Vecchi e nuovi approcci per determinare
la qualità fisiologica e genetica del seme
Enrico Noli
11 Marzo 2008
Facoltà di Agraria - Università di Bologna
Qualità del seme
• Fisica
• Fisiologica
• Genetica
• Sanitaria
Qualità fisiologica
•Vitalità e performance potenziale
•Capacità di produrre germinelli normali
•Pronta emergenza
•Uniformità elevata
•Conservabilità
Fattori che influenzano la qualità
fisiologica del seme
• Costituzione genetica
• Fattori ambientali
• Interventi agronomici e fitosanitari
• Raccolta, post-raccolta e conservazione
Test di germinazione
Determina il potenziale germinativo massimo
Buona ripetibilità
Facile standardizzazione
Scarso potere predittivo della
performance in condizioni di
campo sub-ottimali
Test di germinazione
Emergenza in campo (%)
Germinazione Azienda 1
Azienda 2
Azienda 3
Lotto
(%)
(condizioni (c. leggermente (c. fortemente
favorevoli)
sfavorevoli)
sfavorevoli)
A
90
88
80
70
B
90
87
60
40
Vigore
“La somma di quelle proprietà che
determinano la performance di lotti di
seme, di germinabilità commercialmente
accettabile, in una ampia gamma di
ambienti” (ISTA, 2001)
Deterioramento del seme
•Danni delle membrane
•Disorganizzazione degli organelli
•Riduzione dell’attività enzimatica
•Cambiamenti nella composizione in nutrienti
•Accumulo di metaboliti tossici
•Danni genetici
Approcci per la valutazione
della qualità fisiologica
Test di crescita e valutazione dei germogli
Tempo medio di germinazione
Lunghezza delle radici e dei germinelli
Test basati su Stress
Invecchiamento accelerato e Deterior. controllato
Cold test
Test biochimici
Conducibilità elettrica
Tetrazolo
Nuove tecnologie
Invecchiamento del seme
A
germinabilità (%)
B
A
alto vigore
basso vigore
B
tempo
Germinazione Invecchiamento
Standard Accelerato
Invecchiamento Accelerato
41 °C, 100% UR
per 76 h
poi
germinazione
standard
Conduttività elettrica
I danni alle membrane
cellulari sono uno degli effetti
principali dell’invecchiamento
Semi di scarso vigore rilasciano più
elevate quantità di elettroliti a
seguito di imbibizione
Morfologia del seme con raggi X
a
ipocotile
b
cotiledoni
spazio
libero
apice
radicale
c
Pomodoro
van der Burg et al. 1994
J. Amer. Soc. Hort. Sci.
d
cotiledone
schiacciato
Percentuale di piante utilizzabili (PU)
determinata in serra, mediante analisi
standard di germinabilità o con esame
radiologico in lotti di seme di pomodoro.
Lotto
A
B
C
D
E
Media
PU
(serra)
93
93
55
36
54
66,2
Germinabilità
PU
standard
(raggi X)
97
92
97
82
96
51
80
38
91
54
92,2
63,4
Apparato raggi X
per analisi/selezione
(da Incotec)
Morfologia del seme con raggi X
Elevata eterogeneità a livello
morfologico e fisiologico nel
”seme” di bietola
(da Kenneth, Syngenta)
Vecchie e nuove tecnologie
Bietola
Lastra radiografica
Immagine digitale
(da Kenneth, Syngenta)
Emergenza in campo e
spazio libero nel seme
Bietola
Emergenza (%)
100
80
Spazio libero assente
60
Spazio libero 1
Spazio libero 2
40
Spazio libero 3
20
Anormali (vuoti)
0
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
Gradi giorno (Cd)
(da Kenneth, Syngenta)
Analisi della fluorescenza
della clorofilla
• I semi raccolti a maturazione completa
mostrano più alti livelli di vitalità e
germinabilità
• In molte specie la quantità di clorofilla nel
seme decresce nel tempo durante la
maturazione
Contenuto di clorofilla
in una popolazione di semi
5000
4pA
Cavolo
Jalink et al. 1998. Seed Sci. Res.
Numero di semi
1000
100
25pA
10
1
Fluorescenza della clorofilla (pA)
Contenuto di clorofilla e
qualità del seme
Deterioramento
controllato
Bassa FC
Media FC
Alta FC
Bassa FC
Germinazione (%)
Germinazione (%)
Germinazione
standard (ISTA)
Media FC
Alta FC
Tempo (giorni)
Tempo (giorni)
(Jalink et al. 1998. Seed Sci. Res.)
Metodiche per la determinazione
della qualità fisiologica del seme:
conclusioni e prospettive
• La qualità del seme non è un concetto fisso, obiettivi e
priorità possono differire a seconda dei casi
• L’applicabilità delle metodiche deve essere valutata
specie per specie, anche cultivar per cultivar
• Le conoscenze sugli aspetti fisiologici e biochimici
crescono rapidamente
• Progressi tecnologici permetteranno di sviluppare
nuovi approcci o rendere più efficienti quelli esistenti
Qualità genetica
• Identità varietale
• Omonimie e sinonimie (semi, plantule, prodotti)
• DUS, EDV
•
Purezza varietale
• Varietà omozigoti, ibridi F1
•
Presenza d semi GM in lotti convenzionali e
viceversa
•
Selezione Assistita da Marcatori
Approcci tradizionali alla verifica
della qualità genetica
Esame di caratteri morfologici
Sul seme
In laboratorio o in serra
In germinazione
In pieno campo
Proteine di riserva
Solco ventrale
Endosperma
(prolammine e gluteline)
Aleurone (globuline)
Pericarpo e tegumenti
Embrione (=germe)
(albumine e globuline)
Cariosside di frumento, sezione trasversale
Proteine di riserva
1. Macinazione semi
(singoli o in bulk)
2. Estrazione delle proteine
3. Separazione elettroforetica
Profili UTLIEF di globuline di pomodoro
Vis
Unicum
UC 134
UC 105
UC 90
UC 82
S.Pierre
S. Marzano
Roma VF
Rio Grande
Rio Fuego
Red Setter
Red River
Petomech
Petogro
Napoli VF
Missouri
Marmande
Euromech
Early Pack
Cuor di Bue
Chico 3
Alice
Agata
Proteine di riserva
Proteine di riserva
pomodoro
girasole
F1
F1
Purezza F1 - Profili UTLIEF
I marcatori ideali
•non influenzati dall’ambiente
•indipendenti dallo stadio di sviluppo
•valutabili con obiettività e riproducibili
•elevato potere discriminante
•codominanti
•posizione nota nel genoma
•automazione possibile
Marcatori molecolari (MM)
1. Prelievo del campione
2. Macinazione
Marcatori molecolari
3. Estrazione del DNA
4. Amplificazione (PCR)
Marcatori molecolari
agarosio
acrilammide
5. Elettroforesi
bromuro di etidio
AgNO3
6. Visualizzazione dei risultati
fluorescenza
Identificazione varietale
… appartiene
veramente
alla varietà
dichiarata?
Microsatelliti
SSR (Simple Sequence Repeats) (ripetizioni
di-, tri-, tetranucleotidiche)
A
B
Caso A
Caso B
Specie: pomodoro
Locus: LE2A11- Ripetizione: atct
elettroforesi
………..ccctttgccaattttgtaaggagaagacggaccagtatggtttaac
ataccgtacatgcaacctgttgccttgaacaatatcaatgatctatcgatc
gatctatctatctatttatctgtctctgcgcgtatagtgttgtctgtacct
ttggtgtgaagaatatgaataaagggata………..
Var 12
Var 11
Var 10
Var 9
Var 8
Var 7
Var 6
Var 5
Var 4
Var 3
Var 2
Var 1
Identificazione varietale con SSR
Leta019
243
241
237
LeMDDNa
225
215
210
Due SSR sono sufficienti per distinguere la Varietà1 di
pomodoro dalle rimanenti 11 morfologicamente simili
Identificazione varietale con SSR
Frumento duro
Perry, 2000. Theor. Appl. Genet.
Accertamenti DUS
• Ad oggi la descrizione varietale si
basa su descrittori morfo-fisiologici
(e biochimici di supporto)
• È attualmente in discussione la
possibilità di ricorrere a MM
• I MM potrebbero essere un
utile strumento per la gestione
delle collezioni di riferimento
Identificazione di EDV
limite delle varietà
essenzialmente
derivate
Varietà
originale
distanza genetica
crescente
Varietà
derivata
area di “influenza”
della varietà
originale
Varietà nuova
(PBR)
• I MM rappresentano lo strumento ideale per
l’identificazione di casi di essenziale derivazione
Purezza varietale in ibridi F1
con RAPD
Il prodotto di autofecondazione manca della banda della
linea impollinante
Purezza varietale: ricerca di OGM
Obiettivi
• Rilevamento
- Il lotto contiene OGM?
• Identificazione
- Se sì, sono autorizzati?
• Quantificazione
- Le soglie sono rispettate?
Tipologie di analisi OGM
1. Macinazione del campione
(3.000 semi)
2. Estrazione del DNA
3. PCR
qualitativa
end-point
quantitativa
real-time
Tipologie di analisi OGM
Risultato:
presenza/assenza
Risultato:
stima del contenuto OGM
Selezione assistita
da marcatori (MAS)
Pomodoro: Identificazione di piante omozigoti per il marcatore
codominante Rex1 associato al gene Mi di resistenza a
Meloidogyne spp.
SHR
PCR + digestione con TaqI = CAP
S = omozigote sensibile
H = eterozigote resistente
R = omozigote resistente
Donatore
Selezione assistita
da marcatori (MAS)
Frumento: analisi di segregazione del marcatore SSR
wmc705, associato ad un QTL per la resistenza alla
fusariosi della spiga sul crom. 5AL
175
145