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Istituto Zooprofilattico
Sperimentale del Piemonte,
Liguria e Valle d’Aosta
Carne di cavallo & Co.: le sfide
dell’identificazione di specie
Pier Luigi Acutis
S.S. Genetica e Immunobiochimica
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Apparentemente tutto iniziò così …..
In Italia analizzati 361 campioni
con il 3.87% di positivi
FSAI Survey Finds Horse
DNA in Some Beef Burger
Products
15 gennaio 2013
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Ma la storia non è nuova ….
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
159
96
41
9
1
2009
31
4
28
27
27
23
13
2010
2011
2012
2013
apr-14
campioni NON CONFORMI
campioni CONFORMI
Campioni analizzati per identificazione di specie dalla S.S.
Genetica e Immunobiochimica a partire dal 2009.
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Non solo bovino per cavallo .…
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Altri esempi….
Specie non dichiarate nel 15.9% di carni crude e 22.9% prodotti cotti su
902 campioni in USA (Hsieh et al., 1995)
Specie non dichiarate nel 22% di casi in
prodotti carnei in Turchia (Ayaz, 2006)
Piano carne equina analizzati 95 campioni da
IZSPLV:
2 casi con presenza di
carne equina
3 casi con specie non
dichiarate
3 con assenza di una
delle specie dichiarate.
An FSA review of local authority sampling data,
from July to December 2013, found that 43 out of
145 samples of lamb take-away meals contained
meat other than lamb. In total, 25 of these samples
were found to contain only beef. Other meat
species identified included chicken and turkey. No
samples were found to contain horse meat.
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Perché interessa la frode di sostituzione di
specie?
• Danno commerciale
• Rischio sanitario
• Il consumatore ha il diritto
di scegliere
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Da frode locale a frode
su scala
internazionale….
da food fraud a food
crime….
una falla nella
tracciabilità implica
solo danni economici?
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Scende in campo la DG SANCO
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Caratteristiche del piano di controllo
•
•
•
•
•
•
•
Primo piano coordinato per identificazione di specie
150 campioni previsti per l’Italia
Carne, prodotti e preparazioni a base di carne bovina
Prevista esclusivamente analisi del DNA
Screening con metodi qualitativi con LOD 0.5%
Conferma con metodo semi-quantitativo
Introdotta soglia dell’1% di carni equine
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Forza e criticità del piano: ecco le sfide
dell’identificazione di specie
Perché analisi del DNA?
• Il DNA è presente in ogni cellula
• è in gran parte stabile
DNA mitocondriale
• Presenza di più copie nelle
cellule (1-10/mitocondrio)
• Sequenza nota per molti
organismi
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Fase 1: screening con metodi qualitativi
• Target: DNA mitocondriale
• Applicabili su qualsiasi prodotto
• Sensibilità elevatissima: LOD >0.5%
• Rilevate anche le cross-contaminazioni
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Metodo: identificazione mediante sonde specie-specifiche
immobilizzate su microchip
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Identificazione animale in alimenti costituiti da più specie
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Metodo: identificazione mediante PCR real time
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Fase 2: metodo semiquantitativo - soglia 1%
Come quantificare? Metodi e problematiche
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Quale unità di misura per esprimere la
quantità di DNA?
Peso/peso:
• assunto: % DNA = % carne
• utilizzati calibratori
• errori dovuti alla composizione e processi produttivi
dei prodotti ignoti al laboratorio
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Quale unità di misura per esprimere la
quantità di DNA?
Genoma/genoma
• più accurato, quindi preferibile al peso/peso
• attenzione alla diversa lunghezza del genoma in
specie diverse
• Impossibile rapportare all’etichetta
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Quale target?
Ballin et al. (2009)
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Quali calibratori e quale incertezza di misura?
Eugster et al. (2009)
-Materiali di riferimento
meglio di DNA puro come
calibratori
-Deviazione media dal valore
vero =18%
-Incertezza di misura fino a
40% per specie in piccola %
-Quantificazione corretta solo
se materiale riferimento
prodotto come campione
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RC 2013 IZSPLV
Oltre lo scandalo carne di cavallo: nuove
strategie analitiche per lo smascheramento
di alcune tra le principali frodi alimentari
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WP1: Determinazione quantitativa di specie.
• Analisi di diverse matrici
• Valutazione metodi estrazione DNA
• Determinazione quantitativa di specie basata su DNA
mitocondriale; DNA genomico a singola copia e
sequenze di DNA ripetute (SINE)
Obiettivo: trovare il metodo migliore per diverse
matrici, stabilendone anche i limiti
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Fase 2: metodo semiquantitativo - soglia 1%
• Target mitocondriale
• Peso/peso
• Calibratore: carne fresca
• Nessuna incertezza di misura
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Fase 2: soglia 1% - criticità
• Target mitocondriale: 1% DNA da carne diverso da 1%
DNA da fegato
• Peso/peso: riferito a sola carne ma impossibile nei ripieni
= sottostima
• Calibratore: carne fresca non accurata per altri prodotti =
sottostima
• Nessuna incertezza di misura: 1% potrebbe essere 0.5%?
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1% o tolleranza 0?
• Rischio sanitario per allergie: 1% è un margine di
sicurezza?
• Rischio sanitario per residui: la mancanza di rapporto
con quantità di carne impedisce di stabilire la quantità
di residuo. 1% in hamburger > 1% in carne di ripieno
• Implicazioni etico-religiose: 1% è accettato dal
consumatore?
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1% o tolleranza 0?
• Danno commerciale per il consumatore: 1% in
hamburger è danno > di 1% in ripieno
• Danno commerciale per produttori: su larga scala
forse anche 0.5% può essere significativo
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Conclusioni
• Metodi qualitativi molto sensibili
• Metodi quantitativi con limiti:
dovrebbero basarsi su target genomici, utilizzare materiali
di riferimento adeguati, incertezza di misura ampia
• Difficile correlare con la quantità di carne
• Importante continuare nella standardizzazione metodi
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Riflessioni sul cut off
• Difficile stabilire una soglia discriminante frode da
contaminazione
• Importante conoscere l’obiettivo (sanitario vs
commerciale)
• Rilevanza diversa se food fraud o food crime
• Rivedere GMP e prevedere tolleranza 0?
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GRAZIE PER L’ATTENZIONE
Disegno: Bob Marongiu