Lezione 17 - 18
mercoledì 27 aprile 2011
corso vettori biologici II
Biotec industriali
ore 14:00 -16:00 aula 6A
Clonaggio dei prodotti PCR
Clonaggio in plasmidi dedicati con prodotti PCR
con TAQ polymerase w.t. si hanno aggiunte di A terminali spuri
TAQ proof reading o altri producono ampliconi “blunt ends”
Secondo che enzima si usa, si sceglie un plasmide adeguato.
Esistono in vendita:
- plasmidi gia’ linearizzati con coda di T terminale per facilitare la
ligasi tra l’amplicone ed il plasmide
- plasmidi con topoisomerasi coniugata all’estremita’ del plasmide
che attacca direttamente l’amplicone senza bisogno di ligasi
cerchiamo delle estremità ad un
frammento di PCR intersperso all’interno
di una sequenza ignota:
- se ho trovato da Southern un frammento di DNA a
sequenza ignota (però conosco la sonda),
- una inserzione di un frammento noto in un genoma,
- un vettore che si è integrato in una regione ignota,
- un virus integrato non sito specifico,
- una ricerca “gene trapping”,
- la ricerca delle estremità genomiche di un gene noto solo
come cDNA
la soluzione è la PCR inversa
Si ha un ancoraggio sulla sequenza nota e nient’altro
Si deve amplificare in maniera inversa rispetto ad una
PCR normale
Quale stratagemma si usa?
Circolarizzare un frammento dopo analisi di restrizione
per Southern utilizzando la sequenza nota come sonda
Il templato può essere un frammento proveniente da
una delle possibili analisi precedenti
analisi Southern del frgm
deve essere scelto il frammento da amplificare
sequenza genomica o di Bac o da cui si vuole recuperare la
sequenza nota inserita o integrata
digestione con enzimi di restrizione
verde : no buono
bleu : no buono
giallo: no buono
viola: troppo lungo
marrò: buono
rosso: buono
grigio + viola: buono
- tra due buoni si sceglie quello con estremità coesive
per la ligasi più efficiente
- si evita l’enzima che taglia all’interno del frgm, si
otterrebe solo una estremità (diversa strategia)
grigio + viola se dx troppo lungo, estremità compatibili
dopo l’analisi Southern
Dopo l’individuazione del frammento di ampiezza
conveniente
- digestione del DNA con l’enzima prescelto
- arricchimento del frammento con corsa su gel (opzionale)
- ligasi
- PCR con primers divergenti
- eventualmente seconda PCR con primers “nested” ancora
più esterni ai primi, ma interni al frgm lineare
- una PCR produce sempre frgm lineari !!!!
PCR inversa
Il nome deriva dal fatto che si usano primers disegnati su una
sequenza con direzione divergente, direzione di sequenza dei
primers apparentemente non convergente. Analisi Southern
A
seq ignote
Frammento di DNA
c d
Sequenza nota (primers divergenti)
Ligasi per circolarizzare il frammento
A B
si amplifica il frammento circolare
nella regione ignota
Sequenza nota
CD
primers divergenti
B
seq ignote
amplificazione di DNA
genomico o clonato
al primo ciclo cosa si amplifica ?
la Taq polimerase si ferma sull’amplicone ?
primer frw
la taq polimerasi non ha ostacoli e non si ferma
allora ? perchè si amplifica solo l’amplicone ?
primer rev
termini dell’amplicone
Orientamento primers PCR inversa
ligasi del sito
di restrizione
a b
5’
3’
5’ 3’
3’ 5’
5’
3’ d
3’
d
c d
b
b
5’
a
a
c 3’
c
5’
PCR nested per PCR inversa
estremità ignote digerite su DNA genomico e legate
regione nota
II primer
I primers dovranno sempre
essere complementari ai due
diversi filamenti
I primer
II primer
I coppia
divergente
II primer
PCR nested quando si vuole
ottenere maggiore specificità
I amplicone
II amplicone
I primer
II primer
Primo ciclo frgm + lungo
frammento di restriz legato
c
c-d sequenza nota
d
I ciclo
c
c d
d
II ciclo
c
d
c
d
d
c
possibilità di concatenamero se la taq prosegue
si amplifica solo l’amplicone
primer frw
la taq polimerasi non ha ostacoli e non si ferma
primer rev
dal II ciclo compare il frammento con le estremità
corrispondenti al 5’ dei due primers:
primer rev
templato I amplificaz
primer frw
templato I amplificaz
il prodotto di PCR è sempre
lineare
sia nella PCR diretta che inversa con un DNA circolare
provate a farvi uno schema!
Metodo real time
Differenza con PCR standard “end point”
“end point” si intende reazione a termine
Analisi dell’amplificazione in tempo reale
Tramite fluorescenza dei prodotti amplificati
Colorante fluorescente del DNA intercalante CYBRgreen
Marcatura dei primers o doppia sonda:
“FRET”; “TaqMan”; “amplifluor”
Principio del funzionamento real-time
Analisi dell’amplificazione ad ogni ciclo
lettura laser della fluorescenza (qualunque metodo)
Soglia di superamento rumore di fondo
Inizio crescita log macchina
tra 35-40 cicli
Curva sigmoide
Effetto inibiz.
determinazione
di sensibilità
del metodo
10pg
1pg
5pg
0.5pg
no DNA
1 log per 3.3 cicli
Crescita a esponente 2
f
l
u
o
r.
ogni tre,tre cicli 10 x incremento
Intercetta col “cut off” background =
punto inizio log phase determinabile
La conc. Misurata con una curva standard
di riferimento x = condizioni
n. cicli
Ascissa n. cicli / ordinata fluorescenza
AFLP Amplified restriction fragment lenght
polymorphisms
Ogni genoma ha un certo numero di siti di restrizione per tipo di enzima
di restrizione
- si digerisce il genoma e ci si legano degli adapters
- si disegnano dei primers che contengono l’adapter ed una sequenza
random al 3’ con due, tre, quattro, cinque, sei… nucleotidi secondo
quanto si vuole essere selettivi; da migliaia di frammenti si passa a
meno di cento
- Gli oligonucleotidi verso il 3’ oltre l’adapter possono contenere solo
certi nucleotidi e allora sono piu’ selettivi e diminuiscono il numero di
frammenti specifici rendendo il pattern piu’ semplice da analizzare.
Dagli RFLPs agli AFLPs
Nuovo metodo di studio dei polimorfismi con
approccio globale genomico
Studio dei polimorfismi di frammenti di
restrizione non conosciuti con amplificazione
tramite PCR selettiva dei frammenti genomici
http://www.dea.gov/programs/forensicsci/microgram/journal071203/mj071203_pg7.html
Approccio globale
con micro-cips
Polimorfismo dei frammenti di restrizione
amplificati (AFLP)
Schema dei
primers
usati
•Produzione in multiplex di 50-100 marcatori con un singolo esperimento.
•Produzione contemporanea di bande polimorfiche tra individui (DNA
fingerprinting) e di monomorfiche entro e polimorfiche tra specie
(identificazione di specie)
•Applicabili al genoma di qualsiasi specie senza bisogno di informazioni a
priori sulle sequenze o di disponibilità di sonde
Fasi dell’esperimento
! digestione con Eco RI del genoma in analisi
!! digestione della I reazione con Taq I (o altro enzima)
!!! ligasi con la miscela dei due adattatori
!!!! preamplificazione senza marcatura
!!!!! amplificazione con primers marcati
!!!!!! corsa su gel di acrilamide 4,5%
!!!!!!! rivelazione con autoradiografia o elettroforesi capillare
in alternativa corsa elettroforetica capillare con fluorescenza
Adattatori e Primers
Adattatori secondo il metodo pubblicato da Pieter Vos et al.
Nucl.Acid Res. 1995, 23 n.21, 4407-4414 e Paolo AjmoneMarsan et al. Animal Genetics 1997, 28, 418-426.
adattatore Eco RI
5’
3’
5’
3’
CTGGTAGACTGCGTACC AATTCnnnnnnnnG AATTGGTACGCAGTCTAC
CATCTGACGCATGGTTAA GnnnnnnnnCTTAA CCATGCGTCAGATGGTC
3’
5’
3’
5’
adattatore Eco RI
frammento di restrizione
adattatore Taq I
GACGATGAGTCCTGAC CGAnnnnnnnnnnnnnT CGGTCAGGACTCAT
TACTCAGGACTGGC TnnnnnnnnnnnnnAGC CAGTCCTGAGTAGCAG
adattatore Taq I
e terza combinazione con adattatori Eco e Taq sui frammenti tagliati regolarmente
Elettroforesi su acrilamide
Ogni lane è un soggetto
Il n. di bande presenti
costituisce il pattern allelico
Alcuni alleli sono molto
frequenti (strisce orizzontali)
possono caratterizzare la
razza animale
AFLPs gel acrilamide
PCR-based screening of BAC DNA pools for
SAS-DNA markers using AFLP technology.
AFLP templates were prepared from BAC DNA
PPs (1-32) and SPs (1-16) and selectively
amplified with fluorescent-labeled EcoRI +
TGA and MseI + CGG. Labeled products were
analyzed on a LI-COR DNA sequencer. AFLP
template from genomic DNAs (IS3620C and
BTx623) were run as controls and are indicated
above the respective lanes. Arrows to the right
of the gel show selected SAS DNA markers that
were analyzed in the DNA pools. Asterisks to
the right of a subset of the markers indicate
those SAS DNAs that revealed polymorphisms
between BTx623 and IS3620C and could be
mapped as AFLPs on the sorghum genetic map.
Fluorescent-labeled molecular weight markers
(LI-COR) were run in lanes marked M and
their sizes (bp) are shown to the left of the gel.
Elettroforesi capillare
cosa è una“Nested” PCR
Per aumentare la specificità con PCR ottimizzata e non
ulteriormente ottimizzabile con i parametri di reazione
Se si deve avere un prodotto di amplificazione con alta
efficienza eliminando altri prodotti indesiderati
-a) omologia parziale dei primers già ottimizzati
-b) sequenze omologhe, pseudogeni, sequenze duplicate
caso a: trovare una seconda coppia di primers interni al
primo amplicone (probabilità limitata di omologia
di entrambe le sequenze in una stessa regione)
caso b: cercare le regioni divergenti dove scegliere altre
coppie di primers
II amplicone interno
primer frw. I
primer frw. II
primer rev.II
primer rev.I
PCR nested primo esempio
Quando abbiamo un amplicone per esempio di 500 bp
5’
5’
pr frw
3’
3’
3’
3’
5’
5’
pr rev
1° amplicone
II pr frw
5’
3’
3’
5’
II pr rev
2° amplicone nested
il secondo amplicone sarà più breve secondo la posiz. dei primers
esercizio
1
61
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
901
961
1021
CTCAGAGCTG
CCCTGCCTTT
CCGTAGCCCC
AAAAGCAGCT
AGCCCAGGTC
CTCCTAATGA
TTGACCAGTT
TTGCCTTTAT
GTTTGGACAT
ATTCCCCCTC
AAGAGGAGGA
CGGGTTCAGA
ATGGCAGCGA
AATCAGCAGG
AGAAGGAACG
TCAGGCGGTC
GTAGCGGGTC
AAAAATGGAA
GGAAGGAGGC
GCCTCACTTT
CTGCCTTTCC
TTTAGGAGCT
GTTGTTTTTT
GGTTTTTTTT
AACATATTTG
TTTTAATTAT
ACTACATGGA
CCCCTTAATA
CAGTTCGCTA
CTCAGGCAGT
GTCGAACAGC
TTCCAAATCC
GATAGCTGAT
AAACCGAAGC
TGAGAGTGGG
ACAGGAACCC
TCTAGATGGC
ACGCAACTTT
TAGGGACTTA
TTCTTTTCGT
CCAGCTTAGA
CTTTCGGACC
AGGGTTATTT
TTGGGATCTG
TCAGTAAATA
TTTAAGAATT
CACAGCAATG
CAGTCGGAAA
AGCTCTGAAT
CAGCCAGTCC
GTGAAGAAGA
AGACAAGAAC
AGCCCAAAAA
TCAGAAGATG
GGCTGTGCCT
CCCTAACTTT
CTGGGGTCGA
GCCTTGTTGG
AGCCATGGCG
TGTTTTAGTA
TATTTATTTT
ATATTTTTCT
CCTGGGCACA
AAAAGATGAT
CATCGAGTCA
GTGAGCAGGG
CTTCTGAGAG
TCCCAGAAGC
TGTGGGAAGA
CATCGCGATT
GAAGAGGCCA
AACAGGAACA
TAGAGAGAGC
CGGGCAGCCT
TTCGAACCTT
AAAGAAGCAG
CACCTCCATT
TTAATTATTG
TCGTTTTTTA
ACTAGTAGAT
GGACTTCAAA
GAGAAATAAG
CTCAGCCTCT
AAGTGATCCA
TCAGTCGGAA
CAAAGAGAAG
ATATCCTGAT
TAATATTAAG
GAGGCAGCTG
AGGCACCAGT
GCGCTCTGCT
CAGGGGGCCC
TTTTTGGGAG
CCGTACTGAG
TTTGTGCGCT
CTTTATTTTT
ACGGAGGATT
AGGACTCTTG
GCAAACACAG
GACAAAAGCC
GAAGAAGCTT
GGAAGTGGAC
TCTGAGAGCG
CCAGCCTCTA
GTTTATGGGG
GAAGAGGCAA
AAAAAACAAG
GCAGAGAGTG
- Trova i primers per fare una PCR di un frammento di circa 3- 400 bp
di questa sequenza,
- trova i primers per una PCR nested.
- Trova i primers per una PCR inversa e nested
- Trova a che gene appartiene questa sequenza
esecuzione esercizio
1°primer forward: da b.72 a 92 = 21 basi;
10 GC, 11 AT = 40+22 =T melting 62°C
1°primer reverse: da 786 a 767 = 20 basi;
10 GC, 10 AT = 40 + 20 = T melting 60°C
amplicone = 715 bp (da 72 a 786)
nested: 2° forward: da b. 121 a 140 = 20 basi;
14 GC, 6 AT = 56 + 12 = T melting 68°C
2° reverse: da b. 520 a 498 = 23 basi;
11 GC, 12 AT = 44 + 24 = T melting 68°C
amplicone = 400 bp (da 121 a 520)
Il gene ? andare su nucleotide dalla banca dati:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed
esercizio II parte
PCR inversa: dopo aver analizzato per Southern la regione si sceglie
l’enzima di restrizione per avere un frammento di circa 4-6 kb
scelta dei primers: 2° e 1° primer forward invertiti (rev. compl.) del
1° amplicone
1° primer rev inv. e 2° da b. 961 a 982
cerca la sequenza in banca dati su sito NCBI:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi
nucleotide blast: UniGene infoGeoGene info Homo sapiens chromodomain
helicase DNA binding protein 2 (CHD2), transcript variant 1, mRNA;
Length=9374
segnare i primers
1
61
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
901
961
1021
CTCAGAGCTG
CCCTGCCTTT
CCGTAGCCCC
AAAAGCAGCT
AGCCCAGGTC
CTCCTAATGA
TTGACCAGTT
TTGCCTTTAT
GTTTGGACAT
ATTCCCCCTC
AAGAGGAGGA
CGGGTTCAGA
ATGGCAGCGA
AATCAGCAGG
AGAAGGAACG
TCAGGCGGTC
GTAGCGGGTC
AAAAATGGAA
GGAAGGAGGC
GCCTCACTTT
CTGCCTTTCC
TTTAGGAGCT
GTTGTTTTTT
GGTTTTTTTT
AACATATTTG
TTTTAATTAT
ACTACATGGA
CCCCTTAATA
CAGTTCGCTA
CTCAGGCAGT
GTCGAACAGC
TTCCAAATCC
GATAGCTGAT
AAACCGAAGC
TGAGAGTGGG
ACAGGAACCC
TCTAGATGGC
ACGCAACTTT
TAGGGACTTA
TTCTTTTCGT
CCAGCTTAGA
CTTTCGGACC
AGGGTTATTT
TTGGGATCTG
TCAGTAAATA
TTTAAGAATT
CACAGCAATG
CAGTCGGAAA
AGCTCTGAAT
CAGCCAGTCC
GTGAAGAAGA
AGACAAGAAC
AGCCCAAAAA
TCAGAAGATG
GGCTGTGCCT
CCCTAACTTT
CTGGGGTCGA
GCCTTGTTGG
AGCCATGGCG
TGTTTTAGTA
TATTTATTTT
ATATTTTTCT
CCTGGGCACA
AAAAGATGAT
CATCGAGTCA
GTGAGCAGGG
CTTCTGAGAG
TCCCAGAAGC
TGTGGGAAGA
CATCGCGATT
GAAGAGGCCA
AACAGGAACA
TAGAGAGAGC
CGGGCAGCCT
TTCGAACCTT
AAAGAAGCAG
CACCTCCATT
TTAATTATTG
TCGTTTTTTA
ACTAGTAGAT
GGACTTCAAA
GAGAAATAAG
CTCAGCCTCT
AAGTGATCCA
TCAGTCGGAA
CAAAGAGAAG
ATATCCTGAT
TAATATTAAG
GAGGCAGCTG
AGGCACCAGT
GCGCTCTGCT
CAGGGGGCCC 1° frw; 2 inv
TTTTTGGGAG 2° frw; 1 inv
CCGTACTGAG
TTTGTGCGCT
CTTTATTTTT
ACGGAGGATT
AGGACTCTTG
GCAAACACAG 2° rev
GACAAAAGCC
GAAGAAGCTT
GGAAGTGGAC
TCTGAGAGCG 1° rev; 1° inv
CCAGCCTCTA
GTTTATGGGG
GAAGAGGCAA
AAAAAACAAG 2° inv
GCAGAGAGTG
inv = primer per PCR inversa che ha due coppie di primers per poter fare una PCR nested,
quelli al 5’ della seq. devono essere complementary-reverse e quelli al 3’ sono uguali alla
sequenza stampo data
primers con code!
la regione di annealing deve essere efficiente sul 3’
5’
3’
la coda verrà
inserita e dal ciclo
successivo fara
parte
dell’amplicone
5’
3’
templato
amplicone con coda incorporata
5’
3’
se i primers hanno la coda
5’
3’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
3’
alla polimerase importa solo che il 3’ sia appaiato,
però la coda del primer sarà incorporato e farà parte
dell’amplicone
è la stessa cosa che succede in una amplificazione
aspecifica in cui solo il 3’ del primer (specifico) trova
omologia di sequenza e farà amplificare un prodotto non
specifico
5’
Mutagenesi tramite uso di primers modificati
Per fare avvenire una delezione o inserzione si utilizza il metodo a tre passaggi
(esempio per inserzione).
pr.ext. frw.
3’
5’
pr.int. frw.
a
b
5’
3’
pr.ext. rev.
pr.int. rev.
I
3PCR indipendenti
pr.ext. frw.
a
I e II PCR indipendenti
pr. int. rev.
II
pr.ext. frw.
III
a
b
pr.int. frw.
inserzione
(
b
)
(
)
pr.ext. rev.
pr.ext. rev.
per inserire la sequenza mutata nella sequenza voluta o si seleziona un ricombinante dopo
trasfezione o si inserisce direttamente la sequenza mutagenizzata con enzimi di restrizione.
Mutagenesi con PCR in tre passaggi
DNA mitocondriale bovino acc. N. V00654, gi 12800 con 16338 bp
L8014 (external forward primer) 5’-ACCCATTGTCCTTGAGTTAGT-3’,
H8393 (external reverse primer) 5’-GAGGGTTACAAAGCGATTGCT-3’,
H8242 (internal reverse primer)
5’-GAGATCTGCCGTACAGGCCTAGAATATTTTTGTTGGTGTCAGT-3’
and L8283 (internal forward primer)
5’-CTAGGCCTGTACGGCAGATCTCAAAACAAAACACCCCTTGAGA-3’,
III PCR per estensione della regione sovrapposta
I primers interni L8283 e H8242 hanno una coda al 3’-terminale che è stata usata
per introdurre una inserzione di 22 bp (parte sottolineata nella sequenza del
primer). La complementarietà sta nell’inserzione tra il 3’ dell’int. frw. primer ed il
5’ dell’int.rev.primer
L’inserzione permette di discriminare per peso molecolare la sequenza
bovina da quella del nuovo costrutto usato nella PCR competitiva come
riferimento con varie diluizioni a partire da una concentrazione nota.
Il competitore sintetico è stato clonato nel vettore pBlueScript KS+ della ditta
Stratagene (La Jolla, Ca.CA USA).
Complementarietà delle code
H8242 (internal reverse primer)
5’-GAGATCTGCCGTACAGGCCTAGAATATTTTTGTTGGTGTCAGT-3’
and L8283 (internal forward primer)
5’-CTAGGCCTGTACGGCAGATCTCAAAACAAAACACCCCTTGAGA-3’
seq mitoc. spec
coda per appaiamento
5’-CTAGGCCTGTACGGCAGATCTCAAAACAAAACACCCCTTGAGA- 3’
3’…………TTTTATAAGATCCGGACATGCCGTCTAGAG
seq mitoc. spec
5’
templato
3’ int rev pr
5’
5’
3’
5’
3’
5’
int frw pr 3’
3’
templato
5’
appaiamento PCR I + II
3’
5’
5’
3’
5’
3’
“elongation” solo di due filamenti
3’
5’
5’
possible
3’
3’
possible
3’
impossible
mission impossible
X
5’
5’
5’
X
impossible
3’
inserzione
di un frammento f in un
amplicone (3 steps = 3 passaggi)
PCR I = a
PCR II=b
5’
f
frw
frw
primer frw e rev
interni sono contigui
per poter inserire la
sequenza f
b
a
f
rev
annealing di 2 PCR
x
rev
5’
f
elongation 3’
a
b
f
3’ elongation
inserzione
y
b
frw
a
f
rev
delezione di un frammento b da un amplicone
frw
frw
1
a
primer 1 e 2 interni
iniziano e finiscono
sui limiti della
sequenza da
deletere
rev
oredil 3’
1
2
rev
b
delezione
a
3’libero
2
c
a
annealing II PCR
c
b
1
a
2
1
1
22
2
c
c
sostituzione in un amplicone in 3 passaggi
5’
II PCR separate
Ia
b
z
II c
3’
5’
z
annealing III PCR
5’
ed “extension”
5’
z
a
3’
3’
c
5’
z
III
PCR finale
5’
3’
a
z
c
3’
5’
giunzione di due frammenti distanti
la procedura è la stessa di quella della delezione, la
differenza consiste nella collocazione del secondo
amplicone che si vuole legare al primo che può essere
ovunque nel genoma,
unica condizione necessaria è la presenza delle code
complementari dei primers che è obbligatoria, basta
scegliere quale sequenza va al 5’ e quale al 3’ del nuovo
amplicone artificiale
x
y
quali code sono produttive ?
A) code compl. rev
x
5’
aa 3’
5’
cc
gg
3’
y
tt
aa
aa
3’
tt 5’
gg 3’
cc
x
5’
cc 5’
ordine del prodotto : x - y strand +/-
5’
3’
aa 3’
x
B) code rev.
perchè non funge?
cc
3’cc
gg
aa
tt 5’
y
5’
5’
cc 3’
y
aa
3’
tt
gg 5’
altre code
code = al 3’ e 5’
aa
x
5’
5’ cc
si
cc
gg
3’
aa
y
3’
tt
no
tt
5’
gg
5’
3’
verso = x - y strand +/+ dirette
code invertite al 5’
5’
tt
gg
cc
3’
aa
x
5’ cc
no
3’
5’
aa
tt
si
gg
3’
verso = y - x strand +/- invertite
y
3’
5’
Applicazioni dell’ultimo
metodo
Questo terzo metodo che abbiamo visto, può essere utilizzato
sia per ottenere inserzioni o sostituzioni, ma anche delezioni
però con l’inserzione di un nuovo frammento di lunghezza
diversa, anche molto diversa per avere una regione di
omologia per l’appaiamento ed “elongation”. Dipende da dove
si fanno partire i primers interni con la coda. In realtà si
possono giuntare anche frammenti non limitrofi per costruire
geni di fusione. Si possono legare esoni di geni diversi come
per esempio esoni di un gene a cui attaccare la GFP o Lac Z.
riepilogo
RT-PCR
nested PCR
mutagenesi