla definizione da parte dell'autorità europea di una dose tollerabile (dose
giornaliera ammissibile o settimanale, TDI I TWI) per I PBDE nell'ambito della sicurezza alimentare,
in quanto non sono ancora disponibili Informazioni sufficienti sulla loro tossicità e la loro presenza
negli alimenti.
È, pertanto, necessario conoscere meglio I livelli di contaminazione da PBDE nell'ambiente italiano e
in matrici alimentari, nonché approfondire la valutazione tossicologica di questi contaminanti
emergenti. È un dato di fatto, senza una conoscenza approfondita dei livelli di contaminazione da
PBDE non è possibile fare una valutazione del rischio per la popolazione italiana. Lo studio di mitili
come organismi sentinella può essere di grande aiuto nello studio dell'ambiente acquatico.
Questo progetto darà un grande contributo nella definizione dei livelli di contaminazione da PBDE in
organismi sentinella primari come le cozze del Mare Adriatico. Inoltre, verra fornito un contributo
rilevante nell'Indagine dei potenziali effetti negativi dei PBDE sulla salute umana e sulla fauna
selvatica mediante studi tossicologlci in vivo ed in vitro. Uno strumento prezioso per discriminare tra i
PBDE la tossicità potenziale e relativa, potrebbe essere la creazione di parametri tossicologici per
definire una scala di Fattori di Tossicità Equivalente (TEF) per i vari congeneri. L'approccio TEF è di
grande importanza nella valutazione del rischio di contaminanti chimici ed è uno strumento molto utile
a livello normativo, ma è disponibile solo per alcune classi di sostanze (diossine e composti diosslnasimili). Questo studio interdisclplinare, che fornirà informazioni riguardo all'esposizione, dati
tossicologici ed infomnazioni sui meccanismi d'azione può dawero servire come base per la
definizione di una scala di TEF.
[19] Scientific Opinion of EFSA panel on Polybrominated Dlphenyl Ethers (PBDEs) in Food.
H:COMPLIANCE WITH THE CALL OBJECTVES Ves or No yes
Reasons
Il presente progetto ha a che fare con lo sviluppo di nuovi metodi analitici affidabili per l'analisi del
PBDE, con la misura della loro concentrazione nei mitill per comprendere la loro capacità di
accumulo e con l'indagine delle loro proprietà tosslcologiche in vivo ed in vitro.
ATTESTATO DI PUBBLICAZIONE
Delibera del Direttore Generale
nO:
295
del
22/11/2012
Il presente ver,bale di delib~};aviene pubblicato all'albo pretorio dell'Istituto
il giorno :1
I \\\'00
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Perugia,
2 2 MCV. 2012
Z 2. HOV. 2012
ESECUTIVITA' conseguita il
ai sensi della deliberazione del Consiglio di Amministrazione n. 6 del 24//03/2010.
Attestato di conformità all' originale
La presente copia è conforme all'originale esistente presso l'ufficio
composta da nO
pagine.
Il Dirigente:
_
Trasmissione delibera:
Collegio dei Revisori
Registrato a p. n. 15
del Registro n. 9 delle deliberazioni del Direttore Generale.
I Inviata alla Corte dei Conti il
_