Studio della metabolismo
ossidativo della Dopamina
Neuromelanin formation
LOCALIZZAZIONE ATTIVITA’ DOPAMINO
PEROSSIDASICA IN CERVELLO DI RATTO
E UMANO
*
*
*
Studio in vitro della formazione del
dopaminocromo
• La formazione di dopaminocromo è catalizzata
in maniera simile da perossidasi purificate
(lattoperossidasi, mieloperossidasi, perossidasi
di rafano) e da una frazione di cervello di ratto,
in presenza di perossido d’idrogeno.
• La formazione di un intermedio radicalico,
dopamino-o-semichinone, è comune nelle
reazioni
catalizzate
da
ciascuna
delle
perossidasi e dalla frazione di cervello di ratto.
(Galzigna et al. Biochim Biophys Acta 1999)
Preparation of protein mixture:
Procedures
striato
s.nigra
The midbrain fractions were
homogenized and centrifuged.
The supernatant, obtained after
two successive centrifugations,
was
spectrophotometrically
assayed for enzymatic activity.
Assay of peroxidizing activity
0,6
0,4
0,2
Time [s]
60
0
54
0
48
0
42
0
36
0
30
0
24
0
18
0
60
12
0
0
0
Abs [475 nm]
1
0,8
Dopamine peroxidizing activity was in
vitro followed
spectrophometrically,
as increasing absorbance at 475nm,
corresponding to the peak of maximum
absorption
of
the
dopaminochrome
formed from dopamine and hydrogen
peroxyde.
Come si determina l’attività
enzimatica
• Attività enzimatica
A
c / min 
 d
• ΔA475 rappresenta la variazione di assorbanza
misurata a 475 nm;
• ε è il coefficiente di estinzione molare del
substrato cromoforo = 1175 M-1cm-1
• La determinazione è stata effettuata in un il
volume totale della miscela (omogenato e
tampone di lettura) di 10-3 L (Galzigna et al.,
1999)
ATTIVITA’ DOPAMINO PEROSSIDASICA IN MESENCEFALO E GANGLI DELLA BASE DA
REPERTI AUTOPTICI PARKINSONIANI E CONTROLLI
controlli
pazienti parkinsoniani
attività dopamino
perossidasica
(micromol/min/mg protein)
1000
**
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
mesencefalo
gangli della base
Attività dopamino perossidasica in mesencefalo
Controlli (media dei valori) = 249 (SD+/-191) mmol dopaminocromo/min/mg proteina
PD (media dei valori)
= 789 (SD+/-149) mmol dopaminocromo/min/mg proteina
Attività dopamino perossidasica nei gangli della base
Controlli (media dei valori) = 0 mmol dopaminocromo/min/mg proteina
PD (media dei valori)
= 529 mmol dopaminocromo/min/mg proteina
*Significativamente differente dai controlli,
p<0,001 con t di Student
CONCENTRAZIONE DELLE CATECOLAMINE IN MESENCEFALO E GANGLI DELLA BASE
controlli
concentrazione catecolamine
(nmol/L)
pazienti parkinsonian
180
150
120
90
60
30
0
*
DA
midbrain
A + NA
A+NA
DA
gangli della base
Cconcentrazione della dopamina nel mesencefalo
Ccontrolli (media dei valori) = 62 nmol/L (SD+/-37)
PD (media dei valori)
= 31 nmol/L (SD+/-26)
Cconcentrazione della dopamina nei gangli della base
Ccontrolli (media dei valori) = 59 nmol/L (SD+/-35)
PD (media dei valori)
= 43 nmol/L (SD+/-22)
*Significativamente differenti dal controllo : p< 0.05 con t di Student.
PROCEDURE
ELETTROFORETICHE
Procedure elettroforetiche
• Gel di poliacrilamide non denaturante: è
utilizzato per il frazionamento di miscele
proteiche che mantengono la loro
conformazione nativa.
• Esso non permette di distinguere gli effetti delle
dimensioni, della struttura e della carica elettrica
netta di ciascuna proteina sulla mobilità
elettroforetica.
• E’ utilizzato soprattutto quando si voglia studiare
l’attività biologica di una proteina.
Procedure elettroforetiche
• Gel di poliacrilamide denaturante in presenza di sodio dodecilsolfato
(SDS-PAGE).
• Prevede la denaturazione delle miscele proteiche al calore e il
trattamento con agenti riducenti (2-α-mercaptoetanolo), che rompe i
ponti disolfuri intra ed intercatena, causando lo “srotolamento” della
struttura ripiegata della catena. La presenza dell’SDS assicura
prolungata denaturazione, rompendo i legami covalenti, e,
avvolgendo la proteina, le conferisce carica negativa,
indipendentemente dalla sua carica netta.
• Tutte le proteine della miscela migrano verso l’anodo, risolte in
bande discrete, con una velocità inversamente proporzionale al
logaritmo del loro peso molecolare.
• Si attribuisce peso molecolare alle bande discrete mediante
confronto della loro mobilità elettroforetica con quella di alcune
proteine a peso molecolare noto
Separation of protein mixture
Protein
mixtures
of
midbrain
tissues
homogenates from four different specimens
were
separated
by
non-denaturing
polyacrylamide gel electrophoresis, in two
corresponding gel sets The protein mixtures
were separated along with horse radish
peroxidase, which was present as peroxidatic
actvity control. After electrophoresis running,
one gel set was stained with the substrate
solution (2mM DA, 30mM H2O2) and the
second control gel set was stained with
Coomassie Blue.
Q-mass spectrometry analysis
A red/orange band diplaying peroxidatic
activity and the corresponding band stained
with Coomassie Blue were analysed by mass
spectrometry.
DOPAMINE PEROXIDIZING ACTIVITY: DETECTION ON
NON-DENATURING POLYACRYLAMIDE GEL
A
A’
1
2
3
4
HRP
1’
2 ‘ 3’
4’
HRP
Protein ID
Proteins identified in red-orange
band
Molecular
weight
% peptide
identification
Macrophage migration inhibitory
factor (MIF)
Peroxiredoxin-1
12900
9
22110
5
FTH1, protein ferritin heavy
chain
Ferritin light chain (Ferritin L
subunit)
Fructose-bisphosphate aldolase,
brain-type aldolase
21094
14
19888
17
39325
7
1
IPI0029327
6
2
IPI0032935
1
3
IPI0041195
0
4
IPI0037567
6
5
IPI0041826
2
6
IPI0022064
4
Pyruvate kinase isozymes M1
57931
6
7
IPI0039575
7
39289
15
8
IPI0046524
8
47169
16
9
IPI0016938
3
Fructose-bisphosphate aldolase
A
Isoform alpha-enolase of Alphaenolase
Phosphoglycerate kinase 1
44483
10
10
IPI0021901
8
35922
11
11
IPI0025363
Glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase (GAPDH
Glial fibrillary acidic protein,
astrocyte (GFAP)
49880
17
12
IPI0025750
8
Dihydropyriminidase-related protein
2
62297
6
Proteins identified in colorless, non-reactive
band
Protein ID
Protein name
Molecula % Peptide
r
identification
Weight
1
IPI00291005
36426
7
2
IPI00019901
80955
8
3
IPI00218914
Malate
dehydrogenase,
cytoplasmic
Isoform 1 of
Alpha-adducin
Retinal
dehydrogenase- 1
IGKV1-5 protein
54862
11
4
IPI00419424
26234
18
Conclusions
We have developed a method for detecting
on native gel a dopamine peroxidizing activity
from human midbrain.
This method appears to be the first report of a
peroxidatic activity in gel detection using
dopamine and hydrogen peroxide as substrates.
 Q-mass spectrometry analysis of the activity bands
revealed the presence, among the others, of two
proteins: macrophage migration inhibitory factor
(MIF) and Peroxiredoxin-1, highlighting a possible
functional link among dopamine/dopaminochrome
redox cycle and protein metabolism.
PERSPECTIVES
• Our findings, revealing a possible functional link
among oxidative species and protein metabolism,
are consistent with the latest studies on the
pathogenic mechanism of PD.
• The properties of MIF and Peroxiredoxin-1
present in the activity bands are consistent with
their role in the maintenance of redox potential
within cells.
• New experimental approaches are under study in
order to define the role of proteins found in the
gel activity band, in particular of MIF and
Peroxiredoxin-1, in oxidative metabolism of
dopamine and in PD.
Cos’è la PROTEOMICA ?
• La proteomica è una disciplina scientifica
che permette lo studio del PROTEOMA,
cioè delle PROTeine espresse da un
genOMA in una particolare cellula,
tessuto o organismo, sia esso animale o
vegetale
Cos’è la SPETTROMETRIA DI MASSA
• E’una tecnica analitica che permette di determinare la
massa molecolare di un composto chimico.
• Ha origine nella prima metà del 1900, grazie agli studi di
J. Thompson, il quale osservò che, in un tubo sotto
vuoto a cui venga applicata una differenza di potenziale,
si formano elettroni e radiazioni positive.
• Uno spettrometro di massa è uno strumento che misura
la massa molecolare di una molecola, dopo che gli sia
stata impartita una carica elettrica. Esso è, infatti, in
grado di separare gli ioni molecolari in base al loro
rapporto massa/carica.
MALDI-Tof
MALDI
MALDI, matrix.assisted laser desorption/ionization desorbimento: è un processo in cui una miscela
viene evaporata da una superficie e ionizzata. Piastra maldi è un supporto d’acciaio: il campione
dopo dogestione con tripsina e immerso in una matrice (acido organico) che funziona da solvente
eminimizza le interazioni molecolari, assorbe parte dell’energia che viene impartita, ed ha un ruolo
attivo anche nella formazione dell’evaporazione e formazione degli ioni per protonazione, cioè
assorbono una carica positiva. Il campione depositatato sulla piastra viene lasciato cristalllizzare e
bombardata con fotoni ad alta energia, proveneienti da raggio laser pulsato, quinid vengiono diretti
verso l’analizzatore tof, che è un tubo, di lunghezza nota’in cui viene fatto il vuoto. Gli ioni vengono
emessi ad un’energia cinetica costante ed indirizzati verso il tubo. E= i\e mv2, dove m è la massa
dello ione e v la sua velocità. Minore sarà il rapporo massa\carica maggiore sarà la sua velocità.
Spettrometria di massa
• Fragment fingerprinting del peptide selezionato: la
sequenza parziale, insieme con la massa, costituisce un
“tag” di sequenza che può essere utilizzato come probe,
altamente specifico, per identificare proteine nei
database proteici.
• Lo spettro di frammentazione può anche essere
analizzato automaticamente per mezzo di SEQUEST, un
programma che consente la correlazione dei dati
sperimentali con spettri teorici, generati da sequenze
proteiche note presenti nei database.
Procedure elettroforetiche
L’ elettroforesi BIDIMENSIONALE prevede
due fasi:
• IEF: Separazione delle proteine in base
alle differenze nella loro carica netta
mediante l’isoelettrofocalizzazione
• SDS-PAGE: Separazione delle proteine
focalizzate in base alla loro massa
molecolare, in gel denaturante
Modello di ratto emiparkinsoniano
A: denervazione
dello
striato ipsolaterale
B: danno
neuronale in s.nigra,
dopo iniezione di 6idrossidopamina
(6-OHDA)
La somministrazione di 6-OHDA
riproduce, nel ratto, fenomeni di
stress ossidativo determinati
dalla riduzione dei complessi I e
IV della catena respiratoria con
un’iperproduzione mitocondriale di
radicali liberi, quali lo ione
superossido, di radicali idrossilici e
di perossido d’idrogeno.
Questa riduzione dell’attività dei
complessi I e IV mitocondriali è
probabilmente alla base
della perdita di neuroni che si
realizza, a livello della substantia
nigra trattata, nel giro di due
settimane. (A e B).
CONCLUSIONI

IL protocollo di estrazione e solubilizzazione delle proteine, messo a punto per il tessuto
cerebrale, associato ad un programma mirato di isoelettrofocalizzazione, ci ha permesso
di ottenere una soddisfacente risoluzione del corredo proteico delle sezioni di substantia
nigra e di striato mediante separazione in doppia dimensione.

Significative variazioni di espressione di alcune proteine sono emerse dal confronto,
effettuato mediante software d’immagine, dei profili proteici delle sezioni di tessuto
neurodegenerato rispetto al controllo. Le proteine, individuate come significativamente
differenti nei tessuti patologici rispetto ai controlli, sono state sequenziate in spettrometria
di massa MALDI-TOF.

Nel campione di tessuto ottenuto dallo striato due spot che appaiono piu’ intensamente
espressi nel profilo proteico dello striato indotto alla neurodegenerazione, rispetto al
controllo, corrispondono alla b-actina.
Lo spot proteico presente nel campione di substantia nigra trattato con 6-OHDA e non nel
rispettivo controllo corrisponde ad un’enzima: l’a-enolasi ( 2-fosfo-D-glicerato idrolasi)
(non neuronal-enolasi) (NNE).

L’ aumento dei livelli di espressione dell’a-enolasi e della b-actina, nei tessuti
neurodegenerati rispetto al tessuto di controllo, potrebbe essere risultato dei fenomeni di
ossidazione indotti dalla 6-OHDA. Entrambe le proteine appaiono coinvolte nei processi
di neurodegenerazione ed è testimoniata l’ossidazione che esse subiscono nella malattia
di Alzheimer. ( Castagna et al.,2002).

Il coinvolgimento di fenomeni di stress ossidativo nella patogenesi del morbo di
Parkinson è infatti largamente dimostrato (Jenner et al. AnnNeurol, 2003; 53 suppl. S26S38). I nostri risultati sono pertanto ricollocabili all’interno di tale scenario. Se l’a-enolasi
e la b-actina possono essere considerate bersagli del processo di ossidazione che
avviene a carico di molteplici proteine, nelle malattie neurodegenerative quali il morbo di
Parkinson e la malattia d’Alzheimer, potrebbero rappresentare importanti indicatori
diagnostici, sebbene occorra stabilire in quale fase della malattia insorgano le alterazioni
osservate, per far luce sul fattore o i fattori d’innesco della neurodegenerazione. Solo in
questo modo, infatti, sarà possibile risolvere il nesso di causalità della malattia, ancora
purtroppo oscuro.
DOPAMINA
HO
HO
CH2
CH2 NH2
6-IDROSSIDOPAMINA
HO
CH2
HO
OH
CH2
NH2
Confronto tra i profili proteici ottenuti da sezioni di tessuto
pH 5
8
pH 5
8
b-actina
striat
o
Substantia
nigra
A: Neostriato controllo
pH 4
7
Neostriato trattato con 6-OHDA
7
pH 4
a-enolasi
B: S. nigra controllo
S. nigra trattata con 6-OHDA
pH 3
A
pH4
Separazione miscela
proteica di substantia
nigra di ratto
emiparkinsoniano
mediante elettroforesi
bidimensionale
pH7
A’
pH 5
A’’
pH 3
10
8
B
10
pH4
pH7
B’
pH 5
8
B’’