UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PARMA
Facoltà di medicina e chirurgia- Facoltà di veterinaria- Facoltà di farmacia
Corso di Laurea Specialistica in Biotecnologie per la Salute
ISOLAMENTO DI CELLULE
STAMINALI MESENCHIMALI DA
SANGUE DEL CORDONE
OMBELICALE
Laureando: Arianna Beduschi
Relatore: Prof. Roberto Sala
Tutore: Dott. Stefano Negri
CELLULE STAMINALI MESENCHIMALI
Cellule staminali adulte multipotenti
Fonti delle MSCs
Capacità di aderire a
superfici di plastica
Capacità di
differenziare:
Espressione di markers specifici
 POSITIVI: CD90; CD73; CD105; CD44;
CD29; HLA-ABC
 NEGATIVI: CD34; CD45; CD14; HLA-DR
Adipociti; osteociti;
cellule muscolari;
Altro:neuroni,
epatociti…
FONTI DI MSCs
Agoaspirato midollare
Placenta
Tessuto adiposo
Sangue e tessuti cordonali
IL SANGUE CORDONALE COME FONTE DI
MSCs
 tessuto di scarto
 presenza di staminali mesenchimali
ed emopoietiche
 MSCs da UCB hanno le stesse
caratteristiche di quelle isolate da
midollo
 uso autologo ed allogenico
 dibattito tra ricercatori
sull’accessibilità alle MSCs: difficoltà
d’isolamento
 meno MSCs rispetto midollo e
Wharton’s jelly
Obiettivo:
tutelare sempre il diritto della madre a conservare il proprio
sangue del cordone ombelicale per uso autologo e al
tempo stesso garantire la possibilità di donare tale sangue
per uso allogenico
Arrivo sacca sangue
cordonale
Calcolo del volume netto di sangue cordonale raccolto:
• Peso lordo sacca – peso sacca ( tara = 28 g) = peso netto sacca
• Peso netto sacca / peso specifico sangue (1.05 g/ml) = volume sacca con
anticoagulante
• Volume sacca con anticoagulante – volume anticoagulante (20 ml) =
volume netto sangue cordonale
Aliquota per la ricerca: attenzione a NON pregiudicare mai
la conservazione del sangue raccolto sia per uso autologo
che allogenico!
Prelievo 0,5 ml per emocromo
e analisi multiparametrica al
citofluorimetro
Analisi multiparametrica al
citofluorimetro:
• CD 34 – APC
• CD 45 – PERPC
• CD 90 – FITC
CENTRIFUGAZIONE IN
GRADIENTE DI DENSITÀ
CON HISTOPAQUE-1007
• CD 73 - PE
Cellule
MSCs-like
Plasma
Sangue intero
Cellule
mononucleate
Histopaque
Eritrociti
Histopaque
Cellule mononucleate
SELEZIONE NEGATIVA DELLE CELLULE
Utilizzo di biglie paramagnetiche rivestite di Ab CD34.
Selezione negativa delle MSCs in quanto tali cellule non esprimono CD34.
COLTURE CELLULARI
IMDM + 10%FBS + bFGF 10ng/ml+ ITS+ 50 mg/ml
I dati forniti dall’emocromo e dall’analisi multiparametrica al
citofluorimetro sono stati utilizzati per calcolare la % di MSCs sulla
frazione di cellule mononucleate nel sangue e dopo estrazione
con Histopaque.
La procedura di gating applicata è stata:
RISULTATI
sample
% MSCs /cell mono
nel sangue
% MSCs/cell mono
dopo estrazione Histopaque
Cordoni di peso superiore a 90 g:
Cord 10
0,058
0,074
Cord 11
0,078
0,040
Cord 12
0,119
0,014
Cord 13
0,152
0,132
Cord 15
0,010
0,140
0,083 ± 0,055
media
0,080 ± 0,055
Cordoni di peso inferiore a 90 g:
Cord 18
0,078
0,382
Cord 19
0,029
0,306
Cord 20
0,092
0,177
media
0,066 ± 0,033
0,288 ± 0,104
RISULTATI
Efficienza di estrazione : (42,19 ± 16,37) %
RISULTATI
Relazione tra volume di sangue raccolto e numero MSCS
50000
40000
30000
20000
10000
0
20-40 ml
41-60 ml
61-80 ml
81-100 ml 101-120 ml 121-140 ml
Numero MSCs nel sangue intero
11355
10050
22585
39310
3061
Numero MSCs dopo Histopaque
8606
6825
6385
1511
11220
ml sangue raccolto
All’aumentare del volume di sangue cordonale raccolto aumenta
la quantità di MSCs-like presenti.
In proporzione la resa d’estrazione con Histopaque rimane la
stessa.
RISULTATI
numero MSCs
Relazione tra le ore trascorse dalla raccolta e il
numero di MSCs
80000
60000
40000
20000
0
0-4 H
5-12 H
13-24 H
sangue intero
70833
12893
24951
estratto con
Histopaque
5874
10448
5489
ore dalla raccolta
La percentuale di MSCs-like diminuisce nel sangue intero con
l’aumentare del tempo trascorso tra raccolta e lavorazione.
I tempi migliori per l’estrazione con Histopaque sono tra 5 e 15 h.
RISULTATI
Si ottengono colture dal 13% dei cordoni analizzati, percentuale
che sale al 33,3 % se si considerano solo i cordoni di peso > 90g.
CONCLUSIONI
 L’analisi multiparametrica al citofluorimetro dimostra la presenza di
cellule MSCs-like sia nel sangue cordonale che nella frazione di cellule
mononucleate da esso ottenute.
 Con l’estrazione mediante centrifugazione in gradiente di densità non si
perdono MSCs-like, anzi in alcuni casi aumenta la %.
 All’aumentare del volume di sangue raccolto aumenta la % di MSCs-like.
 Si ottengono colonie di MSCs-like solo da cordoni molto abbondanti,
generalizzando con volume > 40 ml.
 I tempi migliori per la lavorazione del sangue cordonale sono tra 5 e 12
ore MA sono state ottenute colonie di MSCs-like da un cordone lavorato +
di 24 h dopo la raccolta.?
 La coltura di MSCs-like è difficoltosa.
Cautela nel generalizzare i nostri risultati perché ottenuti su un
ristretto numero di cordoni e su volumi ridotti in alcuni casi:
Infatti sempre, in ogni caso, sono stati tutelati i diritti della madre
e del neonato e la possibilità di donare il sangue cordonale per
uso allogenico.
Probabilmente se ci fosse la possibilità di lavorare tutto il
sangue di una sacca idonea al congelamento la % di cordoni
ombelicali da cui si ottengono colonie di cellule MSCs-like
aumenterebbe.