SIFIPAC PADOVA 2009
MESSAGGI DELL’INGEGNERIA DEI
TESSUTI: I SOSTITUTI CUTANEI
Giovanni Abatangelo
Unità di Ricerca sulla Ingegneria dei Tessuti
Dipartimento di Istologia, Microbiologia e
Biotecnologie Mediche
Università di Padova
RICOSTRUZIONE DI TESSUTO/ORGANO
In vitro
Ingegneria
dei tessuti
In vivo
Induzione
rigenerativa
INGEGNERIA DEI TESSUTI
L’ingegneria dei tessuti nasce come tentativo
di costruire tessuti ed organi al di fuori del
corpo umano
PRESUPPOSTO
La quasi totalità delle cellule animali possono
essere coltivate in laboratorio
Ingegneria Tessutale
Elementi base
Componente
biologica
Supporto
tridimensionale
Cellule e/o fattori
molecolari
Biomateriale
Ingegneria Tessutale
Componente biologica
Cellule:
differenziate
indifferenziate
La cute
CON L’INGEGNERIA TISSUTALE E’ OGGI POSSIBILE
OTTENERE, A PARTIRE DA UNA PICCOLA BIOPSIA,
TESSUTI DA TRAPIANTARE SU LESIONI CUTANEE
PELLE ARTIFICIALE
Di solito, una
spontaneamente.
ferita
cutanea
guarisce
In alcuni casi, però non si può attendere o non è
facile ottenere il ripristino spontaneo:

vaste ustioni ( se non si interviene c’è rischio di
morte)
ulcere croniche (dismetaboliche, vascolari, diabetiche
ecc.)
ulcere da decubito o da compressione
vaste e profonde ferite chirurgiche

PELLE ARTIFICIALE
L’auto-trapianto di lembi di cute rappresenta la
soluzione migliore per la copertura di ferite
difficili.
quando ciò non è possibile (vaste ustioni, ferite
croniche, ecc.), bisogna ricorrere alla pelle
artificiale
da una piccola biopsia di cute del paziente (2x2
cm) si può ottenere fino ad 1 mq di epidermide e
di derma.
DERMA ARTIFICIALE
Grazie alla tecnologia dei polimeri oggi
disponiamo di biomateriali tridimensionali
all’interno dei quali abbiamo coltivato cellule
dello stesso paziente (fibroblasti) che producono
un tessuto simile al derma.
con questa tecnica siamo in grado di trattare
numerose lesioni cutanee che vanno dalle vaste
ustioni alle ulcere croniche e a quelle chirurgiche
Cellule Staminali dell’epidermide
• L’epidermide
è
un
epitelio dinamico che si
rinnova continuamente
per tutta la vita
• Il suo turnover è di circa
7 giorni nell’uomo.
• Questo rapido turnover
nell’adulto richiede la
presenza di stem cell
capaci di dare origine a
cellule mature
Cellule Staminali dell’Epidermide
Tre categorie di cheratinociti con capacità
proliferativa:
1. OLOCLONI
2. MEROCLONI
3. PARACLONI
Cellule Staminali dell’epidermide
IL PASSAGGIO DA HOLO- A MERO- E A
PARACLONE E’ IRREVERSIBILE
Solo gli olocloni sono vere stem cell, in virtù
della loro capacità di auto rinnovamento
Cellule Staminali dell’epidermide
Esterno
Lo strato basale, contiene le
cellule proliferanti che migrano
verso gli strati superiori dove
vanno incontro a
differenziamento che porta alla
formazione di cellule terminali
prive di nucleo.
Basale
Epidermide
Cellule Staminali dell’epidermide
Cellule Staminali dell’epidermide
Sono presenti anche tra i cheratinociti
dellla guaina del bulbo pilifero
Come si isolano le cellule staminali
dell’ epidermide
Cellule Staminali dell’epidermide
I marcatori sono:
•
•
•
•
ß1 integrine
p63
keratins 19 and 15
non-cadherin-associated ß-catenin
Ricostruzione in vitro di un
equivalente epidermale
• Tecnica di Rheinwald &
Green
• dopo 14 – 21 giorni
2cm2
2m2
Project BE 96-3524 - Artificial skin
Recenti conquiste
dell’ingegneria tessutale
… siamo all’inizio della fine o alla fine
dell’inizio ….
Recenti conquiste
dell’ingegneria tessutale
1. EVOLUZIONE
DELLE
METODICHE
COLTURA CELLULARE IN VITRO
2. EVOLUZIONE DEI BIOMATERIALI
DI
1. EVOLUZIONE DELLE METODICHE DI COLTURA
CELLULARE IN VITRO
PROTESI VASCOLARI
Colture in monostrato
Colture su matrici tridimensionali
Co-colture di differenti
popolazioni cellulari su matrici
tridimensionali
TESSUTO ADIPOSO
AOKI S et al. Coculture of
endothelial cells and
mature adipocytes actively
promotes immature
preadipocyte development
in vitro. Cell Struct Funct.
2003 Feb;28(1):55-60
NICOLAS L’HEUREUX et al.
Human tissue-engineered blood
vessels (28 wk) for adult
arterial revascularization. Nat
Med. 2006 Mar;12(3):361-5.
SOSTITUTI CUTANEI
ABATANGELO G et al. In
vitro reconstruction of an
endothelialized skin substitute
provided with a microcapillary
network using biopolymer
scaffolds. FASEB J. 2005
Sep;19(11):1546-8.
SOSTITUTI CUTANEI
UN TIPO CELLULARE
CHERATINOCITI
FIBROBLASTI
LAMINE DI CHERATINOCITI
• La sopravvivenza cellulare è direttamente correlata con
le condizioni del letto ricevente.
• In particolare, la presenza di uno strato dermico ne
incrementa la sopravvivenza
Fibroblasti
ECM
Micro-vascolarizzazione
Primo “step”: construtto cutaneo doppio strato
Due tipi cellulari
La co-cultura di fibroblasti e cheratoniciti ha dimostrato la
possibilità di ottenere un construtto cutaneo doppio strato,
epidermico e dermico.
a
7 days
7 giorni
di co-cultura
b
14 giorni14didays
co-cultura
COLTURA COMPOSITA DI
3 TIPI CELLULARI
FIBROBLASTI
CELLULE ENDOTELIALI
CHERATINOCITI
PELLE ENDOTELIALIZZATA
Progressiva
formazione di strutture
microcapillari ad anello
Progressivo
inspessimento dello
strato epidermico (Ab
anti-pancitokeratine)
Immunolocalizzazione del
CD31 a livello delle strutture
microcapillari ad anello.
Strutture microcapillari evidenziate dalle cellule endoteliali
positive al vWF (21 giorni di coltura composita)
Immunolocalizzazione dello strato epidermico e delle strutture
micro-capillari.
Cellule positive Antikeratine e vWF
Co-localizzazzione del vWf e della
laminina a livello dei capillari
Il trattamento delle perdite di sostanza cutanea di
diversa eziologia con un sostituto cutaneo
provvisto di una rete microcapillare dovrebbe
favorire l’integrazione in vivo del sostituto ed
incrementare la velocità e qualità della
guarigione.
Ingeneria dei tessuti in vivo
Sfrutta la possibilità di utilizzare biomateriali “biomimetici” in
grado di orchestrare gli eventi rigenerativi direttamente in vivo,
senza pre-trattamenti cellulari o farmacologici in vitro.
Ha come obiettivo principale quello di sviluppare una protesi
biocompatibile, con caratteristiche meccaniche idonee a
mantenere le condizioni fisiologiche di flusso, fintantoché non
sono terminati i processi di rimodellamento cellulare che
porteranno alla rigenerazione di un nuovo tratto arterioso.
La possibilità di avere un biomateriale in grado di essere
rimodellato in vivo rappresenta l’evento fondamentale per
ottenere una protesi vascolare ideale.
MEDICINA RIGENERATIVA
Induzione in vivo di un nuovo organo o tessuto con le stesse proprietà
fisiologiche dell’organo perduto.
La medicina rigenerativa è il nuovo obiettivo della ingegneria dei tessuti
Scaffold riassorbibile
In grado di orchestrare in vivo gli eventi rigenerativi
Che viene completamente riassorbito a rigenerazione avvenuta
Ingeneria dei tessuti in vivo
Sfrutta la possibilità di utilizzare biomateriali “biomimetici” in
grado di orchestrare gli eventi rigenerativi direttamente in vivo,
senza pre-trattamenti cellulari o farmacologici in vitro.
Ha come obiettivo principale quello di sviluppare una protesi
biocompatibile, con caratteristiche meccaniche idonee a
mantenere le condizioni fisiologiche di flusso, fintantoché non
sono terminati i processi di rimodellamento cellulare che
porteranno alla rigenerazione di un nuovo tratto arterioso.
La possibilità di avere un biomateriale in grado di essere
rimodellato in vivo rappresenta l’evento fondamentale per
ottenere una protesi vascolare ideale.
Non sono stati ancora sviluppati sostituti arteriosi di 2 mm di diametro con
adeguate caratteristiche meccaniche per ottenere risultati a lungo termine.
John D. Kakisisa, Christos D. Liapis, Christopher Breuer and
Bauer E. Sumpio. Artificial blood vessel: The Holy Grail of
peripheral vascular surgery. Journal of Vascular Surgery; Volume
41, Issue 2 , February 2005, Pages 349-354
Scopo della nostra ricerca è mettere a punto una
protesi vascolare riassorbibile in grado di guidare in
vivo la rigenerazione di un’arteria di piccolo
diametro.
MEDICINA RIGENERATIVA
Induzione in vivo di un nuovo organo o tessuto con le stesse proprietà
fisiologiche dell’organo perduto.
La medicina rigenerativa è il nuovo obiettivo della ingegneria dei tessuti
Scaffold riassorbibile
In grado di orchestrare in vivo gli eventi rigenerativi
Che viene completamente riassorbito a rigenerazione avvenuta
Abbiamo utilizzato un biomateriale che avesse la sola funzione di
guida temporanea per i processi di rigenerazione e
rimodellamento vascolari. In grado quindi di promuovere ed
ordinare la rigenerzione della parete vascolare nel sito anatomico
di impianto.
IN VIVO TISSUE
ENGINEERING
APPROACH
30 Wistar rats
“INTELLIGENT”
TEMPORARY VASCULAR
CONDUIT
ABAT: Artery Bio-regeneration Assit Tube
HYAFF 11™
Length: 1 cm
Diameter: 2mm
L’acido ialuronico è ben conosciuto per la sua biocompatibilità,
biodegradabilità e per la sua capacità di promuovere l’adesione e
proliferazione delle cellule endoteliali.
Remuzzi A, Mantero S, Colombo M, Morigi M, Binda E, Camozzi D, Imberti B. Vascular smooth
muscle cells on hyaluronic acid: culture and mechanical characterization of an engineered
vascular construct. Tissue Eng. 2004;10(5-6);699-710.
Turner NJ, Kielty CM, Walker MG, Canfield AE. A novel hyaluronan-based biomaterial (Hyaff11) as a scaffold for endothelial cells in tissue engineered vascular grafts. Biomaterials.
2004;25(28);5955-5964.
Tonello C, Vindigni V., Zavan B, Brun P., Abatangelo S., Abatangelo G. and Cortivo R. In vitro
reconstruction of an endothelialized skin substitute provided with microcapillary network using
biopolymer scaffold. FASEB J. 12.07.05, 2005 (on line).
Le protesi tubolari (HYAFF-11™ tubules, 2 mm diameter, 1 cm length)
sono state innestate a livello dell’aorta addominale di 30 ratti.
1 cm
1 cm
1 cm
b
c
d
e
ABAT
1 cm
a
Impianto della protesi
2 mm
2 cm
ABAT
AORTA ADDOMINALE
5 GIORNI
e
vWF
E’ evidente la positività del lume
interno, a marcatori quali vWF
e VEGFR-2 per le cellule
endoteliali ed al CD34 per le
cellule progenitrici.
f
VEGFR-2
g
CD34
Cellule Endoteliali Progenitrici
Circolanti
↓CD133+/CD34+/VEGFR-2+
15 GIORNI
• Cellule positive per il vWF tapezzano il nuovo lume vascolare
• Le cellule endoteliali sono anche evidenziate dalle indagini di microscopia
elettronica
30 GIORNI
Il biomateriale è ancora integro ed il nuovo tessuto vascolare scorre dall’anastomosi
prossimale a quella distale, sia lungo la superficie interna che esterna della protesi.
A 180 giorni dall’impianto il
biomateriale
è
completamente
riassorbito.
• La nuova arteria mantiene la propria struttura e
le proprietà meccaniche. Il lume è pervio senza
segni di dilatazione o collasso.
• Il biomateriale è assente e sostituito dal nuovo
tessuto avventizio
Conclusioni
Seguendo i principi della ingegneria dei tessuti è possibile
ottenere un sostituto cutaneo composito, originato dalla
co-cultura di differenti popolazioni cellulari autologhe.
Il biomateriale a base di acido ialuronico è risultato essere
un valido substrato per supportare la crescita e la
differenziazione di cheratinociti, fibroblasti e cellule
endoteliali.
Conclusioni
Il trattamento delle perdite di sostanza cutanea di diversa
eziologia con un sostituto cutaneo provvisto di una rete
microcapillare dovrebbe favorire l’integrazione in vivo del
sostituto ed incrementare la velocità e qualità della
guarigione.
Conclusioni
Per quanto riguarda la rigenerazione in vivo è possibile
guidare i processi biologici utilizzando opportuni scaffolds.
Protesi vascolari di piccolo calibro pronte da utilizzare
senza l’utilizzo di cellule o precondizionamenti biochimici;
Protesi che agiscono come semplici guide biologiche e che
consentono alle cellule mesenchimali vascolari di scorrere
lungo il supporto senza infiltrarlo;
Protesi in grado di essere degradate completamente dopo 4/5
mesi senza provocare alcun effetto collaterale.
Le cellule possono essere isolate da un frammento di
tessuto e separate in base alle loro caratteristiche
Prelievo e selezione della componente cellulare
CHERATINOCITI
FIBROBLASTI
CELLULE ENDOTELIALI
ADIPOCITI
…
Hanno caratteristiche
differenti a seconda della
sede anatomica di prelievo
NICCHIE BIOLOGICHE
CHERATINOCITI
Cellule staminali ed ingegneria dei
tessuti
Prendiamo in esame alcuni casi applicativi.
Il primo è la rigenerazione della cute
A Padova la chirurgia ricostruttiva della cute e' gia' attiva da
vent'anni e adesso stiamo sperimentando la possibilità di
guidare in vivo la rigenerazione di un’arteria e la costruzione di
tessuto adiposo da cellule di grasso, al fine di modificare la
forma umana.
In un futuro non lontano altri tessuti potranno essere riparati.
Per esempio i tendini della mano, i muscoli, o interi organi
un'operazione ad oggi impossibile.