Categoria A: virus
Virus delle Febbri
Emorragiche
A. Azzi-Firenze, 21 febbraio 2005
• Facilità di diffusione e trasmissione
interumana
• Letalità elevata
• Capacità di suscitare panico e disordini
• Necessità di predisporre piani specifici
•Vaiolo
•Virus delle febbri emorragiche
(Filov.Ebola e Marburg; Arenav. Machupo …)
(Centers for Disease Control and Preventions)
HFV as possible agents of bioterrorism.
• large quantities of virus can be propagated in
cell culture,
• they are transmissible as aerosols for the most
part,
• there are only limited
vaccine
and pharmaceutical strategies for either
prevention or treatment of established
infection.
VHF
Non tutti i virus delle febbri emorragiche
- sono trasmissibili per aerosol
- o possono essere prodotti
in concentrazioni elevate
per poter essere usati come agenti biologici
(Drug Discovery Today.
"Preventive and therapeutic approaches to viral agents of bioterrorism." 2003
Aug 15;8(16):740-5.)
Quali virus ?
•
•
•
•
Filoviridae
Arenaviridae
Bunyaviridae
Flaviviridae
VHF
Specifica distribuzione geografica
Diverse modalità di trasmissione
serbatoi naturali:
•Multimmate rat
•Cotton rat
•Deer mouse
•house mouse
•other field rodents
Vettori:
•Zanzare
•zecche
???
Virus a ssRNA, provvisti di envelope
Caratteristiche strutturali e biologiche diverse
1
VHF
• Sindrome multisistemica caratterizzata da
– Febbre
– Emorragie
– Shock circolatorio
Diversa gravità
Casi mortali:
– elevata viremia
– immunosoppressione
VHF
• Incubazione 2-21 giorni
• Segni e sintomi iniziali
Insorgenza brusca – filovirus
Insorgenza graduale - arenavirus
– febbre, stanchezza, vertigini, dolori
muscolari,debolezza, dolori addominali, nauseavomito, (diarrea).
• Emorragie
– Sottocutanee, interne, ma anche epistassi,
ematemesi, melena, and menorragia …
• Shock, coma, delirio, convulsioni
• Insufficienza renale
318 casi umani; letalità 88%
1;0%
Serbatoio naturale ?
Pipistrelli?
284; 53%
1;0% Macachi. Filippine
2000 nord Uganda: Sudan >400; 50%
Altri episodi
• 2004: Ebola Hemorrhagic Fever
Outbreak in south Sudan – 20 casi, 5
morti
• 2003: Ebola Hemorrhagic Fever
Outbreak in The Republic of the Congo
-47 casi, 28 morti
32; 23%
Scimmie verdi africane
Uganda
Ordine:Mononegavirales
Fam. Filoviridae
• Virus a ssRNA –
• Pleiomorfi (envelope)
• 2 generi
Filamentosi, talvolta ramificati
– Ebola-like virus (Ebolavirus?)
– Marburg-like virus (Marburgvirus?)
• Non crossreattività antigene tra i due
generi
2
Struttura
Filovirus /EM/ pleiomorfismo
• Particelle filamentose lunghe
– 860 nm Marburg, 1200 nm Ebola
fino a 12.000 nm
• Diametro 80 nm (nucleocapsidi 50 nm)
• RNA – 19 kb
Ebola /cellula
Marburg
Trasmissione
Trasmissione
• Sangue infetto (o secrezioni)
– Aghi contaminati (ospedale)
– Interumana
– Infezioni in laboratorio
• Possibili aerosol
• Associazione tra episodi epidemici
nell’uomo e manipolazione di carcasse di
animali selvatici
• Gorilla
• Chimpanzee
• Antilopi
Massimo rischio negli stadi avanzati
• Presenza del virus nel liquido seminale di convalescenti
3
Trasmissione
• Animal mortality monitoring network
• Epidemie negli animali selvatici prima
degli ultimi 5 episodi epidemici umani
• Analisi di 21 carcasse – 14 positive
– 10 gorilla
– 3 schimpanzee
– 1 antilope
Il serbatoio naturale rimane ancora da identificare
Resistenza
• Infettività
– stabile a temp ambiente (20°C),
– resistenti all’essicamento,
– inattivati a 60°C per 30 min
• Sensibili ad alte dosi di UV e gamma
• Sensibili a solventi lipidi, betapropiolattone, ipoclorito e disinfettanti
fenolici
Il rapporto virus-cellula
• GP
legame al recettore cellulare- GP1
Recettore:diverse lectine di tipo C per Ebola
asialoproteine su epatociti per Marburg
•
ancoraggio all’envelope
GP2
fusione
• Endocitosi e fusione pH dipendente
Ruolo patogenetico di GP
Genoma – 19 kb;
7 ORF: GP, NP, VP24 e VP40 (matrice),
VP30 e VP35 (non strutturali), L (polimerasi)
GP Ebola: GP 150-170 kDa
sGP 60-70 kDa
4
• GP
• sGP
• VP35
• VP40
cellule endoteliali
citossicità in vitro
danno vascolare in vivo?
inibizione proliferazione T
neutrofili (CD16, recettore per Fc γ3)
protezione del virus da Abs
(decoy antigen)
antagonista IFN α e γ
molecular mimicry proteine della
matrice umane (abdominal aortic
aneurism protein e MFAP-4)
Modelli animali
• Scimmie: macachi
• Cavie
• topi
Lesioni endotelio, piastrine
Necrosi focale fegato, milza, rene, ovaia, testicoli
Emorragie mucose, addome, vagina, pericardio
Shock
Patogenesi
Ingresso: mucose/cute lesioni di continuo
Infezione macrofagi
immunosoppressione
Macrofagi alveolari
Liberazione citochine
Disseminazione per via linfatica
Milza: deplezione
e vascolare.
cell linfoidi, necrosi
Replicazione in cellule endoteliali
Danno vascolare,
aumento permeabilità,
emorragie
Fegato:infezione epatociti,
c.endot, monociti e c.di Kupffer
patogenesi
• Infezione cellule endoteliali
– Osservazioni istopatologiche su casi umani-modello
sperimentale cynomolgus
• Non distrugge architettura epitelio
• Successiva alle alterazioni emorragiche
• Sopranatante di colture monociti/macrofagi
infettati con Marburg
aumento permeabilità
monostrati cellule endoteliali in vitro – inibizione
dell’effetto con MAbs anti-TNF-α
5
Risposta immunitaria e protezione
• Assenza di infiammazione
• Immunosoppressione
• Risposta anticorpale ridotta o assente (nei
casi gravi)
• Anticorpi non neutralizzanti (saggi in vitro)
• Selezione di MAb protettivi dal siero di
sopravvissuti
• Ruolo della riposta cellulo-mediata
immunosoppressione
Diminuzione linfociti
• Non infezione
• Apoptosi
• Infezione CD-alterazione funzione- scarsa
stimolazione T
Diagnosi
• Sierologica
test immunofluorescenza
Utilità limitata
Westrn blot
Cellule Vero, Vero E6, …..
• Isolamento da siero, sangue, tessuti
• Ricerca antigeni virali (ELISA, IHC)
• RT-PCR e sequenziamento
EHF diagnosi
• Diagnosi indiretta
IgM specifiche-ELISA
IgM e IgG specifiche (campioni tardivi, convalescenza)
• Diagnosi diretta
•Antigen-capture enzyme-linked immunosorbent assay
(ELISA)
Strumenti portatili per laboratori mobili
• RT-PCR anche quantitativa (Taqman-RT-PCR)
• isolamento virale
(entro pochi giorni dall’insorgenza dei sintomi).
• indagini retrospettive su campioni da pazienti deceduti
immunoistochimica, isolamento virale, RT-PCR.
Arenaviridae
Genere: Arenavirus
2 gruppi (18 specie)
• New World or Tacaribe complex°
• Old World or LCM/Lassa complex*
°New World rats and mice (family Muridae, subfamily Sigmodontinae)
*Old World rats and mice (family Muridae, subfamily Murinae).
Arenaviridae
Virus della coriomeningite linfocitaria 1933
meningite asettica
1969
1958
1963
1989
1990
Antigeni interni crosscross-reattivi
Antigeni di superficie
speciespecie-specifici
6
Vie di trasmissione
Animale - uomo
•
•
Eliminazione con urine e saliva
– Contaminazione alimenti
– Aerosol
Manipolazione animali infetti
Uomo-uomo
• Nosocomiale
• Sangue, tessuti, secreti ….
Contaminazione di materiali e oggetti di uso comune
Disseminazione per via aerea
Contaminazione acqua, alimenti
Infezioni persistenti
Infezioni persistenti
– Nei roditori con Old World arenaviruses il
virus viene trasmesso dalla madre al feto.
Virus presente nella popolazione di
generazione in generazione
– Nei roditori con New World arenavirus
trasmissione orizzontale- , solo una parte dei
roditori infetti a diversi tempi. Andamento
ciclico dei casi umani.
• Nei roditori (e in vitro)
– Meccanismi molecolari –DIP
– Difese dell’ospite
• Conseguenze
– Asintomatiche
– Ritardo crescita
– (Ridotta fertilità)
Arenavirus
L Polimerasi e prot. reg
Struttura e Morfologia
Particelle sferiche
Diametro 100-130 nm
Envelope
Genoma:ssRNA ambisenso;
50005000-7400 nt.
2 segmenti, circolari
S NP,G1,G2
7
Extracellular virus particles budding from the cell surface.
Magnification approx. 12,000 times.
Arenavirus genoma
Recettore per Lassa:α-dystroglycano
Segmento L: pos. Proteina Z (zinc binding)
neg RNA pol
Segmento S: pos. NP
neg. GPC (GP1-GP2)
Arenavirus: Lassa
Mastomys
Diagnosi Lassa fever
•
Lassa virus: molte infezioni
asintomatiche ma nei casi che richiedono
il ricovero in ospedale la mortalità è circa
del 15 -25%. Maggiore nelle donne in
grvidanza
•
tasso di letalità per Junin, Machupo, e
Guanarito viruses tra 5 e 35 %.
• Indiretta
– ELISA per IgM e IgG specifiche
• Diretta
virus in circolo
– Antigene (ELISA)
per circa 3 settimane
– Isolamento (7-10 gg)
nelle urine
– RT-PCR
per circa 5 settimane
Nigeria, Sierra Leone e Liberia.
Terapia: ribavirin
?
8
Junin and Macupo Viruses
Arenavirus: distribuzione
geografica
• Virus Junin and Macupo agenti di Argentine and
Bolivian Haemorrhagic fever rispettivamente.
• Serbatoio naturale e fonte di trasmissione i roditori
Calomys musculinis e C callosus .
• Presentazione clinica simile a
neurologici più accentuati.
Lassa fever. Segni
• trasmissione uomo-uomo non descritta
• Efficacia di trattamenti con Ribavirin e siero
iperimmune.
Terapia
• Ribavirin – Lassa e Junin, non Ebola
• Immunizzazione passiva
– effetto correlato alla concentrazione di
anticorpi neutralizzanti
– Sviluppo di MAb umani ricombinanti
• RNA interference
• Modulazione della risposta
– Coagulazione
– Apoptosi linfociti
Sviluppo di vaccini
Ebola
• Modelli animali
– Cavie
– Primati
– (Topo)
• Virus attenuati
Proteina GP
• Proteine ricombinanti
Efficaci nel modello cavia, meno nei primati
• Vaccini Protocolli
a DNApriming-boosting
priming:plasmide con gene virale
boosting con vettori poxvirus/adenovirus+gene virale
9