Capitolo V
Determinazione della vitalità e dell’attività metabolica
di batteri lattici isolati da impasti acidi in risposta alle
condizioni di stress
Quarantuno ceppi di batteri lattici, isolati impasti acidi per la produzione
del pane Cornetto di Matera, sono stati sottoposti a stress acido, osmotico e
ossidativo. La vitalità cellulare basata sull’integrità della membrana è stata
valutata utilizzando il Live/Dead® (L/D) BacLightTM Bacteria Viability
kit, mentre l’attività metabolica è stata determinata valutando la riduzione
del colorante redox 2-(iodiofenil)-3-(p-nitrofenil)-5-feniltetrazolio cloruro
(INT) in rosso formazano insolubile. Un confronto tra la conta diretta
al microscopio e la conta in piastra è stato effettuato per diversi ceppi.
La completa perdita dell’integrità della membrana è stata osservata per i
ceppi di Lactobacillus curvatus dopo tutti i trattamenti di stress, mentre le
cellule di Weissella cibaria e Leuconostoc mesenteroides presentavano la
membrana danneggiata solo dopo l’esposizione allo stress acido. I più alti
livelli di tolleranza agli stress sono stati osservati per i ceppi di Lactobacillus
plantarum e Lactobacillus paraplantarum. Tutte le specie sono state in
grado di ridurre l’INT in presenza di alte concentrazione di sale, ma una
drastica diminuzione o una completa perdita dell’attività metabolica è stata
osservata dopo l’esposizione agli stress acido e ossidativo.
La colorazione con il kit Live/Dead è un metodo rapido per monitorare il
danno imposto alle cellule, ma non fornisce una buona valutazione della
vitalità cellulare per tutte le condizioni di stress. Una buona correlazione tra
la conta diretta al microscopio e la conta in piastra è stata trovata in seguito
all’esposizione agli stress acido e osmotico, ma la stima delle cellule vive
effettuata con la colorazione Live/Dead era superiore a quella ottenuta
mediante conta in piastra dopo l’esposizione allo stress ossidativo. Pertanto,
per determinare la vitalità cellulare, l’attività metabolica e coltivabilità sono
indicatori più affidabili rispetto all’integrità della membrana.
5.1. Introduzione
Durante il loro uso come colture starter nell’industria della panificazione,
95
i batteri lattici sono esposti a diversi stress fisici e chimici. In particolare,
durante la preparazione dell’impasto sono sottoposti alle basse temperature
(stoccaggio refrigerato per circa 24-28 ore a 4°C), ai bassi valori di pH
(pH 3,4-4,0 raggiunto al termine della fermentazione) e a stress osmotici
dovuti all’aggiunta di sale o al grado di idratazione dell’impasto. La
formulazione e la conservazione delle colture starter, inoltre, possono
imporre stress ambientali (essiccamento, congelamento, scongelamento,
ecc) che influenzano l’attività metabolica dei batteri lattici diminuendone
le prestazioni durante la panificazione. Lo sviluppo di metodi rapidi ed
efficienti per la misura della vitalità cellulare, quindi, è importante per
verificare l’applicabilità delle colture starter sottoposte a diversi tipi di
stress.
La vitalità delle cellule è in genere valutata mediante conta in piastra. Tuttavia,
questo metodo ha diverse limitazioni poiché la conta spesso richiede 2 o 3
giorni di incubazione e i microrganismi possono essere distribuiti in modo
diverso, in catene e/o gruppi, risultando in una sottostima del numero di
cellule (Mesa et al., 2003; Auty et al., 2001). Inoltre, dopo l’esposizione ad
alcuni tipi di stress molti microrganismi possono entrare in uno stato vitale
ma non coltivabile (VNC) che potrebbe portare ancora una volta ad una
sottostima della concentrazione microbica (Perrot et al., 1998).
Pertanto, sono stati proposti diversi metodi alternativi per valutare la vitalità
cellulare. Alcune tecniche si basano sul monitoraggio di attività metaboliche
come la riduzione dei sali di tetrazolio come indicazione di una catena di
trasporto di elettroni attiva, oppure attraverso l’individuazione dell’attività
esterasica su substrati fluorogenici (Villarino et al., 2000). Altri metodi,
invece, utilizzano tecniche di microscopia come alternativa ai tradizionali
metodi culturali, perché forniscono uno strumento rapido e diretto per la
conta totale dei batteri. L’arancio di acridina (AO) e il 4,6-di-amidino2-fenilindole (DAPI) sono i fluorocromi più frequentemente utilizzati in
microscopia di fluorescenza (Boulos et al., 1999). Tuttavia, questi coloranti
non sono in grado di distinguere le cellule vitali da quelle non vitali. La doppia
colorazione con il Live/Dead® (L/D) Bacteria Viability kit (BacLightTM;
Molecular Probes, Eugene, OR) discrimina le cellule vive da quelle morte
sulla base dell’integrità della membrana. Il fluorocromo verde, Syto9, è
una piccola molecola che può penetrare nella cellula attraverso membrane
intatte, mentre il fluorocromo rosso, ioduro di propidio (PI), penetra solo
96
attraverso membrane danneggiate. Le massime lunghezze d’onda di
eccitazione e di emissione per questi coloranti sono, rispettivamente, 480
e 500 nm per il Syto9 e 490 e 635 nm per il PI. Le sospensioni batteriche
incubate in presenza di entrambi i coloranti hanno fluorescenza verde se le
cellule sono vitali, rossa se le cellule sono morte.
Il kit L/D è stato usato con successo in diversi studi (Leuko et al., 2004;
Saarela et al., 2004; Mesa et al., 2003; Alonso et al., 2002; Auty et al. ,
2001; Bunthof et al., 2001; Villarino et al., 2000; Ulmer et al., 2000; Boulos
et al., 1999; Nexmann et al., 1997; Webb et al., 2003).
Lo scopo di questo lavoro è stato quello di valutare la vitalità e l’attività
metabolica dei ceppi di batteri lattici isolati da impasti in seguito a stress
acido, osmotico e ossidativo. Inoltre, la colorazione con il kit L/D è stato
valutata come un metodo rapido e alternativo per monitorare la vitalità
cellulare.
5.2. Materiali e metodi
5.2.1. Ceppi e condizioni di coltura
Quarantuno ceppi di batteri lattici, isolati da impasti acidi per la produzione
del pane Cornetto di Matera (Ricciardi et al., 2002), sono stati utilizzati
in questo studio. I ceppi sono stati mantenuti come colture liofilizzate
nella collezione dei microrganismi del Dipartimento di Biologia, Difesa
e Biotecnologie Agro-Forestali, Università degli Studi della Basilicata,
Potenza, Italia, e sono stati propagati in MRS liquido (Oxoid) per 16 ore a
30°C prima della valutazione della risposta allo stress.
5.2.2. Trattamenti di stress
Le cellule, cresciute overnight in MRS liquido, sono state raccolte in fase
stazionaria mediante centrifugazione (12000 x g, 5 min) e lavate due volte in
soluzione salina sterile (0,85% w/v di NaCl). Le cellule, standardizzate ad
una DO650=1, sono state ri-sospese in 1 mL di diversi substrati per ottenere le
seguenti condizioni di stress: a) MRS liquido, pH 2,0 (aggiustato con HCl,
stress acido); b) MRS liquido contenente NaCl 1 mol/L (stress osmotico); c)
soluzione di H2O2 allo 0,3% v/v (stress ossidativo). Le sospensioni cellulari
sono state incubate per 30 minuti a 30°C per lo stress acido e osmotico e
per 1 ora a 30°C nel caso dello stress ossidativo. Le cellule incubate per 30
minuti a 30°C in 1 ml di MRS sono state utilizzate come controllo.
97
5.2.3. Misura dell’attività metabolica
Dopo l’incubazione, le cellule stressate e non stressate, sono state raccolte
mediante centrifugazione (12000 x g, 5 min), lavate due volte e ri-sospese
in tampone potassio fosfato con glucosio (Ulmer et al., 2000) per ottenere
una sospensione cellulare diluita e standardizzata a DO650=0,2, al fine
di ridurre l’interferenza delle cellule nella lettura spettrofotometrica. Le
sospensioni cellulari sono state miscelate 1:1 con una soluzione di INT
(Sigma) 4 mmol/L, per ottenere una concentrazione finale di INT 2 mmol/L.
L’attività metabolica è stata determinata misurando la riduzione di INT a
rosso formazano attraverso una lettura della DO a 595 nm dopo 30 e 120
minuti di incubazione a 30°C.
5.2.4. Determinazione dell’integrità della membrana
La percentuale di cellule vitali è stata misurata utilizzando il kit Live/Dead
BacLight (L-13152; Molecular Probes, Eugene, OR). Dopo l’incubazione, le
cellule stressate e non stressate sono state raccolte mediante centrifugazione
(12000 x g, 5 min), lavate due volte e ri-sospese in 200 μL di soluzione
salina sterile. 10 μL di campione sono stati mescolati con 10 μL di una
miscela (1 volume di Syto9 12 μmol/L e 1 volume di PI 60 μmol/L) di
colorante e incubati al buio per 15 minuti a temperatura ambiente . I
campioni colorati sono stati analizzati con un microscopio a fluorescenza
Axioskop (Carl Zeiss, Germania) equipaggiato di una lampada ad mercurio
da 50 W, un obiettivo 100x ad immersione e una videocamera (TK-1280E,
JVC). Le immagini sono state catturate con il software Kontron Imaging
KS200 (Carl Zeiss, Germania). Per ogni campione sono stati fotografati 5
campi focali casuali. Il confronto tra la colorazione con il kit L/D e la conta
in piastra su MRS agar per 48 ore a 30°C è stata effettuata per quindici
ceppi selezionati in modo casuale.
5.2.5. Analisi statistica
Tutte le analisi statistiche e i grafici sono stati realizzati con il software
Systat 10.0 per Windows (SPSS, Chicago, IL, USA).
5.3. Risultati e discussione
Gli studi sulla risposta allo stress dei batteri lattici sono importanti per
migliorare la loro attività nelle applicazioni industriali. La maggior parte
98
dei dati presenti in letteratura sono relativi a Lactococcus lactis subsp.
Lactis, un microrganismo che ha ampio uso nei prodotti lattiero-caseari.
I lattobacilli hanno ricevuto meno attenzione rispetto a Lc. lactis e, nello
specifico, in letteratura sono presenti pochi lavori sulla risposta allo stress
di batteri lattici isolati da impasti. Inoltre, nessuno studio è stato ancora
pubblicato sulla loro risposta allo stress ossidativo. Un aumento della
barotolleranza è stato osservato nel ceppo Lactobacillus sanfranciscensis
DSM20451T in seguito a stress subletali da freddo, osmotico e acido
(Scheyhing et al., 2004). Rollan et al. (2003) e De Angelis et al. (2001)
hanno studiato la risposta allo stress acido nei ceppi Lb. reuteri CRL1098 e
Lb. sanfranciscensis CB1, rispettivamente.
In questo studio, quarantuno ceppi di batteri lattici sono stati sottoposti a
stress acido, osmotico e ossidativo e la vitalità cellulare è stata misurata
attraverso la perdita dell’attività metabolica e dell’integrità della membrana.
L’attività metabolica era basata sulla capacità delle cellule vive di ridurre
il colorante redox 2-(iodofenil)-3-(p-nitrofenil)-5-feniltetrazolio cloruro
(INT) a rosso formazano insolubile. Il formazano può essere osservato al
microscopio sottoforma di depositi intracellulari di colore rosso o misurato
spettrofotometricamente con test quantitativi (Rodriguez et al., 1992).
Tuttavia, il rilevamento visivo in cellule di piccole dimensioni risulta
difficile (Zimmermann et al., 1978) e, a volte, i cristalli sciolgono nell’olio
ad immersione (King e Parker, 1988).
In questo studio, l’aumento della DO a 595 nm, dovuta alla formazione
di cristalli di colore rosso, è stato utilizzato come indicazione dell’attività
metabolica dei batteri lattici vitali. La riduzione del tetrazolio dipende,
infatti, dall’attività di enzimi NADH-dipendenti che sono presenti nei batteri
lattici, come ossidasi, perossidasi, o deidrogenasi specifiche. La riduzione
dei sali di tetrazolio quindi può essere considerata come un indicatore della
dell’attività metabolica dei batteri lattici (Ulmer et al., 2000).
Un primo esperimento effettuato su cinque ceppi (Lb. pentosus
DBPZ0984, Lb. curvatus DBPZ1020, Lb. plantarum DBPZ1015,
Leuconostoc mesenteroides DBPZ1005 e Weissella cibaria DBPZ1006)
ha dimostrato che l’aumento della DO a 595 nm (misurato ad intervallidi
10 minuti) è stato lineare solo nei primi 30 minuti di incubazione, ma
non dopo 120 minuti. In accordo con questi risultati, Ulmer et al. (2000)
hanno trovato che la riduzione di INT da parte del ceppo Lb. plantarum
99
TMW 1460 era lineare nei primi 30 minuti di incubazione. Dopo 30
minuti di incubazione con la soluzione di INT, le cellule non stressate ed
utilizzate come controllo hanno mostrato un rapido aumento della DO a
595 nm (dati non mostrati), dimostrando un’elevata attività metabolica.
L’attività metabolica delle cellule è stata espressa come il rapporto
tra l’aumento della DO a 595 nm delle cellule stressate e l’aumento
della DO a 595 nm dei controlli. Per quanto riguarda lo stress osmotico
(Figura 1b), tutti i ceppi sono stati in grado di ridurre l’INT a rosso
formazano. I valori più elevati di attività metabolica sono stati trovati
tra i ceppi appartenenti a Leuc. mesenteroides e al gruppo Lb. plantarum
(che comprendeva le specie Lb. plantarum, Lb. paraplantarum e Lb.
pentosus), anche se i ceppi di Lb. curvatus e W. cibaria hanno mostrato
un buon livello di produzione di rosso formazano. Al contrario, una
drastica diminuzione o una completa perdita dell’attività metabolica
è stata osservata dopo l’esposizione agli stress acido e ossidativo
(Figura 1a e 1c). Dopo 120 minuti di incubazione con la soluzione di
INT, l’aumento della DO a 595 nm è stata osservata solo per lo stress
osmotico, indicando che le cellule erano ancora vive e metabolicamente
attive dopo questo trattamento (dati non mostrati).
Dopo i trattamenti di stress, la vitalità cellulare è stata determinata
attraverso conta diretta al microscopio, valutando l’integrità della
membrana cellulare e, quindi, la permeabilità della membrana ai coloranti
fluorescenti come indicazione della risposta allo stress. Le cellule
stressate e non stressate sono state colorate con il Live/Dead BacLight
™ Bacteria Viability kit, che contiene due coloranti fluorescenti (Syto9
e ioduro di propidio, PI). Dopo la colorazione le cellule con membrana
danneggiata apparivano rosse e quelle con membrana intatta apparivano
verdi (Figura 2 a, b, c, d).
La percentuale delle cellule con membrana intatta dopo lo stress acido
era bassa per i ceppi di Lb. curvatus, Leuc. mesenteroides e W. cibaria.
Il gruppo Lb. plantarum, al contrario, mostrava un’alta percentuale di
cellule verdi, suggerendo un buon livello di sopravvivenza al trattamento
acido (Figura 3). Per quanto riguarda lo stress osmotico, tutti i ceppi, ad
eccezione della specie Lb. curvatus, hanno mostrato un’alta percentuale di
cellule con membrana integra (Figura 3b). Il danno imposto dallo stress
ossidativo, invece, era strettamente dipendente dal ceppo. La maggior parte
100
Figura 1. Grafico dell’attività metabolica a 30 minuti dopo l’esposizione dei ceppi di
batteri lattici allo stress acido (a), osmotico (b) e ossidativo (c). Lb. curvatus (Lbcu); Lb.
paraplantarum, Lb. pentosus, Lb. plantarum (Lbplgroup); Leuc. mesenteroides (Leme);
W. cibaria (Wecb).
a
b
c
101
Figura 2.
Fig. 2a. Lb. plantarum DBPZ0989
(stress osmotico)
Fig. 2b. Leuc. mesenteroides DBPZ0995
(stress acido)
Fig. 2c. Lb. plantarum DBPZ1021
(stress ossidativo)
Fig. 2d. Lb. pentosus DBPZ0984
(stress ossidativo)
dei ceppi appartenenti alla specie Leuc. mesenteroides, W. cibaria e al gruppo
Lb. plantarum hanno mostrato un’elevata percentuale di cellule con membrana
intatta, mentre le cellule dei ceppi di Lb. curvatus avevano cellule completamente
rosse (membrana danneggiata; Figura 3c).
102
Figura 3. Grafico della percentuale delle cellule verdi (green stained) dei batteri lattici
dopo l’esposizione allo stress acido (a), osmotico (b) e ossidativo (c). Lb. curvatus (Lbcu);
Lb. paraplantarum, Lb. pentosus, Lb. plantarum (Lbplgroup); Leuc. mesenteroides
(Leme); W. cibaria (Wecb).
a
b
c
103
La Figura 4 mostra la distribuzione tridimensionale della percentuale delle cellule
verdi dei ceppi di ceppi di batteri lattici in risposta allo stress acido, osmotico e
ossidativo. I ceppi di Lb. curvatus, distribuiti nella sezione bassa sinistra del grafico,
avevano una bassa resistenza ai trattamenti di stress, mentre quelli appartenenti a
Leuc. mesenteroides, nell’angolo in basso a destra del grafico, avevano un’elevata
percentuale di cellule verdi dopo esposizione agli stress osmotico e ossidativo,
indicando una forte resistenza a questi trattamenti, ma la membrana era danneggiata
dopo l’esposizione allo stress acido. Un simile andamento è stato osservato per
i due ceppi di W. cibaria. I ceppi di Lb. plantarum e Lb. paraplantarum erano
caratterizzati da una notevole variabilità nella risposta allo stress, probabilmente
a causa del loro numero elevato. La maggior parte dei ceppi del gruppo Lb.
plantarum, nella sezione in alto a destra del grafico, presentava un’alta percentuale
di cellule verdi in risposta agli stress acido, osmotico e ossidativo. Pochi ceppi
appartenenti in alto a sinistra, invece, hanno mostrato un’elevata resistenza agli
stress acido e osmotico, ma la perdita dell’integrità della membrana in seguito allo
stress ossidativo. Diversi ceppi, invece, avevano una percentuale intermedia di
cellule rosse e verdi.
Figura 4. Grafico tridimensionale della distribuzione della percentuale delle cellule verdi
(green stained) dei ceppi di ceppi di batteri lattici in risposta allo stress acido, osmotico
e ossidativo. Lb. curvatus (); Lb. plantarum group (including Lb. plantarum, Lb.
paraplantarum, Lb.pentosus) (); Leuc. mesenteroides (); W. cibaria ().
104
Il confronto tra la stime del numero di cellule vive con la conta in piastra e
con la colorazione con Live/Dead è stato effettuato su quindici ceppi scelti
casualmente. La percentuale di cellule vive era generalmente più elevata
nel caso della conta diretta al microscopio. Dopo l’esposizione allo stress
acido è stata osservata una buona correlazione tra i due metodi di conta
per i ceppi di Lb. curvatus, Leuc. mesenteroides, W. cibaria e uno di Lb.
plantarum, ma per gli altri due ceppi di Lb. plantarum sono state osservate
delle differenze (Figura 5). Per quanto riguarda lo stress osmotico, è stata
osservata una buona correlazione per tutti i ceppi, tranne che per uno di
W. cibaria (Figura 6). La conta in piastra non ha dato alcun risultato in
risposta allo stress ossidativo, a differenza della colorazione con Live/
dead che ha fornito un’elevata percentuale di cellule vive, indicando una
bassa correlazione tra i due metodi di conta in risposta a questo trattamento
(Figura 7). Il numero di ceppi con membrana intatta dopo l’esposizione
allo stress ossidativo era superiore a quello dei ceppi metabolicamente
attivi rilevati spettrofotometricamente dopo incubazione con la soluzione
di INT (dati non mostrati).
Figura 5. Percentuale delle cellule vive (% live) stimate con la conta in piastra o con la
colorazione con Live/Dead dopo lo stress acido. Lb. curvatus (); Lb. plantarum ();
Leuc. mesenteroides (); W. cibaria ().
105
Figura 6. Percentuale delle cellule vive (% live) stimate con la conta in piastra o con la
colorazione con Live/Dead dopo lo stress osmotico. Lb. curvatus (); Lb. plantarum ();
Leuc. mesenteroides (); W. cibaria ().
Figura 7. Percentuale delle cellule vive (% live) stimate con la conta in piastra o con la
colorazione con Live/Dead dopo lo stress ossidativo. Lb. curvatus (); Lb. plantarum
(); Leuc. mesenteroides (); W. cibaria ().
106
In questo studio abbiamo esaminato l’uso dei fluorocromi Syto9 e PI
per la valutazione della vitalità cellulare di quarantuno ceppi di batteri
lattici esposti allo stress acido, osmotico e ossidativo. La conta diretta al
microscopio è un metodo rapido ed efficiente per determinare la vitalità di
un numero elevato di ceppi ed è stata utilizzata per lo studio della resistenza
allo stress di diversi batteri. L’integrità della membrana del ceppo Lc. lactis
subsp. lactis ML3 dopo l’esposizione a diversi trattamenti di stress (calore,
congelamento, bassi pH, presenza di sali biliari) è stata monitorata con
PI e carbossifluoresceina (CF) da Bunthof et al. (1999). In un successivo
lavoro, Bunthof et al. (2001) hanno utilizzato la colorazione con Live/
Dead per valutare la lisi cellulare del ceppo Lc. lactis MG1363 in formaggi
modello, suggerendo che la microscopia di fluorescenza è un metodo utile
per monitorare in situ l’attività metabolica di ceppi di batteri lattici.
In accordo con questi dati, Auty et al. (2001) hanno utilizzato la colorazione
con Live/Dead per la stima dei batteri vitali in alcuni prodotti lattiero-caseari.
Questo kit è stato, inoltre, utilizzato per monitorare la sopravvivenza di
ceppi probiotici di Lb. paracasei e Lb. salivarius durante trattamenti termici
e di essiccazione (Gardiner et al., 2000). Tuttavia, questa tecnica ha diverse
limitazioni correlate soprattutto alla temperatura, al pH, alla concentrazione
dei coloranti, al tempo di incubazione e allo stato delle cellule (Boulos et
al., 1999). Nel nostro studio, la vitalità delle cellule stimata con la conta
diretta al microscopio era superiore a quella stimata con la conta in piastra
e con la determinazione dell’attività metabolica. Diversi autori hanno
dimostrato che questi risultati sono attribuibili a diversi fattori. La conta
diretta dei batteri probiotici Lb. paracasei subsp. paracasei NFCB338,
Bifidobacterium spp. UCC35612 e Bifidobacterium spp. UCC401 con il
kit Live/Dead è stata costantemente superiore (fino a 20 volte) alla conta
in piastra. Auty et al. (2001) hanno suggerito che questo può essere dovuto
al livello di aggregazione delle cellule dopo la coltivazione in substrato
solido.
Mesa et al. (2003) hanno trovato differenze tra la conta in piastra e quella
mediante microscopia di fluorescenza nella numerazione dei batteri acetici.
Il numero di cellule determinato con il Live/Dead era, infatti, circa 4 ordini
di grandezza superiore. Una buona correlazione tra la colorazione con il kit
Live/Dead e con il DAPI è stata osservata in questo lavoro. Una sovrastima
della vitalità cellulare con il Live/Dead è stata osservata anche nello studio
107
delle comunità di batteri bentonici in campioni di acque profonde (Quéric et
al., 2004).
Boulos et al. (1999) hanno applicato la colorazione Live/Dead per la rapida
enumerazione di batteri vitali nell’acqua potabile. AO e DAPI diretto
contare e la riduzione del CTC è stato confrontato. In questo lavoro la stima
ottenuta con il kit era pari a quella ottenuta utilizzando l’AO e leggermente
superiore a quella ottenuta utilizzando il CTC e il DAPI. In accordo con i
nostri risultati, Ulmer et al. (2000) hanno dimostrato che le cellule esposte a
stress ossidativo risultavano con membrana intatta (cellule verdi) ma nessuna
colonia compariva dopo la coltivazione su substrato solido; questo fenomeno
ha suggerito che la permeabilità della membrana ai coloranti fluorescenti è
un indicatore inadeguato della vitalità cellulare, in quanto le cellule possono
avere una membrana intatta ma risultare metabolicamente inattive.
I nostri risultati hanno dimostrato che la colorazione Live/Dead è un metodo
rapido per valutare il danno imposto alla cellula in seguito alle condizioni di
stress, ma il kit non fornisce una buona valutazione della vitalità cellulare
in tutte le condizioni. Al contrario, la riduzione dei sali di tetrazolio e il
conseguente accumulo di cristalli di formazano possono essere un criterio
più rigoroso rispetto alla valutazione dell’integrità della membrana. In
particolare, l’attività metabolica e la coltivabilità rappresentano indicazioni
più efficaci della vitalità cellulare rispetto all’integrità della membrana per le
popolazioni esposte a stress ossidativo.
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