QUANTA LiteTM CCP 3.1 IgG/IgA ELISA
704550
Per uso diagnostico In Vitro
Complessità CLIA: elevata
Finalità d’uso
Il test QUANTA LiteTM CCP3.1 IgG/IgA ELISA è un dosaggio di immunoassorbimento enzimatico
semiquantitativo per la determinazione di anticorpi IgG e IgA anti-CCP3 (peptide citrullinato ciclico 3) nel
siero dei pazienti o in citratato o plasma EDTA. La presenza di questi anticorpi, quando associati ad altri
esami clinici e di laboratorio, è un aiuto nella diagnosi di artriti reumatoidi (RA), incluse RF diagnosticate
entro 2 anni dalla comparsa dei sintomi.
Riassunto e Spiegazione del test
L’artrite reumatoide (RA) è una delle malattie autoimmunitarie sistemiche più comuni che colpisce circa
0,5% della popolazione mondiale.1 La diagnosi dipende primariamente dalle manifestazioni cliniche della
malattia. Fino a recentemente, l’unico esame sierologico utilizzato di routine era la determinazione della
presenza del fattore reumatoide (RF) individuato in circa 50%-90% di questi pazienti.1,2 Tuttavia, il RF
viene anche individuato in soggetti con infezioni, altre malattie autoimmunitarie e in alcuni soggetti
sani.1,2
È importante per la gestione della malattia avere la possibilità di diagnosticare e trattare le persone
affette da RA il più presto possibile.3 È noto da molti anni che gli autoanticorpi anti-perinucleari, chiamati
anche autoanticorpi anticheratina, vengono rilevati nei soggetti affetti da RA. Recentemente, è stato
scoperto che questi anticorpi riconoscono un epitopo che contiene la forma deamidata dell’arginina
denominata citrullina.4,5 Un peptide circolare contenente citrullina denominato CCP (peptide citrullinato
ciclico) si è dimostrato più efficace nella discriminazione dei pazienti RA da altri pazienti rispetto al test
dell’anticorpo perinucleare o ai test del fattore reumatoide.6,7 In una revisione della letteratura pubblicata8
il 68% dei pazienti con RA sono positivi per gli anti-CCP, mentre fra i soggetti non-RA la media è del 5%.
Un test ELISA costruito con la sequenza CCP descritta originalmente5 non è stato commercializzato
diffusamente. Tuttavia il test anti-CCP di seconda generazione (chiamato CCP2 da alcune aziende) è
ampiamente disponibile e dimostra prestazioni superiori rispetto al peptide originale.9 INOVA denomina il
test di seconda generazione CCP IgG ELISA. Molto importante, anti-CCP sono stati trovati in pazienti
con precoce AR8, predicendo talvolta il successivo sviluppo di RA meglio del RF.4,7 Gli anticorpi da alcuni
pazienti RA che sono negativi per gli anti-CCP, sono reattivi con altre proteine citrullinate6,7 suggerendo
l’esistenza di ulteriori epitopi non presenti nella sequenza dell’antigene CCP di seconda generazione.
Nel 2005, sono stati sviluppati kit con utilizzano un antigene di 3° generazione. Questi kit che utilizzano
peptidi di 3a generazione hanno dimostrato di essere circa il 5% più sensibili rispetto a quelli che
utilizzano l’antigene CCP2 ed ugualmente specifici.10 L'antigene utilizzato nel kit QUANTA LiteTM CCP
3.1 appartiene alla nuova 3° generazioni di peptidi CCP3. Questo kit utilizza un coniugato che individua
gli anticorpi IgA in aggiunta ai consueti anticorpi IgG. La sensibilità viene aumentata dal kit CCP 3 per il
fatto che alcuni pazienti con artrite reumatoide hanno anticorpi IgA anti-CCP 3 in assenza di IgG.11
Ulteriori progressi nel test CCP 3.1 ELISA includono pozzetti a strappo codificati cromaticamente e la
possibilità di utilizzare campioni sia di siero sia di plasma dei pazienti.
Principio della Metodica
L’antigene utilizzato nel test QUANTA LiteTM CCP 3.1 IgG/IgA ELISA ™ è un peptide sintetico citrullinato
ciclico che si è scoperto avere alta sensibilità e specificità nel rivelare anticorpi nei pazienti affetti da AR.
Questo antigene è adsorbito sulla parete dei pozzetti della piastra. I controlli prediluiti ed i campioni
paziente diluiti vengono aggiunti in pozzetti separati consentendo agli anticorpi IgG e/o IgA anti-CCP
presenti di legarsi all’antigene immobilizzante. L’eccesso di campione non legato viene allontanato
mediante il lavaggio e successivamente si aggiunge a ciascun pozzetto un anticorpo anti-IgG/IgA umane
marcato con un enzima. Una seconda incubazione consente agli anticorpi anti-IgG e/o umane marcati
con l’enzima di legarsi agli anticorpi del paziente che si sono eventualmente legati alla parete dei
pozzetti. Dopo ulteriore lavaggio per allontanare l’eccesso di anticorpi anti-IgG/IgA umane marcati con
l’enzima, l’attività dell’enzima rimasto viene misurata aggiungendo un substrato cromogenico e
misurando l’intensità del colore che si sviluppa. Il test può essere letto mediante uno spettrofotometro ed
interpretato confrontando l’intensità del colore che si sviluppa nei pozzetti dei campioni con quella dei
pozzetti dei controlli.
Reagenti
1.
2.
3.
4.
5.
Piastra microtiter ELISA in polistirene adsorbita con antigene CCP 3.1 purificato (12-1 x 8
pozzetti), con supporto, in busta chiusa contenente materiale essicante
Controllo ELISA Negativo, 1 flacone di tampone contenente conservante e siero umano senza
anticorpi umani anti-CCP, prediluito, 1,2mL
Controllo ELISA debolmente positivo per CCP 3.1 IgG/IgA, 1 flacone di tampone contenente
conservante ed anticorpi umani anti-CCP, prediluito, 1,2mL
Controllo ELISA fortemente (Calibratore A) per CCP 3.1 IgG/IgA, 1 flacone di tampone
contenente conservante ed anticorpi umani anti-CCP IgG, prediluito, 1,2mL
Calibratore B ELISA positivo per CCP 3.1 IgGIgA, 1 flacone di tampone contenente conservante
ed anticorpi umani anti-CCP, prediluito, 1,2mL
1
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Calibratore C ELISA positivo per CCP 3.1 IgG/IgA, 1 flacone di tampone contenente conservante
ed anticorpi umani anti-CCP, prediluito, 1,2mL
Calibratore D ELISA positivo per CCP 3.1 IgG/IgA, 1 flacone di tampone contenente conservante
ed anticorpi umani anti-CCP, prediluito, 1,2mL
Calibratore E ELISA positivo per CCP 3.1 IgG/IgA, 1 flacone di tampone contenente conservante
ed anticorpi umani anti-CCP, prediluito, 1,2mL
Diluente per campioni HRP, 1 flacone – di colore rosa contenente soluzione fisiologica tamponata
con Tris, Tween 20, stabilizzatori delle proteine e conservante, 50mL
Soluzione di lavaggio Alto Specificty Concentrata, 1 flacone di soluzione concentrata 10x – di
colore rosso contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris e Tween 20, 100mL. Vedi la
Sezione Metodi per le istruzioni sulla diluizione.
Coniugato HRP CCP 3.1 IgG/IgA, (montone), anti-IgG umane, 1 flacone – di colore giallo
contenente tampone, stabilizzatori delle proteine e conservante, 10mL
Cromogeno TMB, 1 flacone contenente stabilizzatori, 10mL
Soluzione di arresto HRP, Acido solforico 0,344M, 1 flacone – incolore, 10mL
Avvertenze
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
ATTENZIONE: Questo prodotto contiene un composto chimico (cloramfenicolo allo 0,02%) nel
diluente per i campioni, nei controlli e nel coniugato, noto allo Stato della California come causa
di tumori.
Tutte le fonti umane di materiali usati nella preparazione dei controlli per questo prodotto sono
state testate e sono risultate negative per la presenza di anticorpi anti-HIV, per HBsAg e per
anticorpi anti-HCV mediante metodi approvati dall’FDA. Tuttavia nessun test offre la certezza
completa dell’assenza di HIV, HBV, HCV o di altri agenti infettivi. Pertanto, i Controlli ELISA
fortemente positivo CCP 3.1 IgG/IgA, ELISA debolmente positivo CCP 3.1 IgG/IgA ed ELISA
Negativo devono essere maneggiati come materiali potenzialmente infettivi.12
La sodio azide è usata come conservante. La sodio azide è un veleno e può essere tossica se
ingerita o assorbita attraverso la cute o gli occhi. La sodio azide può reagire con le tubature di
piombo o rame formando azidi metalliche potenzialmente esplosive. Lasciar scorrere grandi
quantità di acqua, se si usa un lavandino per eliminare i reagenti, per prevenire la formazione di
azidi.
Il Coniugato HRP contiene un composto chimico velenoso/corrosivo, che può essere tossico se
ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi.
Il Cromogeno TMB contiene un irritante, che può essere dannoso se inalato, ingerito o assorbito
attraverso la cute. Per prevenire lesioni, evitare l’inalazione, l’ingestione o il contatto con la cute e
con gli occhi.
La Soluzione di arresto HRP è costituita da una soluzione di acido solforico diluito. Evitare
l’esposizione a basi, metalli o altri composti che possono reagire con gli acidi. L’acido solforico è
velenoso e corrosivo e può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche,
evitare il contatto con la cute e con gli occhi.
Usare appropriati indumenti personali protettivi mentre si lavora con i reagenti forniti.
I reagenti eventualmente rovesciati devono essere rimossi immediatamente. Seguire tutte le
normative vigenti in materia di eliminazione dei residui di natura chimica.
Precauzioni
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Questo prodotto è stato messo a punto per l’uso diagnostico In Vitro.
La sostituzione di componenti diversi da quelli forniti nel kit può causare risultati non attendibili.
Un lavaggio incompleto o non accurato e l’insufficiente aspirazione del liquido dai pozzetti ELISA
può causare una scarsa precisione e/o un’elevato background.
L’adattamento di questo test all’uso con apparecchiature automatiche e altri dispositivi per
trattamento dei campioni liquidi, in toto o in parte, può causare differenze nei risultati rispetto a
quelli ottenuti mediante la procedura manuale. E’ responsabilità di ciascun Laboratorio
confermare che le procedure automatizzate utilizzate diano risultati entro limiti di accettabilità.
Una serie di fattori influenza le prestazioni del test. Essi comprendono l’iniziale temperatura dei
reagenti, la temperatura dell’ambiente, l’accuratezza e la riproducibilità della tecnica di
pipettamento, la scrupolosità delle operazioni di lavaggio e di aspirazione del liquido dai pozzetti
delle piastre ELISA, il tipo di spettrofotometro usato per leggere i risultati e la lunghezza dei tempi
di incubazione durante l’esecuzione del test. Bisogna prestare molta attenzione alla costanza per
ottenere risultati accurati e riproducibili.
Si raccomanda di attenersi scrupolosamente alle istruzioni fornite.
Una chiusura incompleta della busta richiudibile contenente le strisce di pozzetti ed il materiale
essicante causa la degradazione dell’antigene ed una scarsa precisione nei risultati.
Valori di assorbanza inaccettabilmente bassi possono essere osservati dopo aver usato due o
più volte lo stesso flacone di coniugato HRP per un certo periodo di tempo. E’ importante seguire
attentamente le istruzioni fornite per il trattamento del coniugato HRP per evitare tale
inconveniente.
Un’eventuale contaminazione chimica del coniugato HRP può essere conseguenza di una
impropria pulizia o risciacquo di apparecchi o di strumenti. Residui di comuni reagenti chimici di
laboratorio quali formalina, candeggina, etanolo o detergenti causano la degradazione nel tempo
del coniugato HRP. Risciacquare molto accuratamente tutti gli apparecchi e gli strumenti dopo
l’uso di detergenti chimici.
2
Condizioni di conservazione
1.
2.
3.
Conservare tutti i reagenti del kit a 2-8°C. Non congelare. I reagenti sono stabili fino alla data di
scadenza se conservati e trattati seguendo le istruzioni fornite.
Le strisce di pozzetti non utilizzate devono essere rimesse immediatamente nella busta
richiudibile contenente il materiale essicante e conservate nella busta ben chiusa a 2-8°C.
Il tampone di lavaggio diluito è stabile per 1 settimana a 2-8°C.
Raccolta dei campioni
Questa procedura va effettuata con campioni di siero o di plasma citratato o di plasma EDTA poiché
questi campioni producono risultati identici. Non si dovrebbe usare plasma con litio o eparina in quanto
produce risultati diversi rispetto al siero. L’aggiunta di azidi o altri conservanti ai campioni del test
potrebbe influenzare negativamente i risultati. Campioni con segni di contaminazione microbica, trattati
con calore o contenenti particelle visibili non dovrebbero essere usati. Si dovrebbe evitare anche l’uso di
sieri fortemente emolizzati o lipemici.
Dopo il prelievo, il siero dovrebbe essere separato dal coagulo. Il Documento H18-A3 dell’NCCLS
raccomanda le seguenti condizioni di conservazione per i campioni: 1) Conservare i campioni a
temperatura ambiente per non più di 8 ore. 2) Se il test non può essere eseguito entro 8 ore, conservare
i campioni in frigorifero a 2-8°C. 3) Se il test non può essere eseguito entro 48 ore, oppure per la
spedizione dei campioni, congelare a ≤-20°C. I campioni congelati devono essere mescolati bene dopo
lo scongelamento e prima di essere testati.
Procedura
Materiali forniti
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Piastra microtiter ELISA CCP 3.1 IgG/IgA (12-1 x 8 pozzetti), con supporto
1,2mL Controllo ELISA Negativo prediluito
1,2mL Controllo ELISA debolmente positivo CCP 3.1 IgG/IgA prediluito
1,2mL Controllo ELISA fortemente positivo (Calibratore A) CCP 3.1 IgG/IgA prediluito
1,2mL Calibratore B ELISA CCP 3.1 IgG/IgA prediluito
1,2mL Calibratore C ELISA CCP 3.1 IgG/IgA prediluito
1,2mL Calibratore D ELISA CCP 3.1 IgG/IgA prediluito
1,2mL Calibratore E ELISA CCP 3.1 IgG/IgA prediluito
50mL Diluente per campioni HRP
100mL Soluzione di lavaggio Alto Specificty Concentrata, 10x concentrata
10mL Coniugato HRP CCP 3.1 IgG/IgA, (montone), anti-IgG/IgA umane
10mL Cromogeno TMB
10mL Soluzione di arresto HRP, 0,344M Acido solforico
Materiali richiesti ma non forniti
Micropipette in grado di erogare volume di 5, 100, 200-300 e 500µL
Puntali monouso per micropipette
Provette per la diluizione dei sieri, volume 4mL
Acqua distillata o deionizzata
Beuta da 1L per diluite la Soluzione di lavaggio Alto Specificty Concentrata
Lettore per piastre ELISA in grado di leggere a 450nm (e 620nm per le letture a doppia lunghezza
d’onda)
Metodica
Prima di incominciare
1.
2.
3.
4.
5.
Portare tutti i reagenti ed i campioni a temperatura ambiente (20-26oC) e mescolarli bene.
Diluire la Soluzione di lavaggio Alto Specificty Concentrata 1:10 aggiungendo il contenuto del
flacone fornito con il kit a 900mL di acqua distillata o deionizzata. Se non si usa l’intera piastra in
una sola volta, si può preparare una minore quantità di soluzione di lavaggio aggiungendo
10,0mL di concentrato a 90mL di acqua distillata o deionizzata ogni 16 pozzetti utilizzati. La
soluzione di lavaggio diluita è stabile per 1 settimana a 2-8oC.
Preparare una diluizione 1:101 di ciascun campione da testare aggiungendo 5µL di siero a 500µL
di Diluente per campioni HRP. I campioni diluiti devono essere testati entro 8 ore dalla
preparazione. NON DILUIRE i Controllo ELISA debolmente positivo CCP 3.1 IgG/IgA, Controllo
ELISA fortemente positivo CCP 3.1 IgG/IgA ed Controllo ELISA Negativo.
La determinazione della presenza o dell’assenza di CCP 3.1 IgG/IgA usando unità arbitrarie
richiede due pozzetti per ciascuno dei tre controlli ed uno o due pozzetti per ciascun campione
clinico. Si raccomanda di testare i campioni in duplicato.
Se si desidera, i risultati possono essere anche quantizzati utilizzando una curva standard a 5
punti. Per i punti da A ad E della curva standard a 5 punti utilizzare i calibratori PREDILUITI CCP
3.1 IgG/IgA da A ad E direttamente dalla fiala. La curva standard a 5 punti ha i seguenti valori:
Punto
Unità
A
Calibratore A CCP 3.1 IgG/IgA prediluito
250,0
B
Calibratore B CCP 3.1 IgG/IgA prediluito
125,0
C
Calibratore C CCP 3.1 IgG/IgA prediluito
62,5
D
Calibratore D CCP 3.1 IgG/IgA prediluito
31,25
E
Calibratore E CCP 3.1 IgG/IgA prediluito
15,62
3
Esecuzione del test
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
TUTTI I REAGENTI DEVONO ESSERE PORTATI A TEMPERATURA AMBIENTE (20-26°C)
PRIMA DI INIZIARE IL TEST. Posizionare i pozzetti/le strisce necessarie nel supporto.
Rimettere immediatamente la strisce inutilizzate nella busta contenente il materiale
essicante e sigillarla bene per minimizzare l’esposizione all’umidità ambientale.
Distribuire 100µL dei Controlli ELISA debolmente positivo CCP 3.1 IgG/IgA, ELISA fortemente
positivo CCP 3.1 IgG/IgA, dei Calibratori ELISA positivi per CCP 3.1 IgG/IgA da B ad E (se si
vuole), ed ELISA Negativo prediluiti e dei sieri diluiti nei rispettivi pozzetti. Coprire i pozzetti ed
incubare per 30 minuti a temperatura ambiente su una superficie piana. Il tempo di incubazione
inizia dopo l’aggiunta dell’ultimo campione.
Lavaggio: Aspirare completamente il contenuto di ciascun pozzetto. Distribuire 200-300µL di
soluzione di lavaggio HRP diluita in tutti i pozzetti e quindi aspirarla. Ripetere questa operazione
per altre due volte, per un totale di tre lavaggi. Dopo l’ultimo lavaggio capovolgere la piastra e
scuoterla fermamente su tovaglioli di carta assorbente per rimuovere eventuali residui di liquido.
E’ importante vuotare completamente ciascun pozzetto dopo ciascun lavaggio. Per l’aspirazione
mantenere la stessa sequenza usata per l’aggiunta dei campioni.
Distribuire 100μL di Coniugato HRP CCP 3.1 IgG/IgA in ciascun pozzetto. Il coniugato dovrebbe
essere prelevato dal flacone mediante tecniche sterili. Prelevare dal flacone solo la quantità di
coniugato necessaria per l’esecuzione del test. PER EVITARE POSSIBILI CONTAMINAZIONI
MICROBICHE E/O CHIMICHE, NON RIMETTERE MAI IL CONIUGATO INUTILIZZATO NEL
FLACONE. Incubare i pozzetti per 30 minuti come descritto al punto 2.
Lavaggio: Ripetere la procedura descritta al punto 3.
Distribuire 100µL di Cromogeno TMB in ciascun pozzetto ed incubare al buio per 30 minuti a
temperatura ambiente.
Distribuire 100µL di Soluzione di arresto HRP in ogni pozzetto. Per l’aggiunta della Soluzione di
arresto HRP mantenere la stessa sequenza e gli stessi tempi utilizzati per l’aggiunta del
Cromogeno TMB. Agitare gentilmente la piastra con le dita per mescolare completamente i
reagenti nei pozzetti.
Leggere l’assorbanza di ciascun pozzetto a 450nm entro 1 ora dall’aggiunta della soluzione di
arresto. Se si preferisce una lettura a doppia lunghezza d’onda, si può usare la lunghezza d’onda
di 620nm come riferimento.
Controllo di qualità
1.
2.
3.
4.
I Controlli ELISA debolmente positivo CCP 3.1 IgG/IgA, ELISA fortemente positivo CCP 3.1
IgG/IgA ed ELISA Negativo devono essere inclusi ogni volta che si esegue il test per assicurare
che tutti i reagenti ed il test funzionino in modo corretto.
Si deve notare che, poichè i Controlli ELISA debolmente positivo CCP 3.1 IgG/IgA, ELISA
fortemente positivo CCP 3.1 IgG/IgA ed ELISA Negativo sono prediluiti, essi non rappresentano
un controllo procedurale per le tecniche di diluizione utilizzate per i campioni.
Ulteriori controlli possono essere inclusi in base alle indicazioni o alle richieste delle vigenti
regolamentazioni o delle organizzazioni di accreditamento. Ulteriori sieri di controllo possono
essere preparati raccogliendo un pool dei sieri umani, aliquotandolo e conservandolo a < -20°C.
Perchè i risultati del test siano considerati validi, tutti i seguenti criteri devono essere soddisfatti.
Se anche uno solo non rientra nei valori specificati, i risultati non dovrebbero essere considerati
validi ed il test dovrebbe essere ripetuto.
a.
L’assorbanza del Controllo ELISA fortemente positivo CCP 3.1 IgG/IgA prediluito deve
essere maggiore di quella del Controllo ELISA debolmente positivo CCP 3.1 IgG/IgA
prediluito che a sua volta deve essere maggiore di quella del Controllo ELISA Negativo
prediluito.
b.
Il Controllo ELISA fortemente positivo CCP 3.1 IgG/IgA prediluito deve avere
un’assorbanza maggiore di 1,0 mentre l’assorbanza del Controllo ELISA Negativo
prediluito non deve essere maggiore di 0,2.
c.
L’assorbanza del Controllo ELISA debolmente positivo CCP 3.1 IgG/IgA deve essere
maggiore di due volte rispetto a quella del Controllo ELISA Negativo oppure >0,25.
d.
Il Controllo ELISA Negativo e quello ELISA fortemente positivo CCP 3.1 IgG/IgA servono
per controllare un’eventuale malfunzionamento dei reagenti. Il Controllo ELISA fortemente
positivo CCP 3.1 IgG/IgA non assicura la precisione in corrispondenza del valore soglia
del test.
e.
L’utente del test dovrebbe fare riferimento al Documento C24-A3 dell’CLSI (NCCLS) per
ulteriori informazioni su appropriate tecniche di Controllo di Qualità.
Calcolo dei risultati semi-quantitativi – Metodo del rapporto
Si deve determinare innanzitutto il valore medio di assorbanza per ciascun set di duplicati. La reattività di
ciascun campione viene quindi calcolata dividendo il valore medio di assorbanza del campione per il
valore medio di assorbanza del Controllo ELISA debolmente positivo CCP 3.1 IgG/IgA e moltiplicando il
risultato per il numero di unità assegnate al Controllo ELISA debolmente positivoCCP 3.1 IgG/IgA, che è
stampato sull’etichetta del flacone.
Assorbanza campione
Valore del campione = ————————————————
(unità)
Assorbanza Controllo ELISA
debolmente positivo CCP 3.1 IgG
x Valore Controllo ELISA debolmente positivo
CCP 3.1 IgG/IgA (unità)
4
La reattività è collegata in modo non lineare alla quantità di anticorpi presente. Mentre gli aumenti e le
diminuzioni delle concentrazioni degli anticorpi vengono evidenziate da un corrispondente aumento o
diminuzione della reattività, il cambiamento non è proporzionale (ad es., un raddoppio della
concentrazione di anticorpi non raddoppia necessariamente la reattività). Se si desidera una più accurata
quantificazione del contenuto di anticorpi, si possono allestire e testare diluizioni seriate del campione.
L’ultima diluizione che risulta positiva nel test dovrebbe essere refertata come il titolo anticorpale del
paziente.
Metodo di calcolo opzionale: risultati semi-quantitativi utilizzando una curva
standard
Calcolo dei risultati utilizzando la curva standard opzionale
1.
Calcolare un valore medio per i valori doppi.
2.
Tracciare l’assorbanza media dei campioni nella curva standard utilizzando i rispettivi valori in
Unità. Utilizzare uno Spline cubico, lineare/lineare (polinomiale di terzo ordine) oppure una curva
punto-a-punto per disegnare la curva.
3.
Determinare la concentrazione sconosciuta di anti-CCP 3.1 in Unità dall’asse “Y” leggendo
l’assorbanza corrispondente sull’asse “X”. Calcolare le Unità sconosciute.
4.
Nota: i valori calcolati utilizzando il metodo del rapporto saranno differenti rispetto a quelli
calcolati con il metodo della curva standard. I valori elevati differiranno di più rispetto a quelli più
bassi. Il CCP 3.1 IgG/IgA Fortemente Positivo non darà un valore di 250 Unità con il metodo del
titolo.
Interpretazione dei risultati
Il metodo ELISA è molto sensibile alla procedura ed è in grado di individuare anche piccole differenze
nella popolazione dei pazienti. I valori riportati qui di seguito sono solo valori suggeriti. Ciascun
Laboratorio dovrebbe stabilire il proprio range di normalità basato sulla procedura da esso utilizzata, sui
controlli, sull’apparecchiatura e sulla popolazione di pazienti secondo le proprie metodiche standard.
Il campione può essere quindi classificato come negativo, debolmente positivo, moderatamente o
fortemente positivo in base alla seguente tabella.
Unità
<20
20 - 39
40 - 59
>60
Negativo
Debolmente Positivo
Moderatamente Positivo
Fortemente Positivo
1.
2.
3.
Un risultato positivo indica la presenza di anticorpi diretti contro CCP 3.1 IgG/IgA e suggerisce la
possibilità di artrite reumatoide.
Un risultato negativo indica l’assenza di anticorpi diretti contro CCP 3.1 IgG/IgA anticorpi oppure
la loro presenza a livelli inferiori al limite di sensibilità del metodo.
Sul referto si dovrebbe riportare la seguente frase: “I seguenti risultati sono stati ottenuti mediante
il test QUANTA LiteTM CCP 3.1 IgG/IgA ELISA della INOVA. I valori CCP 3.1 IgG/IgA ottenuti con
test prodotti da altre Ditte possono non essere utilizzabili in modo intercambiabile. Il livello di IgG
o IgA determinato con questo metodo non può essere correlato ad un titolo di punto finale.”
Limitazioni del test
1.
2.
3.
4.
5.
6.
La presenza nel campione di complessi immuni o di altri aggregati di immunoglobuline può
causare un aumento del livello di reazioni a specifiche con conseguenti risultati falsi positivi con
questo test.
Non tutti i pazienti affetti da AR risultano positivi agli anticorpi CCP.
I risultati di questo test devono essere valutati dal medico curante alla luce del quadro clinico del
paziente e del risultato degli altri test sierologici.
Le prestazioni caratteristiche del test non sono state valutate per campioni diversi dal siero o di
plasma citratato o di plasma EDTA.
Il valore diagnostico degli anticorpi anti-CCP 3.1 in pazienti affetti da artrite reumatoide giovanile
non è stato determinato.
Sostanze interferenti: alti livelli di emoglobina, bilirubina, colesterolo o trigliceridi non causano
risultati falso negativi o falso positivi.
Valori attesi da campioni clinici
La capacità di QUANTA LiteTM CCP 3.1 IgG/IgA ELISA di rilevare anticorpi IgG/IgA CCP 3.1 è stata
valutata confrontando 942 campioni con un test ELISA che misura gli anti-CCP2 IgG. Erano inclusi 495
pazienti con diagnosi clinica di RA sia dagli studi interni (186) e esterni (309). Sono stati inoltre analizzati
i sieri di 275 donatori di sangue selezionati aleatoriamente. Dei 272 di cui erano disponibili i dati dell’età
e del sesso, 97 erano femmine e l’età media era 42,4. I controlli di malattia comprendevano 74 soggetti
con altre patologie reumatiche (ORD) quali lupus eritematoso sistemico (34), sindrome di Sjögren’s (16)
e scleroderma (24), oltre a 98 campioni aggiuntivi con anticorpi di malattie infettive (ID) quali epatite C
(58), herpes simplex virus (15), citomegalovirus (14), toxoplasmosi (6) e rosolia (5) in un grande studio
interno.
5
Sensibilità e specificità clinica
La seguente tabella riassume i risultati di tutti i nostri studi clinici.
Championi N=942
CCP 3.1 ELISA
+
348
147
55
31
10
437
2
273
6
68
2
96
RA (Totale N=495)
RA - entro 2 anni (N=86)
Controlli totali (N=447)
Donatori di sangue (N=275)
Altre malattie reumatiche (N=74)
Malattia infettiva (N=98)
Sensibilità Clinica [(95% Intervallo di confidenza (CI)] =
RA entro 2 anni =
Specificità Clinica (95% CI) =
CCP ELISA
+
320
175
47
39
8
439
3
272
4
70
1
97
CCP 3.1 = 70,3% (66-74%)
CCP = 64,6% (60-69%)
CCP 3.1 = 64,0% (52-74%)
CCP = 54,7% (43-65%)
CCP 3.1 = 97,8% (96-99%)
CCP = 98,2% (97-99%)
Confronto tra i metodi
N=942
CCP3.1
IgG/IgA
ELISA
Positivo
Negativo
Totale
CCP IgG ELISA
Positivo
Negativo
320
38*
8**
576
328
614
Totale
% Accordo (95% CI)
358
584
942
Pos. % Accordo=97,6% (95,3-98,9%)
Neg. % Accordo=93,8% (91,6-95,6%)
Tot. % Accordo=95,1%
*33 di questi championi sono diagnosticati RA.
** 5 di questi championi sono diagnosticati RA.
Reazioni crociate
Per valutare la potenziale reattività crociata dell’antigene CCP 3.1 con altri autoanticorpi, QUANTA Lite™
CCP 3.1 ELISA è stato valutato con 16 campioni, tutti con elevati livelli di diversi altri autoanticorpi. In
questo gruppo erano inclusi 2 campioni, ed entrambi avevano reagito con SS-A, SS-B, Sm, RNP, Scl-70,
Jo-1, Ribo-P e dsDNA. Tutti i campioni risultavano negativi per anti-CCP 3.1. Lo studio precedente non
evidenza alcuna reattività crociata significativa dell'antigene CCP 3.1 con una varietà di altri
autoanticorpi.
Precisione e riproducibilità
La variazione dei test fra le sedute è stata misurata analizzando dei duplicati di campioni negativi,
debolmente positivi e fortemente positivi in 6 saggi separati in 5 giorni diversi. La variazione dei test nelle
sedute è stata misurata analizzando 9 campioni 9 e 10 volte ciascuno sulla stessa piastra ELISA. I
risultati rappresentativi vengono presentati nella seguente tabella.
Variazione inter-analisi
Negativo 1
1 pt.* 5 pt.**
Unità medie
6U
4U
Deviazione standard
0,4
0,5
Coefficiente di variazione % 8% 11%
Debolmente 1
1 pt.
5 pt.
22 U
23 U
0,7
0,6
3%
3%
Debolmente 2
1 pt.
5 pt.
28 U
30 U
0,8
1,2
3%
4%
Fortemente 1
1 pt.
5 pt.
69 U
85 U
1,7
1,2
2%
1%
Debolmente 1
5 pt.
1 pt.
22 U
24 U
0,9
1,1
4%
5%
Debolmente 2
5 pt.
1 pt.
26 U
30 U
0,9
1,0
3%
3%
Fortemente 1
5 pt.
68 U
81 U
1,9
3,2
3%
4%
Variazione intra-analisi
Negativo 1
1 pt.5 pt.1 pt.
Unità medie
4U
2U
Deviazione standard
0,2
0,2
Coefficiente di variazione % 4% 13%
* Risultati del test del metodo del rapporto
**Risultati del test della curva standard
6
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Institutes of Health, Fifth Edition, 2007.
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October 2009
Revision 2
7