UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI PARMA
Facoltà di Scienze MM. FF. NN.
Corso di Laurea Specialistica in Biologia ed Applicazioni Biomediche
TISSUE ENGINEERING
COLTURA DI CHERATINOCITI E FIBROBLASTI
SU SUPPORTO DI PLASMA
Relatori
Chiar. ma Prof. ssa Renata Franchi Gazzola
Correlatori
Chiar. mo Dott. Stefano Negri
Laureanda
Elena Alessi
Anno Accademico 2007/2008
TISSUE ENGINEERING
Area multidisciplinare di ricerca che ha come scopo la
rigenerazione di tessuti ed organi danneggiati del nostro
organismo
PRINCIPI
Prelevare le cellule staminali del Paziente
Far crescere e differenziare le cellule su un supporto
biologico
Sottoporre il Paziente al trapianto
BIOMATERIALI
devono possedere le seguenti caratteristiche:
tollerabilità: devono essere immunologicamente
inerti (biocompatibili)
impalcatura provvisoria: dopo integrazione il
biomateriale deve essere sostituito dal tessuto
originario (biodegradabili)
contenuto informativo: devono comunicare e
scambiare segnali con le cellule ospite
LE MATRICI PIU’ IDONEE..
Per la crescita e differenziazione di cheratinociti e fibroblasti
autologhi, le matrici più idonee, sono di tipo naturale e si
suddividono in:
- collagene
- agarosio
- acido ialuronico
- colla di fibrina
- cellulosa
Grande interesse è rivolto verso l’utilizzo del plasma umano
come supporto di crescita per cheratinociti e fibroblasti
SCOPO TESI
Isolare cheratinociti e fibroblasti umani,
utilizzando il plasma autologo per
formare lembi di cute con caratteristiche
morfo-funzionali e immunoistochimiche
simili all’epidermide normale
CASO CLINICO
V. P. di anni 65, affetta da ulcera vascolare venosa
circonferenziale alla gamba sinistra.
MATERIALI E METODI
 Estrazione e amplificazione di cheratinociti e fibroblasti
umani autologhi, prelevati da un’unica biopsia
 Preparazione del supporto di plasma
 Aggiunta di fibroblasti e cheratinociti a diverse densità
PREPARAZIONE SUPPORTO DI PLASMA
ACIDO TRANEXAMICO
PLASMA
SOLUZIONE FISIOLOGICA
+
FIBROBLASTI
+
CHERATINOCITI
CLORURO DI CALCIO
30’, 37°C, 5% CO2
CONSISTENZA DEL SUPPORTO
QUANTITÀ DI SOLUZIONE
PLASMA
AC. TRANEXAMICO
NaCl
CaCl2
5 ml
5 mg
6,5 ml
1 ml, 1%
1 ml
2 ml
5 ml
5 mg
6,5 ml
1 ml, 1,5%
1 ml
2 ml
5 ml
6 mg
6,5 ml
1 ml, 1%
1 ml
2 ml
6 ml
5 mg
5,5 ml
1 ml, 1%
1 ml
2 ml
5 ml
6 mg
6,5 ml
1 ml, 1,5%
1 ml
2 ml
PER POZZETTO
DENSITA’ DI SEMINA
FIBROBLASTI
5X104/cm2
10X104/cm2
15X104/cm2
CHERATINOCITI
5X104/cm2
10X104/cm2
15X104/cm2
5X104/cm2
5X104/cm2
5X104/cm2
5X104/cm2
10X104/cm2
15X104/cm2
10X104/cm2
10X104/cm2
10X104/cm2
5X104/cm2
10X104/cm2
15X104/cm2
15X104/cm2
15X104/cm2
15X104/cm2
5X104/cm2
10X104/cm2
15X104/cm2
FU
KE
FU
KE
FU
KE
FU
KE
FU
KE
FU
KE
FU
KE
FU
KE
FU
KE
MODALITA’ DI SEMINA
t0
FIBROBLASTI
CHERATINOCITI
t1
(dopo 1 giorno)
-
CHERATINOCITI
t2
(dopo 4 giorni)
-
CHERATINOCITI
t3
(dopo 8 giorni)
-
CHERATINOCITI
PRELIEVO
4 giorni
8 giorni
13 giorni
i frammenti di cute artificiale sono stati prelevati per:
 Valutazione della consistenza ottimale
 Valutazione della densità cellulare ottimale
 Colorazioni istochimiche ed immunoistochimiche
COLTURA PRIMARIA
cheratinociti
fibroblasti 3T3
microscopio a contrasto di fase dopo 8 giorni (400X)
COLTURA SECONDARIA
cheratinociti
cheratinociti
cheratinociti
fibroblasti
cheratinociti
cheratinociti
microscopio a contrasto di fase dopo 12 giorni (400X)
FIBROBLASTI
Derma
Fibroblasti
microscopio a contrasto di fase (400X)
FIBROBLASTI
microscopio a contrasto di fase (400X)
FIBROBLASTI ALL’INTERNO DEL SUPPORTO DI PLASMA
microscopio a contrasto di fase dopo 3 giorni (200X)
fibroblasti
cheratinociti
microscopio a contrasto di fase dopo 4 giorni (200X)
FRAMMENTO DI CUTE ARTIFICIALE
Ematossilina-Eosina (400X)
FIBROBLASTI
Ematossilina-Eosina (400X)
CHERATINOCITI
Ematossilina-Eosina (400X)
FIBROBLASTI
immunoistochimica: vimentina (400X)
CHERATINOCITI
immunoistochimica: citocheratina AE1 (400X)
MEMBRANA BASALE
immunoistochimica: collageno IV
immunoistochimica: Mib1
APPLICAZIONE DELLA METODICA SULLA PAZIENTE
INNESTO DEL LEMBO DI CUTE ARTIFICIALE
prima...
INNESTO DEL LEMBO DI CUTE ARTIFICIALE
..dopo
CONCLUSIONI
SVANTAGGI
VANTAGGI
Permette di ottenere
Supporto fragile e poco
maneggevole
innesti del tutto
autologhi
Facile da preparare
Basso costo