Caratterizzazione genetica e stabilità
commerciale di probiotici
Chiara Medici
I probiotici sono microrganismi “vivi” aggiunti agli
alimenti o agli integratori della dieta che esercitano
funzioni benefiche per l’uomo/animali (FAO 2001)
üStabilizzazione/miglioramento barriera intestinale
üStimolazione sistema immunitario e protezione da batteri
patogeni e virus
üAiuto nella digestione del lattosio
üAssorbimento di minerali
üIpercolesterolemia
üRicolonizzazione dell’intestino dopo trattamento con antibiotico
üTrattamento delle allergie alimentari
Colture liofilizzate
UOMO
Alimenti carrier
I microrganismi probiotici devono essere:
Ø sicuri per l’impiego nell’uomo (GRAS Generally Recongnized As
Safe)
Ø di origine umana
Ø resistenti e capaci di moltiplicarsi ai bassi valori di pH
Ø attivi e vitali a livello intestinale
Ø resistenti al processo tecnologico industriale del prodotto
Ø stabili geneticamente
Microrganismi considerati probiotici
Lactobacillus
specie
L. acidophilus
Bifidobacterium
specie
B. adolescentis
L. amylovorus
B. animalis
L. casei
B. bifidum
L. crispatus
B.breve
L. delbrueckii
subsp.
bulgaricus
L. gasseri
L. johnsonii
L. paracasei
L. plantarum
L. reuteri
L. rhamnosus
B. infantis
B. longum
Atri LAB
Enterococcus
faecium
Lactococcus
lactis
Leuconostoc
mesenteroides
Streptococcus
thermophilus
Non LAB
Bacillus cereus var
toyoi
Propionibacterium
freudenreichii
Esempi di alimenti addizionati di probiotici
IDENTIFICARE e CARATTERIZZARE il microrganismo
•Accertamento
posizione tassonomica
(specie)
•Analisi dei biotipi di una stessa
specie
•Le attività dei probiotici sono
ceppo-specifiche
•Controllo nella
•L’identità
del
ceppo
è
diffusione di ceppi
batterici con specifiche importante come strumento per
il controllo della qualità,
proprietà
dell’efficacia e della tracciabilità
di un prodotto
Identità del ceppo
Effetto sulla salute dell’individuo
Identificazione genetica della specie
Analisi di molecole altamente conservate nei microrganismi
per lo studio di relazioni filogenetiche
§Ribotyping
§Ibridazione DNA-rRNA
§Analisi ARDRA
§Sequenziamento dell’rRNA 16S
§Amplificazione regioni 16S, 23S e spacer
§Costruzione di database per il confronto di sequenze
Dendrogramma di similarità o albero filogenetico
o definisce il grado
di
similarità
dei ceppi esaminatati
o consente di stabilire se
ceppi non perfettamente
identici possono
ugualmente essere
geneticamente correlati
o risulta dall’esame
computerizzato dei profili
elettroforetici
Analisi di sequenza 16S di Bacillus commerciali usati come probiotici
Confronto delle
preparazioni dei due
probiotici commerciali
con diverse specie di
Bacillus tra cui B. subtilis
Green et al. Appl. Envir. Microbiology 1999
Ribotyping
ØAnalisi automatizzata per ottenere profili di restrizione di geni rRNA
tramite ibridazione con sonde per l’rRNA 23S e 16S
ØUtilizzabile per tutti i microrganismi
ØAlta riproducibilità,facilmente interpretabile e rapido
ØCosti elevati
Il Gruppo Lactobacillus casei e
Lactobacillus acidophilus possono
essere discriminati in base al
ribotipo e si arriva ad una
riclassificazione a livello di
specie
C.S.Ryu et al. 2001, Microbiol. Immunol
ARDRA
Analisi restrizione di amplificati dell’ rDNA o spacer
pattern specie-specifici
semplice e rapida
Utilizzata per
l’identificazione di diverse
specie tra cui Lactobacillus
(Moreira et al. 2005),
Streptococcus (Sasaki et al.
2004) e Mycobacterium
(Kurbachew et al. 2003)
Tipizzazione batterica
Caratterizzare un ceppo batterico è importante
per:
vValutare la diversità microbica in un sistema, alimento, habitat
vMonitorare la presenza di specifici biotipi in un ambiente o
durante un processo
vDifferenziare ceppi diversi isolati
vSelezionare ceppi tecnologicamente importanti
Tipizzazione fenotipica
ØBiotipizzazione: profilo biochimico
ØAntibiogramma: pattern di resistenza
ØSierotipizzazione: caratteri antigenici
ØFagotipizzazione: sensibilità ai batteriofagi
Ø Multilocus Enzyme
ØElectrophoresis (MLEE): varianti di enzimi metabolici
Utilizzabili da tutti i laboratori
Poco dispendiosi
Danno risposte immediate
Forniscono indicazioni preliminari
Poco discriminanti
Scarsamente riproducibili
Tipizzazione genotipica
§Analisi del DNA plasmidico
§Analisi di Restrizione del DNA cromosomico (REA)
§Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE)
§Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD)
§Elettroforesi su gel in gradiente denaturante (DGGE)
§Analisi AFLP
Capacità discriminante in genere elevata
Richiede notevole esperienza
Costi elevati e strumenti specifici
Esecuzione laboriosa, tempi non immediati di risposta
In alcuni casi difficile standardizzazione
Talora non semplice interpretazione
Analisi RAPD-PCR
Discrimina a livello di
specie
ed
evidenzia
eterogeneità all’interno di
isolati della stessa specie
Possibilità di individuare
relazioni tra specie/ceppi
isolati e fonti di isolamento
Delgado et al. 2006, Dig Dis Sci
DNA fingerprinting
Un altro metodo per ottenere pattern specifici è la
digestione del DNA genomico con una endonucleasi
di restrizione e separazione dei frammenti per
elettroforesi
Convenzionale:
Convenzionale
Analisi REA
Molti frammenti
In campo pulsato:
pulsato
Analisi PFGE
üPochi frammenti e grandi
üTecnica tipizzazione di ceppi non di specie
üStudi epidemiologici
üElevata riproducibilità
üFortemente discriminante e applicabile a
tutti i microrganismi
üIndaginoso e costi abbastanza elevati
Analisi PFGE: studio di probiotici commerciali
Analizzati 67 ceppi
- commerciali
- di riferimento
Ottimo strumento:
- per distinguere ceppi
- meno per le specie
Yeung et al. 2004, J.Appl.Microb.
Shelf life
Durabilità di un prodotto: agenti del deperimento in funzione
del tempo
Tempo necessario a raggiungere la concentrazione-limite di
un componente (es.popolazione microbica) definita da standard di
sicurezza o appena compatibile con la soglia sensoriale
Stabilità di prodotti probiotici
Devono presentare al consumo un elevato numero di microrganismi
vivi ( almeno 107 ufc/g)
pH e acidità
Flora contaminante, mesofili
totali e muffe-lieviti
Conteggio fermenti vivi
SHELF
LIFE
Proteine, grassi,
contenuto di acqua
Panel test
Andamento dei LAB (a) e dei lieviti e muffe (b) su yogurt a diverse T° di stoccaggio
Considerazioni finali…
ØIn relazione alla complessità legata alla produzione e
stabilità di un alimento “probiotico” l’identificazione
solo della specie non è più sufficiente a garantire
trasparenza, efficienza e sicurezza
ØL’effetto probiotico è ceppo-specifico
ØDifferenze tra fenotipo e genotipo
occorre
comunque un approccio polifasico per identificare un
microrganismo a livello di specie/ceppo
ØIl sequenziamento dell’rDNA 16S è lo strumento
più efficiente per una corretta identificazione della
specie batterica
ØLa PFGE, attualmente, è la tecnica migliore per la
tipizzazione di ceppi batterici
ØAFLP e RAPD altamente polimorfici ma necessità
di condurre test in doppio per verificare la
riproducibilità
ØNumerosi i fattori che influenzano la
stabilità/vitalità commerciale di un prodotto
contenente probiotici