Bioinformatica
Marin Vargas, Sergio Paul
2013
Wikipedia: La bioinformatica è una disciplina scientifica dedicata alla risoluzione
di problemi biologici a livello molecolare con metodi informatici.
La bioinformatica è la disciplina scientifica che cerca di risolvere problemi
biologici mediante l’elaborazione informatica dell’informazione proveniente
diretta o indirettamente da essere viventi.
Tipi di informazione:
Sequenze genomiche (DNA genomico:
genomi, esomi o alcune regioni
particolari del genoma).
Sequenze proteiche (cDNA cioè DNA
retrotrascritto a partire da un mRNA).
Strutture 3D di proteine (NMR,
Cristallografia), biologia strutturale.
Immagini (RX, TAC, MRI, US, ecc).
Concentrazioni di particelle nel
sangue.
Informazione di interazione tra
molecole (systems biology).
Informazione evoluzionistica.
Pulsazioni, respiri, battiti cardiaci,
ecc...
La genomica è una branca della biologia molecolare che si occupa dello studio
del genoma degli organismi viventi. In particolare si occupa della struttura,
contenuto, funzione ed evoluzione del genoma. È una scienza che si basa
sulla bioinformatica per l'elaborazione e la visualizzazione dell'enorme quantità di
dati che produce.
Estrazione e/o cattura di DNA da essere viventi.
Sequenziamento del DNA con tecniche all’avanguardia come NGS
(Next Generation Sequencing).
Assemblaggio di genomi a partire da milioni di frammenti di DNA.
Ri-sequenziamento di genomi.
Allineamento di frammenti di DNA a un genoma di riferimento.
Annotazione di genomi.
Annotazione funzionale di geni all’interno di un genoma.
Analisi di espressione genica mediante sequenziamento dei
trascritti (RNA-Seq).
GWAS (Genome Wide Association Studies).
Analisi di varianti tra genomi (Variant calling o Chiamata delle
varianti).
…
Ottimizzazione del protocollo bioinformatico
per l’annotazione di geni codificanti proteine
in genomi complessi
Marin Vargas, Sergio Paul
2012
Con l’avvento del sequenziamento NGS a
costi sempre più contenuti, il numero di
genomi sequenziati si sta incrementando
considerevolmente.
Lo scopo di conoscere la sequenza
genomica è principalmente indirizzato a
capire la funzionalità dei geni.
In passato l’annotazione di un genoma
era molto dispendiosa.
Oggi con le nuove tecnologie, è diventata
alla portata di un singolo laboratorio.
Rimane comunque un compito molto
impegnativo.
Annotare un genoma significa conoscere la
localizzazione, la struttura e la funzionalità di tutti gli
elementi che compongono l’intero genoma:
• Geni codificanti proteine
• Geni non codificanti proteine
• Elementi regolatori
• Elementi ripetuti
• Pseudogeni
• Altri elementi
L’annotazione dei geni codificanti proteine, viene suddivisa in:
Annotazione funzionale, consiste nel caratterizzare ogni
singolo gene, assegnando una funzione biologica a ogni proteina
codificata dal gene stesso.
Annotazione genica o semplicemente annotazione, consiste
nel definire all’interno del genoma:
• La localizzazione di ciascun gene.
• La struttura di ciascun gene (esoni,
CDS, UTR).
• Gli eventuali trascritti alternativi.
Cap
5’
3’ Poly-A
AAAAAA
mRNA maturo
UTR
CDS
UTR
5’
3’
Esone 1
3’
Esone 2
Esone 3
5’
DNA
ATG
STOP!
Un gene codificante proteine è composto da diversi elementi:
Esone: regione che viene mantenuta dopo la maturazione.
Introne: regione che viene eliminata durante la maturazione.
mRNA: RNA maturo, composto da esoni.
CDS: regione codificante dell‘mRNA.
UTR: regione non tradotta dell’mRNA.
Metodi basati sull’allineamento delle
evidenze sperimentali.
Metodi basati sulla predizione genica ab
initio.
Metodi basati sulla predizione genica ab
initio guidata da evidenze sperimentali.
Metodi basati sul confronto tra genomi.
5
Si possono utilizzare diverse evidenze sperimentali, che
opportunamente elaborate e allineate al genoma
permettono di identificare le regioni codificanti proteine:
• cDNA full-length: sequenze di RNA maturi (mRNA)
retrotrascritti a cDNA, quindi completo di UTR e CDS.
• EST (Expressed Sequence Tags): brevi frammenti parziali, tra
400-800 bp, di mRNA retrotrascritti a cDNA.
• Proteine omologhe: sequenze aminoacidiche corrispondenti a
proteine omologhe di organismi evolutivamente vicini.
• Tiling arrays: microarray con sonde equamente spaziate su
tutto il genoma, permettono l’identificazione di regione
espresse mediante l’ibridazione di campione marcati.
• MPSS: Massively Parallel Signature Sequencing, piattaforma
che analizza il livello di espressione e identifica una regione di
17-20 bp degli mRNA tramite sequenziamento.
• RNA-seq: frammenti di cDNA di lunghezza tra 50-150 bp che
derivano dal sequenziamento shotgun di un intero trascrittoma.
Sono dei brevi frammenti di lunghezza tra 400-800 bp di cDNA
ottenuto dalla retrotrascrizione di un frammento di RNA maturo.
Dalla sequenza proteica delle proteine si può risalire alla
sequenza nucleotidica e quindi alla zona codificante (CDS) del
gene che l’ha codificata.
Sono sequenze di lughezza tra 50-150 bp che derivano dal sequenziamento shotgun di un
intero trascrittoma, cioè dalla retro-trascrizione di tutto l’RNA in cDNA di un particolare
momento cellulare, poi spezzato e sequenziato con tecnologie NGS.
Per identificare le regioni codificanti i predittori utilizzano algoritmi e modelli
matematici specifici che utilizzando informazione intrinseca dell’organismo
analizzato cercano di identificare la localizzazione e la struttura dei geni.
Sensori di segnale (signal sensors): permettono di identificare le giunzioni
esone-introne e le estremità delle regioni codificanti.
Sensori di contenuto (content sensors): permettono di identificare le
regioni codificanti di lunghezza variabile.
I predittori hanno bisogno di dati di esempio per imparare le caratteristiche
dell’organismo analizzato (dati di training) e dei dati di prova per valutare
l’accuratezza delle predizioni (dati di test).
Predittore
Augustus
Snap
GeneMark-ES
GeneID
FGenesh
Genescan
MZEF
mGene.NGS
Contrast
GrailExp
TwinScan/N-Scan
Training in Utilizzo di
Predizione di
Utilizzo di
Predizione
Predizione
locale per
EST e
Predizione
geni
RNA-Seq per
dei trascritti
degli UTR
ab initio
nuovi
Proteine per
la predizione
alternativi
eucarioti
genomi la predizione
SI
SI
SI
SI
SI
SI
SI
SI
SI
SI
SI
SI
SI
SI
SI
SI
SI
SI
SI
SI
SI
SI
SI
SI
NO
SI
SI
NO
NO
SI
SI
NO
SI
SI
NO
NO
SI
NO
SI
NO
SI
SI
SI
SI
SI
NO
NO
SI
NO
SI
NO
SI
NO
NO
NO
SI
NO
NO
SI
NO
SI
NO
SI
SI
SI
NO
SI
NO
NO
SI
NO
NO
NO
NO
NO
NO
SI
Predizione genica ab initio: utilizza dati di training che potrebbero non
essere rappresentativi di tutti i geni del genoma.
Evidenze sperimentali: non coprono mai tutto il genoma, quindi non
permettono l’annotazione completa di tutti i geni codificanti proteine.
I migliori metodi di predizione genica utilizzano una metodologia
ibrida tra predizione genica ab initio e l’utilizzo degli allineamenti delle
evidenze sperimentali:
cDNA
EST
Proteine
RNA-Seq
Creazione di un consensus utilizzando le evidenze
sperimentali e le predizioni geniche.
Ciascuna evidenza viene pesata dando un peso maggiore ai
dati sperimentali rispetto alle predizioni.
Principali programmi
di integrazione:
• Evidence Modeller
• JIGSAW
• GAZE
Basate su automazione di programmi di predizione e
allineamento esistenti.
Vantaggio: relativamente semplici da utilizzare.
Svantaggio: consentono un controllo limitato dei passaggi
intermedi dell’annotazione.
Pipeline di annotazione più utilizzate:
• PASA
• MAKER
L’ottimizzazione del protocollo bioinformatico
per l’annotazione dei geni codificanti proteine
in genomi complessi.
A questo scopo non verrà utilizzata una
pipeline automatica di annotazione ma,
attraverso la scelta di metriche adeguate,
verrà valutato ogni singolo passaggio
intermedio dell’annotazione in modo da
fornire una procedura ottimizzata sulla base
delle evidenze sperimentali a disposizione.
Genoma dell’organismo eucariote Vitis
vinifera, versione V1 PN40024 12X del
consorzio
French-Italian
Public
Consortium for Grapevine Genome, con
una dimensione di 487 Mb.
Motivi di questa scelta:
• Il genoma è disponibile.
• Ci sono dati sperimentali disponibili
(EST, 454, RNA-Seq, cDNA full-length).
16.054 contig di cDNA full-length prodotte dal consorzio FrenchItalian Public Consortium for Grapevine Genome
3752 cDNA
non ridondanti.
Rimozione delle sequenze con ORF non completa
3.436
sequenze.
Le 3.436 sequenze sono state suddivise in due gruppi in maniera
del tutto casuale:
• 936 sequenze di cDNA full-length
training.
• 2.500 sequenze di cDNA full-length
test.
EST:
• 2.713.343
sequenze
EST
pubbliche
(NCBI,
Sequenziamento 454 + banca dati del consorzio).
• Allineamento e generazione modelli genici con Gmap.
•
1.649.082 trascritti putativi ridondati (56.630 non
ridondanti).
Proteine omologhe:
• Allineamento al genoma delle sequenze proteiche di
tutto il database SWISSPROT utilizzando Blat, Blast e
Genewise.
•
22.355 trascritti putativi ridondanti (5.808 non
ridondanti).
RNA-seq:
• 114.726.580 reads RNA-seq sequenziati dal laboratorio
di genomica dell’Università di Verona (pool di 45
campioni provenienti da 15 tessuti e organi a diversi
stadi di sviluppo).
• Allineamento e generazione modelli genici con suite
Bowtie + Tophat + Cufflinks.
•
40.324 trascritti putativi ridondanti (17.444 non
ridondanti).
Statistiche generali degli allineamenti delle evidenze sperimentali
Statistiche generali
Numero di modelli genici allineati
Numero di modelli genici multi esonici
Media della lunghezza dei modelli genici
N50 della lunghezza dei modelli genici
Media del numero di esoni per modello genico
EST
56.630
19.485
1.034,12
2.257
3,30
Proteine omologhe
5.808
3.175
874,42
1.563
4,39
RNA-seq
17.444
17.366
2.236,89
2.751
6,75
Distribuzione della percentuale di sovrapposizione di nucleotidi tra allineamenti e riferimento
Ho scelto i seguenti programmi di predizione genica, nei quali è stato realizzato il training
con dati sperimentali di Vitis vinifera:
• Augustus: supporta suggerimenti da evidenze sperimentali.
• GeneID: supporta suggerimenti da evidenze sperimentali.
• SNAP: realizza solo predizione ab initio.
Sono state realizzate le seguenti predizioni:
• Augustus ab initio
• GeneID ab initio
• SNAP ab initio
• Augustus con suggerimenti RNA-seq
• GeneID con suggerimenti RNA-seq
I risultati delle predizioni sono state filtrati secondo:
•
•
Eliminazione di tutte le predizioni di geni monoesonici (predizioni meno affidabili rispetto alle
predizioni di geni multiesonici).
Eliminazione di tutte le predizioni di geni con lunghezza della regione esonica inferiore a 200 basi.
Statistiche generali delle predizioni ab initio
Statistiche generali
Numero di geni predetti
Media della lunghezza dei geni
N50 della lunghezza dei geni
Media del numero di esoni per gene
Augustus ab initio
30.510
1.122,73
1.455
4,44
GeneID ab initio
48.751
977,81
1.386
4,34
SNAP ab initio
64.431
1.020,27
1.563
6,14
Distribuzione della percentuale di sovrapposizione tra predizioni e riferimento
Statistiche generali delle predizioni guidate da evidenze sperimentali
Statistiche generali
Numero di geni predetti
Media della lunghezza dei geni
N50 della lunghezza dei geni
Media del numero di esoni per gene
Augustus con RNA-seq
26.694
1.134,61
1.437
4,74
GeneID con RNA-seq
52.245
1.060,43
1.536
4,30
Distribuzione della percentuale di sovrapposizione di nucleotidi tra predizioni e riferimento
Le statistiche generali da sole non consentono di valutare adeguatamente le
differenze tra le predizioni, si rende quindi necessario fare una valutazione
quantitativa dell’accuratezza.
Sensibilità (SN) ed Specificità (SP):
• Sensibilità misura quanto il predittore è in grado di fare predizioni.
• Specificità misura quanto il predittore predice in modo corretto.
Accuratezza (AC):
• AC = (SN + SP) / 2
Tre livelli d’indagine:
• Locus genico: misura la capacità
di rilevare la presenza di un locus.
• Regioni esoniche, misura la
capacità di distinguere tra esoni e
introni.
• Giunzioni esone-introne, misura
la capacità di predire in maniera
corretta la struttura dei geni.
Confronto degli allineamenti e delle predizioni contro il dataset di riferimento (loci genici)
Evidenze
Sensibilità
Specificità
Accuratezza
EST
0,5680
0,6428
0,6054
Proteine omologhe
0,1872
0,6047
0,3960
RNA-seq
0,6140
0,7362
0,6751
Augustus ab initio
0,4612
0,5644
0,5128
GeneID ab initio
0,4852
0,4632
0,4742
SNAP ab initio
0,5640
0,4297
0,4969
Augustus con suggerimenti RNA-seq
0,5656
0,6727
0,6192
GeneID con suggerimenti RNA-seq
0,4884
0,4639
0,4762
Confronto degli allineamenti e delle predizioni contro il dataset di riferimento (r. esoniche)
Evidenze
Sensibilità
Specificità
Accuratezza
EST
0,9342
0,6054
0,7698
Proteine omologhe
0,1732
0,9203
0,5468
RNA-seq
0,7334
0,6413
0,6874
Augustus ab initio
0,4489
0,8022
0,6256
GeneID ab initio
0,5245
0,7744
0,6495
SNAP ab initio
0,5459
0,6688
0,6074
Augustus con suggerimenti RNA-seq
0,5078
0,8502
0,6790
GeneID con suggerimenti RNA-seq
0,5296
0,7413
0,6355
Confronto degli allineamenti e delle predizioni contro il dataset di riferimento (giunzioni)
Evidenze
Sensibilità
Specificità
Accuratezza
EST
0,5566
0,4747
0,5157
Proteine omologhe
0,2493
0,8794
0,5644
RNA-seq
0,8723
0,9507
0,9115
Augustus ab initio
0,6260
0,8347
0,7304
GeneID ab initio
0,6881
0,7536
0,7209
SNAP ab initio
0,5840
0,4538
0,5189
Augustus con suggerimenti RNA-seq
0,7875
0,9112
0,8494
GeneID con suggerimenti RNA-seq
0,6943
0,7521
0,7232
Annotazione finale realizzata con Evidence Modeller, che permette di combinare i risultati delle
predizioni e delle evidenze sperimentali in un’unica annotazione finale mediante l’assegnazione di pesi.
Pesi EVM assegnati
Annotazione 1 Annotazione 2 Annotazione 3
EST
Proteine
RNA-seq
Augustus ab initio
GeneID ab initio
SNAP ab initio
Augustus con suggerimenti RNA-seq
GeneID con suggerimenti RNA-seq
3
5
3
1
1
1
0
0
Statistiche generali
Numero di geni
Media della lunghezza dei geni
N50 della lunghezza dei geni
Media dei numero di esoni per gene
Livelli d’indagine
3
5
0
0
0
0
2
0
Annotazione 1 Annotazione 2 Annotazione 3
26.814
26.243
26.211
1.119,90
1.145,90
1.130,56
1.452
1.446
1.434
4,34
4,77
4,72
Annotazione 1
Sensibilità
3
5
0
0
1
1
2
0
Annotazione 2
Specificità Accuratezza Sensibilità
Annotazione 3
Specificità Accuratezza Sensibilità
Specificità Accuratezza
Identificare i loci genici
0,4396
0,6276
0,5336
0,5620
0,6768
0,6194
0,5600
0,6760
0,6180
Identificare le regione esoniche
0,4119
0,8110
0,6115
0,5012
0,8492
0,6752
0,5008
0,8544
0,6776
Identificare le giunzioni esone-introne
0,5698
0,8383
0,7041
0,7768
0,9093
0,8431
0,7769
0,9132
0,8451
Le statistiche generali non sono sufficienti a valutare le differenze tra
le diverse predizioni, è necessario valutarne l’accuratezza.
È importate definire metriche adeguate per valutare l’accuratezza di
una predizione sotto diversi aspetti. Predittori con accuratezza
simile per alcuni aspetti, mostrano un grado di accuratezza
completamente diverso per altri.
Utilizzare RNA-Seq, che sono ottenibili a costi ridotti e in tempi
brevi, come suggerimento per i predittori può migliorare
sostanzialmente la predizione a seconda del software utilizzato.
È possibile realizzare un’annotazione finale con poche predizioni
accurate, consentendo un significativo risparmio di tempo
computazionale.
Valutare ogni singolo passaggio del protocollo di annotazione
permette di avere un’annotazione finale ottimizzata.