Diss. ETH N1'. 13680
Turnour targeting and therapy experiments
using a chemicaIly-modified human antibody
fragment directed against the ED-B domain 01'
fibronectin, a marker 01' angiogenesis
.A dissertation submitted to the
SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY ZÜRICH
for the degree of
DOCI'OR OF NATURAL SCIENCES
Presented by
Lorenzo Tarli
Dottore in Chimica - University of Siena
born December, 1971
from Siena, Italy
accepted on the recommendation of
Prof Dr. Dario Neri, examiner
Prof. D1'. Gerd Folkers, co-examiner
Prof. D1'. Donald Hilvert, co-examiner
Zürich, May 2000
1.
Summary
The formation of new blood vessels from pre-existing ones (angiogenesis) is a rare
phenomenon in the adult, but is a charaeteristie feature of many aggressive tumours
and of other relevant disorders, Molecules capable of specifieally binding to new
blood vessels, but not to mature vessels, eould be used as selective vehicles and
would, therefore, open diagnostie and therapeutie opportunities. Furthermore,
targeting of angiogenesis should obviate the need of different binders for different
tumour types, as new-forming blood vessels appear to be a general feature of
tumoural progression and invasion.
A number of eell surface and extracellular adhesion molecules are upregulated in
newly formed blood vessels, demonstrating the phenotypic differences between
mature, quiescent vessels, and their newly formed (angiogenetic) counterparts. In
particular, a fibronectin isoform with an extra domain B (ED-B) inserted by splicing,
is specifically present in the stroma of neoplastie tissues and around adult and
neoplastic blood vessels during angicgenesis.
Using antibody phage display libraries and combinatorial mutagenesis, a high-affinity
human antibody fragment, seFv(L19), directed against the ED-B dornain of
fibronectin, was isolated by our group. In this thesis, the high-affinity anti-ED-B
seFv(L 19) was demonstrated to be eapable of in 1'ivo selective targeting of tumoural
blood vessels. Upon intravenous injection in tumour-bearing mice, seFv(L 19) is
rapidly eliminated from the blood through the kidneys and, unlike conventional
monoclonal antibodies, it does not accumulate in the Iiver
01'
other organs. The
antibody aeeumulation in the tumour was measured by using either fluorescently
labeled or radioiodinated anti-ED-B seFv(L19). Four different tumour models grafted
in nude mice have been studied.
2
Thc high affinity scFv(L 19) (K,
a lowcr affinity fragment (K,
==
=
54 pM) is an affinity-rnatured version of scFv(E 1),
41 nM) directed against the same epitope of ED-B. By
performing biodistribution studies in tumour-bearing mice with the monomeric and
the dimeric fonns of the two anti-ED-B antihodies, we demonstrated that increased
binding affinity, valence and size of the recombinant antibody fragment led to
improved targeting performances.
The use of the anti-ED-B high affinity scFv(LI9) to deliver a toxic agent to forming
blood vesse1s was also investigated. We first studied the anti-tumour activity of
doxorubicin, one of the most effective drugs used to treat cancer and one of a few
chemotherapeutic agents known to have antiangiogenic activity, chemically coupled
to scFv(LI9). Repeated injection of a conjugate obtained by choosing a c1eavablc
linker between thc antibody fragment and doxorubicin, resulted in tumour retardation
relative to contraI mice injected with saline.
ScFv(L 19) preferentially localizes in tumours a few hours after injection. This
suggests its usefulness for the selective delivery of a short-range and short-lived toxic
agent such as an alpha-emitting radionuc1ide. Astatine-Zl l is a particularly interesting
agent, because it produces energetic alpha-particles, which have a range in tissue
penetration of few cells diameter.
We have demonstrated that scFv(Ll9) can be radiolabeled in a stahle fashion using
the N-succinimidyl 3-(trimethylstannyl)benzoate (m-MeATE) chemistry. This
chemistry proceeds with excellent retention of antihody immunoreactivity, and with
good tumour targeting results few hours after intravenous injection in tumour-bearing
mice.
3
Riassunto
Con il termine angiogenesi e' indieata la forrnazione di nuovi vasi sanguigni apartire
da vasi gia ' esistenti. Questo fenomeno, ehe raramente e' osservato nell'adulto,
eostituisee una eomune caratteristica di molti tumori aggressivi e di altre gravi
patologie, quali artrite reumatoide, retinopatia diabetiea e psoriasi.
Moleeole in zrado di localizzarsi selettivamente a Iivello dei vasi in formazione, ma
non a livello dei vasi maturi, potrebbero essere utilizzate per veieolare opportuni
agenti diagnostiei e terapeutiei. Queste moleeole potrebbero inoltre sopperire alla
ricerca di differenti leganti per differenti classi di tumori, in quanta la formazione di
nuovi vasi sanguigni e' considerata una cornune earatteristiea della progressione e
delI 'invasione tumorale.
Vi sono moleeole, definite markers di angiogenesi, ehe vengono espresse solamente
nelle aree in eui un proeesso angiogenetieo e' in eorso. Una di queste e' il dominio B
della fibronettina (ED-B), ehe e' specificamente presente intomo ai vasi sanguigni
appena formati. Utilizzando la teenologia del phage display e principi di mutagenesi
eombinatoriale, il nostro gruppo e' riuscito ad isolare un frammento antieorpale
umano, seFv(L 19), in grade di legarsi eon alta affinita' al dominio B della fibronettina
(ED-B). In questa tesi, abbiamo dimostrato ehe l'antieorpo seFv(L19) e' in grade di
localizzarsi selettivamente sui vasi sanguigni tumorali in vivo. Abbiamo studiato
quattro differenti tipi di moclelli tumorali impiantati sotto eute ai topi. In seguito
alliniezione intravenosa dellanticorpo anti-Efr-B, abbiamo dimostrato ehe
seFv(Ll9) e' eliminato rapidamente dal sangue e dai reni e ehe, a differenza dei
convenzionali anticorpi monoclonali, non si aeeumula nel fegato
0
in altri organi. La
localizzazione dell 'antieorpo e, stata misurata utilizzando seFv(Ll9) eoniugato ad un
agente tluoreseente
0,
alternativamente, ad una sostanza radioattiva,
4
L' anticorpo scFv(L 19) ha una affinita' di Iegame verso il dominio B della fibronettina
molto alta (K,
54 pM). Come gia' introdotto, scFv(L19) e' stato ottenuto attraverso
un processo di mutagenesi combinatoriale da un anticorpo, scFv(E1), dallaffinita' eh
legame 700 volte piu' bassa (K,
=
41 11M). Attraverso esperimenti di biodistribuzione
condotti su topi precedentemente impiantati con tumori, abbiamo confrontato i due
anticorpi anti-Efr-B nei rispettivi formati monomeriei e dimerici. Con questi
esperimenti, abbiamo dimostrato ehe aumentando l ' affinita', Ia valenza e Ia
dimensione degli antieorpi rieombinanti anti-ED-B, puo' essere ottenuto un notevole
miglioramento deI targeting di angiogenesi.
Abbiamo inoltre studiato I'utilizzo di seFv(Ll9) per un selettivo rilascio di agenti
tossici (terapeutici) a livello dei vasi sanguigni tumorali. Abbiamo inizialmente
studiato lattivita' citossica della doxorubicina coniugata eon un opportuno legame
chimieo allanticorpo anti-Efr-B. La doxorubicina, oltre ad essere un farmaco
largamente usato nella cura del cancro, c' anehe uno dei poehi chemioterapici di cui
e' stata provata un'attivita' anti-angiogenetica. In seguito aIl'iniezione intravenosa del
coniugato seFv(L 19)-doxorubieina in topi impiantati eon tumori, abbiamo osservato
un ritardo della crescita tumorale, relativamente alla creseita osservata in topi trattati
con una soluzione fisiologica.
Dagli studi di biodistribuzione eseguiti con seFv(L 19), abbiamo dimostrato ehe
questo antieorpo ricombinante e' in grado di localizzarsi nei tumori gia' poche ore
dopo l'amministrazione sistemica. Questo aspetto ha suggerito la potenziale utilita' di
seFv(L 19) per il ri1ascio selettivo sui vasi sanguigni tumorali di agenti tossici dal
breve tempo di semi-vita (t I 2) e dal corto raggio eh azione. Tra questi, il radionuclide
astato-211 e' partieolarmente interessante, in quanto decade per emissione di
particelle alfa, altamente energetiche e in grado c1i penetrare solo poche cellule.
In questo studio, abbiamo dimostrato ehe I' anticorpo scFv(L 19) puo' essere coniugato
in maniera stabile ad un raclioalogeno attraverso la chimica dell ' Nssuccinimidil 3-
5
(trimetilstannil)benzoato. Utilizzando questa chimica di coniugazione, ed effettuando
degli esperimenti in topi con dei tumori impiantati sotto cute, abbiamo ottenuto degli
cccellenti risultati di targeting gia' poche ore dopo 1'iniezionc intravenosa.