Vol. 20 (3), 2010, 635-802
ISSN 1120-7698
Giornale di Patologia delle Piante
- Giornale di Patologia delle Piante, Vol. 20 (3) 2010, 635-802
Atti del “Workshop”
“V Incontro Nazionale sulle Malattie da
Fitoplasmi”
Proceedings of the Workshop:
“V Italian National Meeting on Phytoplasma Diseases”
A cura di/Edited by
Gianfranco Romanazzi
CRA - Centro di Ricerca per la Patologia Vegetale – Roma
Quadrimestrale - Spedizione in abbonamento postale - Gruppo IV / 70%
PETRIA
Giornale di Patologia delle Piante
(Rivista fondata nel 1991 da Antonio Quacquarelli)
COMITATO DI DIREZIONE / EDITORS
Marina Barba, Roma
Antonio Graniti, Bari
COMITATO SCIENTIFICO / EDITORIAL BOARD
(2007-2010)
Paola Battilani
Luigi Carraro
Maurizio Conti
Ahmed Hadidi
Nicola Iacobellis
Piacenza
Udine
Torino
Beltsville MD USA
Potenza
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Antonio Logrieco
Gaetano Magnano di San Lio
Paolo Magro
Emilio Stefani
Roma
Bari
Reggio Calabria
Viterbo
Bologna
REDATTORI / DEPUTY EDITORS
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COPERTINA/COVER: a cura di Gianfranco Romanazzi e Donato Occhionero /Cover by
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Autorizzazione del Tribunale di Roma n. 284/90 del 03/05/1990
Direttore responsabile: Marina Barba
Stampa eseguita da:
Tipografia CSR S.r.L - Via di Pietralata, 157 - 00158 Roma - Tel. 06.4182113
Chiuso in Redazione 16 settembre 2010
Finito di stampare nel mese di settembre 2010
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
Atti del Convegno:
“V Incontro Nazionale sulle
Malattie da Fitoplasmi”
Proceedings of the Workshop:
“V Italian National MeEting on
Phytoplasma Diseases”
Ancona, Italy, 21-23 Settembre/September 2010
A cura di/Edited by Gianfranco Romanazzi
Comitato Scientifico/Scientific Committee
Alberto Alma
Marina Barba
Assunta Bertaccini
Piero Attilio Bianco
Maurizio Conti
Ruggero Osler
Gianfranco Romanazzi
Comitato Organizzatore/Organizing Committee
Gianfranco Romanazzi
Sergio Murolo
Lucia Landi
Paola Riolo
Erica Feliziani
Sandro Nardi
Dipartimento di Scienze Ambientali e delle Produzioni
Vegetali,
Sezione Protezione delle Piante,
Facoltà di Agraria,
Università Politecnica delle Marche,
via Brecce Bianche, I-60131 Ancona
Tel. +39 071 220 4336 – Fax +39 071 220 4856
e-mail: [email protected]
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
PRESENTAZIONE
Facendo seguito agli appuntamenti tenutisi ad Udine nel 1996 e 1999, a Roma
nel 2002, a Milano nel 2005 e a Roma nel 2008, dal 21 al 23 settembre è previsto ad
Ancona il V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi.
Le malattie da fitoplasmi rivestono sempre maggiore importanza nell’economia nazionale a causa delle ingenti perdite di produzione indotte all’intero comparto
ortofrutticolo e viticolo, oltre alle forti ripercussioni sul territorio conseguenti al rinvenimento di fitoplasmi da quarantena.
L’incontro chiama a raccolta tutti coloro che a livello nazionale si occupano della tematica, sia nell’ambito della ricerca e sperimentazione, dell’applicazione
normativa, dell’assistenza tecnica ed in generale degli interessati al settore, nel quale
nuove conoscenze si rendono disponibili con velocità crescente, in un Paese che è fra
i più impegnati nella tematica a livello mondiale. L’obiettivo è quello di fare il punto
della situazione sulle novità emerse sull’argomento in campo diagnostico, epidemiologico e di lotta nell’ultimo biennio.
presentation
Following the meetings held in Udine in 1996 and 1999, in Rome in 2002, in
Milan in 2005, and in Rome again in 2008, from 21 to 23 September, 2010, Ancona
will host the 5th Italian National Meeting on Phytoplasma Diseases.
Phytoplasma diseases are of continuingly increasing importance worldwide,
not only because they result in loss of grape, fruit and vegetable production, but also
for the problems that arise in areas where these quarantine pathogens are discovered.
This congress will bring together all of the people who work in this field, as
those involved in research and experimentation, and in regulatory aspects, those who
provide technical assistance, and those who have a general interested in this area in
which new information is becoming increasingly available, and in a country that is
one of those most involved in research in this field. The aim of this meeting is to
provide up-to-date information for discussions of the novel aspects regarding the diagnosis, epidemiology and control of phytoplasma diseases from these last two years.
637
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
PROGRAMMA
21 Settembre
13.30 - Registrazione dei partecipanti e affissione dei poster – Aperitivo di benvenuto
14.00 - Saluto delle autorità
14.30 - Relazione introduttiva
Alma A., R. Tedeschi
Vettori di fitoplasmi in Italia: conoscenze, criticità e prospettive/Phytoplasma vectors
in Italy: knowledge, critical aspects and perspectives
SESSIONE I: FITOPLASMOSI DELLE DRUPACEE E DELLE POMACEE I
15.00 - Presentazioni orali
Moderatori: M. Conti e R. Credi
Pasquini G., L. Ferretti, M. Barba
Definizione di protocolli diagnostici di riferimento per i fitoplasmi delle piante da
frutto/Definition of reference diagnostic protocols for fruit plants phytoplasmas
Poggi Pollini C., A.R. Babini, D. Dradi, C.Lanzoni, C. Medoro, S. Paolini, C.
Ratti
Il giallume delle drupacee su albicocco in Emilia-Romagna: il punto sulla situazione
attuale/Progress in European stone fruit yellows research in apricot orchards in
Emilia-Romagna region
Ermacora P., F. Ferrini, N. Loi, R. Osler, M. Martini
Diagnosi e caratterizzazione molecolare di ceppi di ‘Candidatus Phytoplasma
prunorum’ in individui di Cacopsylla pruni del Friuli Venezia Giulia/Detection and
molecular characterisation of ‘Candidatus Phytoplasma prunorum’ in individuals of
Cacopsylla pruni collected in Friuli Venezia Giulia region
Jarausch B., I. Lampe, A. Fuchs, U. Harzer, W. Jarausch
Controllo di Cacopsylla pruni, il vettore del giallume europeo delle Drupacee/Control
of Cacopsylla pruni, the vector of European stone fruit yellows
16.00 - Pausa caffè
SESSIONE I: FITOPLASMOSI DELLE DRUPACEE E DELLE POMACEE II
16.30 - Presentazioni orali e dei poster
Moderatori: M. Barba e M. Pastore
Jarausch W., C. Bisognin, S. Grando, B. Schneider, R. Velasco, E. Seemüller
Selezione di portainnesti di melo resistenti ad Apple proliferation: a che punto siamo?/
Breeding of Apple proliferation resistant-rootstocks: where are we?
638
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
Moser M., R. Velasco, C. Bisognin, W. Jarausch
Nuovi approfondimenti sulla natura della resistenza ad Apple proliferation/New
insights into the nature of resistance to Apple proliferation disease
Pizzinat A., R. Tedeschi, A. Alma
Siti di estivazione e svernamento di Cacopsylla melanoneura (Förster) vettore di
“Candidatus Phytoplasma mali”/Aestivation and overwintering sites of Cacopsylla
melanoneura (Förster) vector of “Candidatus Phytoplasma mali”
Poster
Bisognin C., A.M. Ciccotti, I. Battocletti, M. Deromedi, M. Filippi, P. Bragagna,
M. S. Grando
Risposta a differenti infezioni virali di alcune selezioni di melo resistenti e suscettibili
ad Apple proliferation/Response of Apple proliferation resistant and susceptible
genotypes to different viral infections
Murolo S., G. Murri, G. Romanazzi
Caratterizzazione molecolare di isolati di “Candidatus Phytoplasma prunorum”
rinvenuti su drupacee nelle Marche/Molecular characterisation of “Candidatus
Phytoplasma prunorum” isolates found on stone fruits in Marche region
17.30 – Discussione
22 Settembre
SESSIONE II: ALTRE FITOPLASMOSI
09.00 - Presentazioni orali
Moderatori: A. Bertaccini e G. Romanazzi
Palmano S., C. Jeffries, V. Mulholland, G.S. Saddler
Utilizzo di una sonda LNA in real-time PCR per la diagnosi di fitoplasmi in Solanum
tuberosum/Phytoplasma detection by lna probe-based real-time PCR in Solanum
tuberosum
Molino Lova M., Y. Abou-Jawdah, E. Choueiri, L. Geagea, H. Abdul-Nour, N.
Geze, H. Sobh, S. El Zammar, R. El Khoury, M. Nehme, R. El Amil, R. Fakhr, A.
Haidar, C. Mortada, A. Alma, L. Picciau, R. Tedeschi, A. Vercesi, P. Casati, M.
Perini, R. Maacaroun, C. Mahfoud, E. Mouannes, W. Sakr, P. A. Bianco
‘Candidatus Phytoplasma phoenicium’ in Libano/‘Candidatus Phytoplasma
phoenicium’ in Lebanon
Paltrinieri S., N. Contaldo, M. Davino, S. Davino, A. Bertaccini
Gravi malformazioni in melanzana in Sicilia associate alla presenza di fitoplasmi/
Phytoplasma detection in eggplants showing severe malformation in Sicily
639
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
Poster
Terlizzi F., C. Delvago, R. Zambini, V. Testi, S. Saccò, R. Credi
Stolbur su pomodoro: identificazione e caratterizzazione molecolare del fitoplasma in
Emilia-Romagna/Stolbur on tomato: detection and molecular characterisation of the
phytoplasma in Emilia-Romagna
Pasini M., N. Mori, L. D. Boscaini, S. Paltrinieri, N. Contaldo, A. Bertaccini
Gravi infezioni di stolbur su cetriolo in Veneto/Severe stolbur infections in cucumber
in Veneto region
Mori N., L. Marini, E. Rampin, F. Zanetti, G. Mosca, N. Contaldo, A. Bertaccini
Diffusione di ‘Candidatus phytoplasma asteris’ in colza/Spreading of ‘Candidatus
Phytoplasma asteris’ in oilseed rape
Contaldo N., S. Paltrinieri, A. Bertaccini, M. G. Bellardi
Individuazione del fitoplasma del giallume dell’astro in Centaurium erythraea Rafn./
Detection of aster yellows phytoplasma in Centaurium herythraea Rafn.
Marcone C.
Malattie da fitoplasmi di piante medicinali e nutraceutiche in Italia meridionale/
Phytoplasma diseases of medicinal and nutraceutical plants in southern Italy
Santini A., M. Barcia, V. Mancini, P. Capretti
Indagini sulla diffusione di fitoplasmi in una parcella sperimentale di olmo/Survey on
phytoplasmas spread in an elm experimental plot
Mancini E., C. Marcone, L. De Martino, V. De Feo
Profili alcaloidei di piante di ginestra affette da spartium witches’-broom/Alkaloid
profiling of spartium witches’-broom-affected Spanish broom plants
Galetto L., D. Pacifico, C. Marzachì, D. Bosco
Empoasca decipiens: un nuovo vettore di fitoplasmi/Empoasca decipiens: a new
vector of phytoplasmas
10.30 - Pausa caffè
SESSIONE III: FITOPLASMOSI DELLA VITE I
11.00 - Presentazioni orali
Moderatori: A. Alma e W. Jarausch
Nardi S., Rossini E., Faraglia B.C.
Uno sguardo d’insieme su quarantena e malattie da fitoplasmi/Phytoplasmas as
quarantine pests: an overview
Bertin S., L. Picciau, Z. Ács, A. Alma, D. Bosco
Identificazione molecolare di Cixiidi vettori, accertati e potenziali, del fitoplasma
associato al Legno nero della vite/Molecular identification of the Cixiid species known
or suspected to be vectors of Bois noir
Lessio F., E. Borgogno Mondino, A. Alma
Impiego della geostatistica e delle reti neurali artificiali per lo studio della distribuzione
640
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
spaziale di Scaphoideus titanus Ball/Use of geostatistics and artificial neural networks
for studying the spatial distribution of Scaphoideus titanus Ball
Tessari F., N. Mori, A. Zorloni, F. Quaglino, G. Zanini, P.A. Bianco
Presenza di vettori dei giallumi della vite nella filiera vivaistica in Veneto/Insect
vectors of grapevine yellows in nursery industry of Veneto region
Mori N., N. Reggiani, M. Bacchiavini, F. Pavan, S. Paltrinieri, A. Bertaccini
Presenza e distribuzione di Cixiidi in vigneti di Lambrusco affetti da Legno nero/
Cixiid presence and distribution in Lambrusco vineyards affected by Bois noir
Poster
Cainelli C., A. Gelmetti, R. Zasso, V. Gualandri, M. Bottura, G. Angeli
Monitoraggio dei giallumi della vite in Trentino/Monitoring of grapevine yellows in
Trentino
Pavan F., N. Mori, W. Biasi, C. Peratoner
Distribuzione spaziale di viti affette da Flavescenza dorata/Spatial distribution of
grapevines affected by Flavescence dorée
Riolo P., R. L. Minuz, G. Anfora, M. V. Rossi Stacconi, N. Isidoro, R. Romani
Risposte olfattive di adulti di Hyalesthes obsoletus ai composti volatili di alcune
piante ospiti/Olfactory responses of Hyalesthes obsoletus adults to host plant volatile
compounds
Zorloni A., F. Quaglino, N. Mori, G. Zanini, P.A. Bianco
Ruolo dei portinnesti nella trasmissione di Legno nero: risultati preliminari/The role
of rootstocks in Bois noir transmission: preliminary results
Murolo S., M. Piergiacomi, G. Romanazzi
Suscettibilità a Legno nero di alcune varietà di vite allevate nelle Marche/Sensitivity
to Bois noir of some grapevine cultivars grown in the Marche region
12.30 - Discussione
13.00 - Buffet
14.00 - 18.00 - Visita in campo
20.00 - Cena sociale presso il “Fortino Napoleonico”, Portonovo (AN)
641
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
23 Settembre
SESSIONE III: FITOPLASMOSI DELLA VITE II
09.00 - Presentazioni orali
Moderatori: P.A. Bianco e V. Prota
Endeshaw S.T., S. Murolo, G. Romanazzi, D. Neri
Fotosisntesi e traspirazione: due processi metabolici profondamente modificati in
viti infette da Legno nero/Photosysntesis and traspiration: two metabolic pathways
deeply changed in Bois noir affected grapevines
Landi L., G. Romanazzi
Induzione genica ed enzimatica di proteine associate a meccanismi di difesa in viti
con sintomi di Legno nero e recovered/Defence-related gene expression and enzyme
activity in Bois noir symptomatic and recovered grapevines
Punelli F., P. Uva, A. Ferrarini, F. Faggioli, M. Barba, G. Pasquini
Classi di gene ontology differenzialmente espresse in viti infette dal fitoplasma
stolbur/Differential gene ontology class expression in grapevine affected by the
stolbur phytoplasma
Margaria P., S. Palmano
Analisi proteomica di due cultivar di Vitis vinifera (cv “Nebbiolo” e “Barbera”)
affette da Flavescenza dorata/Proteome profile changes in two grapevine cultivars
(Vitis vinifera L. cv. “Nebbiolo” and “Barbera”) infected by Flavescence dorée
phytoplasma
10.15 - Pausa caffè
SESSIONE III: FITOPLASMOSI DELLA VITE III
10.45 - Presentazioni orali
Moderatori: R. Osler e N. Mori
Borgo M., I. Bazzo, D. Bellotto, N. Bertazzon, L. Filippin, V. Forte, L. Stringher,
E. Angelini
Incidenza dei giallumi in barbatellai e vigneti giovani/Occurrence of grapevine
yellows in nurseries and young vineyards
Pacifico D., V. Pelizzaro, L. Picciau, C. Marzachì
Variabilità del fitoplasma associato al Legno nero in diversi vigneti del Piemonte/
Variability of Bois noir phytoplasma isolates in several vineyards of Piedmont
Murolo S., C. Marcone, X. Foissac., V. Prota, R. Garau, G. Romanazzi
Caratterizzazione molecolare del fitoplasma dello stolbur in vite ed ospiti erbacei/
Molecular characterization of stolbur phytoplasma in grapevine and herbaceous
hosts
642
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
Bulgari D., P. Casati, F. Quaglino, P. Crepaldi, A. Zorloni, P. A. Bianco
Comunità batteriche associate a viti sane, infette da fitoplasmi e risanate/Comparison
of endophytic bacterial community associated with healthy, GY-diseased and
recovered grapevine plants
Bianco P.A., A. Zorloni, N. Parisi, P. Casati, A. Colombo, R. Tonesi
Prove di termoterapia su materiale di propagazione viticolo appartenente a varietà
coltivate in Lombardia affette da giallumi/Sanitation of Grapevine yellows affected
cultivars of Lombardia region by hot water treatment
Romanazzi G., S. Murolo, E. Feliziani, A. Masciulli, F. Patrizio, M. Piergiacomi,
D. D’Ascenzo
E’ possibile controllare il Legno nero della vite mediante l’applicazione di induttori
di resistenza? Risultati di 4 anni di trattamenti in campo/Is it possible to contain
grapevine Bois noir by application of resistance inducers? Results of four years of
field trials
12.30 - Discussione finale
12.50 - Consegna del premio “Luigi Carraro”
13.00 - Chiusura dell’incontro – Buffet
643
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
INDICE
RELAZIONE INTRODUTTIVA
Alma A., R. Tedeschi
Vettori di fitoplasmi in Italia: conoscenze, criticità e prospettive/Phytoplasma vectors
in Italy: knowledge, critical aspects and perspectives ......................................pag. 650
SESSIONE I: FITOPLASMOSI DELLE DRUPACEE E POMACEE I
ORALE
Pasquini G., L. Ferretti, M. Barba
Definizione di protocolli diagnostici di riferimento per i fitoplasmi delle piante da
frutto/Definition of reference diagnostic protocols for fruit plants phytoplasmas
pag. 664
Poggi Pollini C., A.R. Babini, D. Dradi, C.Lanzoni, C. Medoro, S. Paolini, C.
Ratti
Il giallume delle drupacee su albicocco in Emilia-Romagna: il punto sulla situazione
attuale/Progress in European stone fruit yellows research in apricot orchards in
Emilia-Romagna region ...................................................................................pag. 667
Ermacora P., F. Ferrini, N. Loi, R. Osler, M. Martini
Diagnosi e caratterizzazione molecolare di ceppi di ‘Candidatus Phytoplasma
prunorum’ in individui di Cacopsylla pruni del Friuli Venezia Giulia/Detection and
molecular characterisation of ‘Candidatus Phytoplasma prunorum’ in individuals of
Cacopsylla pruni collected in Friuli Venezia Giulia region ..............................pag. 670
Jarausch B., I. Lampe, A. Fuchs, U. Harzer, W. Jarausch
Controllo di Cacopsylla pruni, il vettore del giallume europeo delle Drupacee/Control
of Cacopsylla pruni, the vector of European stone fruit yellows .......................pag. 673
SESSIONE I: FITOPLASMOSI DELLE DRUPACEE E POMACEE II
ORALE
Jarausch W., C. Bisognin, S. Grando, B. Schneider, R. Velasco, E. Seemüller
Selezione di portainnesti di melo resistenti ad Apple proliferation: a che punto siamo?/
Breeding of Apple proliferation resistant-rootstocks: where are we? ...............pag. 675
644
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
Moser M., R. Velasco, C. Bisognin, W. Jarausch
Nuovi approfondimenti sulla natura della resistenza ad Apple proliferation/New
insights into the nature of resistance to Apple proliferation disease ................pag. 678
Pizzinat A., R. Tedeschi, A. Alma
Siti di estivazione e svernamento di Cacopsylla melanoneura (Förster) vettore di
“Candidatus Phytoplasma mali”/Aestivation and overwintering sites of Cacopsylla
melanoneura (Förster) vector of “Candidatus Phytoplasma mali” .................pag. 681
POSTER
Bisognin C., A.M. Ciccotti, I. Battocletti, M. Deromedi, M. Filippi, P. Bragagna,
M. S. Grando
Risposta a differenti infezioni virali di alcune selezioni di melo resistenti e suscettibili
ad Apple proliferation/Response of Apple proliferation resistant and susceptible
genotypes to different viral infections ..............................................................pag. 685
Murolo S., G. Murri, G. Romanazzi
Caratterizzazione molecolare di isolati di “Candidatus Phytoplasma prunorum”
rinvenuti su drupacee nelle Marche/Molecular characterisation of “Candidatus
Phytoplasma prunorum” isolates found on stone fruits in Marche region .......pag. 687
SESSIONE II: ALTRE FITOPLASMOSI
ORALE
Palmano S., C. Jeffries, V. Mulholland, G.S. Saddler
Utilizzo di una sonda LNA in real-time PCR per la diagnosi di fitoplasmi in Solanum
tuberosum/Phytoplasma detection by lna probe-based real-time PCR in Solanum
tuberosum ........................................................................................................pag. 691
Molino Lova M., Y. Abou-Jawdah, E. Choueiri, L. Geagea, H. Abdul-Nour, N.
Geze, H. Sobh, S. El Zammar, R. El Khoury, M. Nehme, R. El Amil, R. Fakhr, A.
Haidar, C. Mortada, A. Alma, L. Picciau, R. Tedeschi, A. Vercesi, P. Casati, M.
Perini, R. Maacaroun, C. Mahfoud, E. Mouannes, W. Sakr, P. A. Bianco
‘Candidatus Phytoplasma phoenicium’ in Libano/‘Candidatus Phytoplasma
phoenicium’ in Lebanon ...................................................................................pag. 694
Paltrinieri S., N. Contaldo, M. Davino, S. Davino, A. Bertaccini
Gravi malformazioni in melanzana in Sicilia associate alla presenza di fitoplasmi/
Phytoplasma detection in eggplants showing severe malformation in Sicily .....pag.697
645
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
POSTER
Terlizzi F., C. Delvago, R. Zambini, V. Testi, S. Saccò, R. Credi
Stolbur su pomodoro: identificazione e caratterizzazione molecolare del fitoplasma in
Emilia-Romagna/Stolbur on tomato: detection and molecular characterisation of the
phytoplasma in Emilia-Romagna .....................................................................pag. 699
Pasini M., N. Mori, L. D. Boscaini, S. Paltrinieri, N. Contaldo, A. Bertaccini
Gravi infezioni di stolbur su cetriolo in Veneto/Severe stolbur infections in cucumber
in Veneto region ................................................................................................pag. 702
Mori N., L. Marini, E. Rampin, F. Zanetti, G. Mosca, N. Contaldo, A. Bertaccini
Diffusione di ‘Candidatus phytoplasma asteris’ in colza/Spreading of ‘Candidatus
Phytoplasma asteris’ in oilseed rape ................................................................pag. 705
Contaldo N., S. Paltrinieri, A. Bertaccini, M. G. Bellardi
Individuazione del fitoplasma del giallume dell’astro in Centaurium erythraea Rafn./
Detection of aster yellows phytoplasma in Centaurium herythraea Rafn. ........pag. 708
Marcone C.
Malattie da fitoplasmi di piante medicinali e nutraceutiche in Italia meridionale/
Phytoplasma diseases of medicinal and nutraceutical plants in southern Italy.pag. 711
Santini A., M. Barcia, V. Mancini, P. Capretti
Indagini sulla diffusione di fitoplasmi in una parcella sperimentale di olmo/Survey on
phytoplasmas spread in an elm experimental plot ............................................pag. 715
Mancini E., C. Marcone, L. De Martino, V. De Feo
Profili alcaloidei di piante di ginestra affette da spartium witches’-broom/Alkaloid
profiling of spartium witches’-broom-affected Spanish broom plants ..............pag. 718
Galetto L., D. Pacifico, C. Marzachì, D. Bosco
Empoasca decipiens: un nuovo vettore di fitoplasmi/Empoasca decipiens: a new
vector of phytoplasmas ....................................................................................pag. 722
SESSIONE III: FITOPLASMOSI DELLA VITE I
ORALE
Nardi S., Rossini E., Faraglia B.C.
Uno sguardo d’insieme su quarantena e malattie da fitoplasmi/Phytoplasmas as
quarantine pests: an overview ........................................................................pag. 725
646
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
Bertin S., L. Picciau, Z. Ács, A. Alma, D. Bosco
Identificazione molecolare di Cixiidi vettori, accertati e potenziali, del fitoplasma
associato al Legno nero della vite/Molecular identification of the Cixiid species known
or suspected to be vectors of Bois noir .............................................................pag. 728
Lessio F., E. Borgogno Mondino, A. Alma
Impiego della geostatistica e delle reti neurali artificiali per lo studio della distribuzione
spaziale di Scaphoideus titanus Ball/Use of geostatistics and artificial neural networks
for studying the spatial distribution of Scaphoideus titanus Ball ......................pag. 731
Tessari F., N. Mori, A. Zorloni, F. Quaglino, G. Zanini, P.A. Bianco
Presenza di vettori dei giallumi della vite nella filiera vivaistica in Veneto/Insect
vectors of grapevine yellows in nursery industry of Veneto region ...................pag. 734
Mori N., N. Reggiani, M. Bacchiavini, F. Pavan, S. Paltrinieri, A. Bertaccini
Presenza e distribuzione di Cixiidi in vigneti di Lambrusco affetti da Legno nero/
Cixiid presence and distribution in Lambrusco vineyards affected by Bois noir
..........................................................................................................................pag. 737
POSTER
Cainelli C., A. Gelmetti, R. Zasso, V. Gualandri, M. Bottura, G. Angeli
Monitoraggio dei giallumi della vite in Trentino/Monitoring of grapevine yellows in
Trentino ............................................................................................................pag. 740
Pavan F., N. Mori, W. Biasi, C. Peratoner
Distribuzione spaziale di viti affette da Flavescenza dorata/Spatial distribution of
grapevines affected by Flavescence dorée ......................................................pag. 743
Riolo P., R. L. Minuz, G. Anfora, M. V. Rossi Stacconi, N. Isidoro, R. Romani
Risposte olfattive di adulti di Hyalesthes obsoletus ai composti volatili di alcune
piante ospiti/Olfactory responses of Hyalesthes obsoletus adults to host plant volatile
compounds .......................................................................................................pag. 746
Zorloni A., F. Quaglino, N. Mori, G. Zanini, P.A. Bianco
Ruolo dei portinnesti nella trasmissione di Legno nero: risultati preliminari/The role
of rootstocks in Bois noir transmission: preliminary results ............................pag. 749
Murolo S., M. Piergiacomi, G. Romanazzi
Suscettibilità a Legno nero di alcune varietà di vite allevate nelle Marche/Sensitivity
to Bois noir of some grapevine cultivars grown in the Marche region ............pag. 752
647
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
SESSIONE III: FITOPLASMOSI DELLA VITE II
ORALE
Endeshaw S.T., S. Murolo, G. Romanazzi, D. Neri
Fotosisntesi e traspirazione: due processi metabolici profondamente modificati in viti
infette da Legno nero/Photosysntesis and traspiration: two metabolic pathways deeply changed in Bois noir affected grapevines ...................................................pag. 755
Landi L., G. Romanazzi
Induzione genica ed enzimatica di proteine associate a meccanismi di difesa in viti
con sintomi di Legno nero e recovered/Defence-related gene expression and enzyme
activity in Bois noir symptomatic and recovered grapevines ............................pag. 758
Punelli F., P. Uva, A. Ferrarini, F. Faggioli, M. Barba, G. Pasquini
Classi di gene ontology differenzialmente espresse in viti infette dal fitoplasma stolbur/Differential gene ontology class expression in grapevine affected by the stolbur
phytoplasma .....................................................................................................pag. 762
Margaria P., S. Palmano
Analisi proteomica di due cultivar di Vitis vinifera (cv “Nebbiolo” e “Barbera”)
affette da Flavescenza dorata/Proteome profile changes in two grapevine cultivars
(Vitis vinifera L. cv. “Nebbiolo” and “Barbera”) infected by Flavescence dorée
phytoplasma .....................................................................................................pag. 765
SESSIONE III: FITOPLASMOSI DELLA VITE III
ORALE
Borgo M., I. Bazzo, D. Bellotto, N. Bertazzon, L. Filippin, V. Forte, L. Stringher,
E. Angelini
Incidenza dei giallumi in barbatellai e vigneti giovani/Occurrence of grapevine
yellows in nurseries and young vineyards ........................................................pag. 767
Pacifico D., V. Pelizzaro, L. Picciau, C. Marzachì
Variabilità del fitoplasma associato al Legno nero in diversi vigneti del Piemonte/Variability of Bois noir phytoplasma isolates in several vineyards of Piedmont ...pag.769
Murolo S., C. Marcone, X. Foissac., V. Prota, R. Garau, G. Romanazzi
Caratterizzazione molecolare del fitoplasma dello stolbur in vite ed ospiti erbacei/
Molecular characterization of stolbur phytoplasma in grapevine and herbaceous
hosts .................................................................................................................pag. 772
648
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
Bulgari D., P. Casati, F. Quaglino, P. Crepaldi, A. Zorloni, P. A. Bianco
Comunità batteriche associate a viti sane, infette da fitoplasmi e risanate/Comparison
of endophytic bacterial community associated with healthy, GY-diseased and recovered grapevine plants .......................................................................................pag. 776
Bianco P.A., A. Zorloni, N. Parisi, P. Casati, A. Colombo, R. Tonesi
Prove di termoterapia su materiale di propagazione viticolo appartenente a varietà
coltivate in Lombardia affette da giallumi/Sanitation of Grapevine yellows affected
cultivars of Lombardia region by hot water treatment .....................................pag. 779
Romanazzi G., S. Murolo, E. Feliziani, A. Masciulli, F. Patrizio, M. Piergiacomi,
D. D’Ascenzo
E’ possibile controllare il Legno nero della vite mediante l’applicazione di induttori
di resistenza? Risultati di 4 anni di trattamenti in campo/Is it possible to contain
grapevine Bois noir by application of resistance inducers? Results of four years of
field trials .........................................................................................................pag. 782
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Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
Vettori di fitoplasmi in Italia: conoscenze,
criticità e prospettive
A. Alma, R. Tedeschi
DIVAPRA, Entomologia e Zoologia applicate all’Ambiente “C. Vidano”, Università
degli Studi di Torino
Via Leonardo da Vinci, 44, I-10095 Grugliasco (TO)
E-mail: [email protected]
I vettori di fitoplasmi sono insetti eterometaboli, floemomizi appartenenti
all’ordine Hemiptera. Nell’ambito di questo ordine, la famiglia Cicadellidae racchiude
il maggior numero di specie vettrici, seguita dalle famiglie Cixiidae, Delphacidae,
Derbidae, Cercopidae e Flatidae della superfamiglia Fulgoroidea. Infine, anche due
generi della famiglia Psyllidae comprendono specie in grado di trasmettere importanti
fitoplasmi dei fruttiferi (Weintraub e Beanland, 2006; Alma, 2008).
Gli insetti vettori di fitoplasmi possono essere monofagi, oligofagi, o polifagi e
possono trasmettere uno o più fitoplasmi, così come un singolo fitoplasma può essere
trasmesso da più specie di fitomizi con varie ripercussioni sull’epidemiologia delle
malattie.
La trasmissione è di tipo persistente propagativo, e per alcune specie è stata
anche dimostrata la trasmissione transovarica del patogeno (Alma et al., 1997;
Hanboonsong et al., 2000; Kawakita et al., 2000; Tedeschi et al., 2006). Le interazioni
fitoplasma-vettore sono comunque molto complesse e oltre ad influire sull’efficienza
di trasmissione, possono influenzare la fitness del vettore stesso, in modo positivo o
negativo (Marzachì et al., 2004; Bosco et al., 2007; Galetto et al., 2009; Malagnini
et al., 2010).
Negli ultimi anni, in Italia, numerose ricerche sono state finalizzate
all’approfondimento di vari aspetti riguardanti vettori già noti e accertati, mentre
poche novità sono emerse per altri insetti presunti o potenziali vettori. In molte realtà
agricole nazionali, non è sempre possibile spiegare in maniera soddisfacente e completa
la diffusione più o meno rapida di alcune fitoplasmosi basandosi sulle conoscenze dei
pochi vettori noti. Un esempio classico è quello dell’agroecosistema vigneto, dove
abbiamo un vettore certo, strettamente legato alla vite, quale Scaphoideus titanus Ball
per quanto riguarda la Flavescenza dorata (FD), mentre per quanto attiene il Legno
nero (LN) l’unico vettore noto, sebbene colonizzi la vite solo in maniera occasionale,
è sempre risultato essere Hyalesthes obsoletus Signoret (Belli et al., 2010). Se da
una parte non è sempre facile spiegare la presenza sporadica di FD in quegli areali
dove S. titanus non è ancora presente, per esempio nell’Italia centrale (Credi et al.,
2002); dall’altra la diffusione epidemica del LN non è imputabile solamente a H.
obsoletus, anch’esso a volte assente o presente con basse densità e comunque legato
a vite in modo puramente occasionale. Per questo motivo studi sono stati intrapresi
per individuare eventuali nuovi vettori. In particolare, in seguito al rilevamento
650
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
della presenza del fitoplasma agente causale di FD in piante di Clematis vitalba L.
presenti nei vigneti o nel circondario, il ruolo della polifaga Dictyophara europaea
(L.), comunemente presente su questa pianta e in vigneto in Serbia e nell’Italia
nordorientale, è stato indagato. La specie è stata in grado di acquisire l’isolato FDCS da clematide e trasmetterlo a vite in condizioni controllate (Filippin et al., 2009).
Questo risultato potrebbe portare a nuovi sviluppi nello studio della diffusione della
malattia in tutti quegli areali in cui la clematide è abbondante e con elevate percentuali
di infezione. Per quanto riguarda il LN, altri cixiidi oltre alla specie H. obsoletus,
sono ripetutamente risultati positivi al fitoplasma agente causale della malattia: H.
scotti Ferrari, H. luteipes Fieber e Reptalus quinquecostatus (Dufour) (Trivellone et
al., 2005; Alma, 2009). Prove controllate di laboratorio hanno permesso di accertare
la capacità di R. quinquecostatus di trasmettere il fitoplasma a un mezzo nutritivo
artificiale (Pinzauti et al., 2008). Prove di trasmissione del fitoplasma a vite si rendono
comunque necessarie per accertare il ruolo di vettore di questa o altre specie per
meglio interpretare l’epidemiologia della malattia.
Nell’agroecosistema frutteto invece la rapida diffusione dei Giallumi europei
delle drupacee (ESFY) rilevata in tutto il nord Italia non è sempre correlabile alla
presenza del vettore Cacopsylla pruni (Scopoli), presente spesso con densità di
popolazione molto basse anche perché predilige specie di Prunus spontanei come
P. spinosa L., comprovata sorgente d’inoculo del fitoplasma, tendenzialmente
asintomatica (Poggi Pollini e Giunchedi, 2008; Marcone et al., 2010). Sebbene non sia
da escludere la possibile esistenza di qualche altro vettore, non bisogna sottovalutare
la sanità del materiale vivaistico di partenza.
In Italia permangono ancora grosse lacune sulle conoscenze riguardanti gli
insetti vettori di fitoplasmi. Infatti per molte malattie presenti sul territorio non si
conoscono ancora i vettori. Per esempio, negli ultimi anni sono stati ripetutamente
segnalati attacchi di fitoplasmi a piante aromatiche: è questa una realtà di “nicchia”,
ma in alcune regioni, come la Liguria, l’incidenza economica non è indifferente.
Purtroppo, essendo ancora sconosciuti i vettori, le strategie di difesa risultano di
difficile applicazione. Nell’ultimo anno sono anche state rilevate nel nord Italia piante
di mais affette da fitoplasmi dei gruppi 16SrI (Aster yellows), 16SrIII (X disease) e
16SrXII (stolbur), in alcuni casi con infezioni miste (Calari et al., 2010): i vettori di
questi fitoplasmi a mais in Italia sono ancora sconosciuti, anche se in Serbia prove
di trasmissione controllata hanno accertato l’attitudine di Reptalus panzeri (Löw) a
trasmettere fitoplasmi del gruppo stolbur a piante di mais (Jović et al., 2009).
Inoltre, lo studio degli insetti vettori di fitoplasmi presenta alcuni aspetti critici
da considerare. In primis, per alcune specie vi sono dei problemi nell’identificazione
specifica. Infatti, in alcuni casi è molto difficile se non impossibile, distinguere due
specie in base alle sole caratteristiche morfologiche. Questo inconveniente rende
problematico qualunque tipo di analisi sulle specie, di studio dell’epidemiologia
delle malattie e di applicazione di strategie di controllo mirate. Per questo motivo,
negli ultimi anni sono state sviluppate nuove tecniche molecolari che permettono
di discriminare con certezza specie criptiche. Nuovi primers disegnati sulla regione
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Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
di controllo (CR) del DNA mitocondriale (Tedeschi e Nardi, 2010), consentono di
distinguere con una semplice PCR la psilla Cacopsylla melanoneura (Förster), vettore
di “Candidatus Phytoplasma mali” dalla congenere C. affinis (Löw) con la quale
convive su biancospino. I maschi delle due specie possono essere distinti mediante
l’osservazione del paramero genitale, ma le femmine, così come anche i giovani,
sono praticamente indistinguibili dal punto di vista morfologico. La possibilità di
discriminare le due specie permetterà di acquisire nuove informazioni sulla loro abilità
nel trasmettere il fitoplasma, in particolare per quanto riguarda C. affinis, già risultata
positiva a fitoplasmi del gruppo dell’Apple proliferation (AP) (Tedeschi et al., 2009).
Analogamente, Bertin et al. (2010a, 2010b) hanno sviluppato due protocolli di analisi
PCR-RFLP, con amplificazione di una frazione del gene mitocondriale COI o del gene
ITS2 e digestione mediante enzimi di restrizione che permettono di distinguere diverse
specie di cixiidi, quattro del genere Reptalus: R. quinquecostatus, R. melanochaetus
(Fieber), R. cuspidatus (Fieber), e R. panzeri e tre del genere Hyalesthes: H. obsoletus,
H. luteipes e H. scotti. Questi protocolli hanno importanti ripercussioni pratiche su
studi faunistici e di monitoraggio dei vettori. È, infatti, in questo modo possibile
identificare giovani e femmine permettendo di estendere il periodo di raccolta a tutto
l’anno, inoltre, considerando che i giovani sono strettamente infeudati agli apparati
radicali, saranno possibili studi approfonditi sulle associazioni delle singole specie
con le piante ospiti al fine di chiarirne il ciclo biologico.
Le piante ospiti rappresentano un altro punto di criticità nello studio degli insetti
vettori. Le specie ospiti sono diverse e non tutte conosciute, ma sono di fondamentale
importanza per l’epidemiologia delle fitoplasmosi, sia come cardine per il ciclo
biologico degli insetti, sia come sorgente d’inoculo dei fitoplasmi. Recentemente
studi approfonditi sono stati fatti sul ruolo del biancospino nell’epidemiologia dei
fitoplasmi del gruppo AP. Questa pianta è ospite di C. melanoneura e di altre specie
di psille [C. affinis, C. peregrina (Förster), C. crataegi (Schrank)] che sono risultate
positive ai fitoplasmi del medesimo gruppo; lo stesso biancospino è risultato positivo
a “Ca. Phytoplasma mali” e a “Ca. Phytoplasma pyri” (Tedeschi et al., 2009). Inoltre,
la recente individuazione dei siti di estivazione e svernamento di C. melanoneura apre
nuove prospettive nello studio dell’epidemiologia di “Ca. Phytoplasma mali”.
Complesso è il discorso delle piante ospiti nel caso dei vettori dei giallumi
della vite, particolarmente in riferimento ai cixiidi, per i quali la vite è solo un’ospite
occasionale per gli adulti. Essi sono tendenzialmente polifagi, ma preferiscono
svolgere, come nel caso di H. obsoletus, il loro ciclo vitale su piante spontanee
specifiche a seconda anche dell’origine geografica. In Piemonte H. obsoletus svolge
prevalentemente il suo ciclo biolgico su Urtica dioica L., anche se sono stati reperiti
stadi giovanili su convolvolo (Lessio et al., 2007; Picciau et al., 2008), ospite molto
più importante in Germania insieme a Calystegia sepium (L.) e Ranunculus bulbosus
L. (Langer et al., 2003; Langer e Maixner, 2004). Probabilmente per i cixiidi molte
piante ospiti sono ancora sconosciute; come dimostra la recente segnalazione di stadi
giovanili reperiti su radici di Lamium orvala L., sulla quale l’insetto può compiere il
suo ciclo vitale (Forte et al., 2010).
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Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
Per molti vettori di fitoplasmi si suppone la presenza di diverse popolazioni
intraspecifiche. Per esempio, si presume che possano esistere differenti popolazioni
di C. melanoneura a causa di diverse efficienze di trasmissione ottenute nell’Italia
nordoccidentale, nell’Italia nordorientale e in Germania (Tedeschi e Alma, 2004;
Mattedi et al., 2008; Mayer et al., 2009). Studi molecolari per esempio con l’uso di
micro satelliti (Malagnini et al., 2007), come avvenuto in Francia nei confronti di
C. pruni (Sauvion et al., 2009) potrebbero chiarire questi aspetti controversi. Non
bisogna comunque escludere l’influenza di diverse combinazioni insetto vettoreisolato del fitoplasma che potrebbero influire sull’efficienza di trasmissione (Casati
et al., 2010).
Le prospettive sullo studio degli insetti vettori di fitoplasmi riguardano senza
dubbio l’individuazione di nuove strategie di lotta, più mirate e comunque rispettose
dell’ambiente. Le recenti tecniche riguardanti nuovi mezzi di determinazione delle
specie, nonché il reperimento di nuove piante ospiti permetteranno di definire
interventi più tempestivi e adeguati. L’accertamento inoltre di nuove specie d’insetti
vettori mediante l’allestimento di prove di trasmissione controllate consentiranno di
indirizzare i trattamenti verso le specie più pericolose e gli stadi più vulnerabili in
relazione al ciclo biologico.
Dal punto di vista di una gestione integrata delle colture, interessante è
la prospettiva di controllo degli insetti vettori mediante l’utilizzo degli elicitori
di resistenza, molecole o microrganismi che inducono nella pianta una risposta di
resistenza sistemica ad attacchi di patogeni di varia natura (Romanazzi et al., 2009;
D’Amelio et al., 2010).
La scelta del prodotto insetticida non deve essere trascurata, sono, infatti, da
preferire quei principi attivi con elevata rapidità d’azione, perché in questo modo
maggiore è la velocità con cui è inibita l’attività trofica e di conseguenza la trasmissione
del fitoplasma. Per esempio diverse classi d’insetticidi dimostrano buona attività
nell’abbattimento delle popolazioni di cicaline, mentre i neonicotinoidi sistemici sono
più efficaci nell’inibire la trasmissione (Saracco et al., 2008).
Lo studio della microflora simbionte degli insetti vettori apre inoltre prospettive
innovative per il contenimento delle popolazioni di vettori mediante l’applicazione
di un controllo simbiotico. Recenti indagini sugli endosimbionti di S. titanus e H.
obsoletus hanno messo in evidenza come batteri del genere Asaia sono dominanti
nella microflora di S. titanus e colonizzano diversi organi, comprese le ghiandole
salivari e gli organi riproduttivi, dove vi è anche il fitoplasma. Questa caratteristica
rende questi batteri coltivabili degli ottimi candidati per un approccio paratransgenico
al loro utilizzo per il controllo della trasmissione del fitoplasma. Analogamente
un batterio vicino a “Ca. Sulcia muelleri” è stato osservato in diversi organi di H.
obsoletus (Alma et al., 2010).
Infine, nuovi approcci di lotta ai vettori possono derivare dall’uso di segnali
vibrazionali emessi dagli insetti stessi. Recenti studi riguardanti il comportamento
sessuale di S. titanus hanno evidenziato che le femmine si accoppiano una sola volta,
mentre i maschi più volte e che questi ultimi possono anche emettere segnali di disturbo
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Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
nei confronti dei maschi rivali (Mazzoni et al., 2009a). Un tentativo d’inibizione degli
accoppiamenti è stato realizzato mediante l’emissione in playback di un segnale di
disturbo (Mazzoni et al., 2009b).
Alla base di qualsiasi strategia di lotta, molto importante è il monitoraggio
degli insetti vettori. Recentemente nuove acquisizioni sui campionamenti dei vettori
sono state ottenute. Le tecniche di marcatura e ricattura possono fornire importanti
informazioni sull’attività di volo e la dispersione dei vettori. Lessio et al. (2008)
hanno sperimentato la marcatura di S. titanus con marcatori fluorescenti, mentre
sono in corso prove di marcatura con proteine di origine alimentare, quali ad esempio
albumina e caseina, da rilevare con analisi ELISA.
Una tecnica innovativa per studiare l’influenza di alcuni fattori ambientali sulle
popolazioni di S. titanus deriva dall’impiego della geostatistica e delle reti neurali
artificiali. Risultati preliminari mostrano come gli input più condizionanti sono la
gestione fitosanitaria, la radiazione solare potenziale, la quota e il rapporto perimetroarea del vigneto (Lessio et al., sottomesso).
Recentemente diversi studi hanno sottolineato la complessità che caratterizza
le relazioni tra i microrganismi simbionti o patogeni associati agli insetti e i propri
ospiti. In particolare, è stato riscontrato come batteri degli stessi gruppi tassonomici
che comprendono gli agenti di svariate malattie delle piante possano essere benefici
per l’insetto che li trasmette, e persino non indurre sintomi nell’ospite vegetale.
Emerge dunque la possibilità che microrganismi inizialmente simbionti secondari
d’insetti (vale a dire simbionti facoltativi non fondamentali per la sopravvivenza
dell’ospite, ma in grado di migliorarne la fitness), siano poi evoluti in agenti
fitopatogeni come conseguenza del loro inoculo nel vegetale. Infatti, l’introduzione di
cellule batteriche nei tessuti in cui si nutrono gli insetti è molto frequente nel caso dei
simbionti secondari, per garantire il trasferimento orizzontale da insetto a insetto come
trasmissione aggiuntiva a quella verticale. Bressan et al. (2009) hanno evidenziato che
il γ-3 proteobatterio responsabile della sindrome “basses richesses” della bietola da
zucchero, trasmesso dal cixiide Pentastiridius leporinus L., sia evoluto in primo luogo
come batterio associato all’insetto, in quanto appartiene ad un gruppo che include
diversi batteri del genere Arsenophonous, simbionti secondari di numerosi artropodi.
Tra i microrganismi associati al vettore del fitoplasma responsabile del
Pear Decline, lo psillide Cacopsylla pyri L., è stato recentemente osservato l’αproteobatterio ‘Ca. Liberibacter europaeus’, appartenente al genere che include gli
agenti eziologici di malattie degli agrumi e di diverse solanacee (Raddadi et al., in
stampa). Al contrario dei suoi vicini più prossimi, ‘Ca. Liberibacter europaeus’, dalle
prime prove di trasmissione condotte, non sembra essere patogeno per il pero, al quale
è trasmesso da C. pyri, e la sua stretta associazione con l’insetto suggerisce che il
microrganismo possa portare benefici al suo ospite.
Questi simbionti secondari presenti nelle piante e spesso associati a diversi
fitoplasmi potrebbero esercitare un’azione sinergica con questi ultimi nel determinare
malattie a oggi, esclusivamente, associate a Mollicutes quali agenti eziologici.
Parole chiave: Hemiptera, Identificazione specifica, Lotta, Piante ospiti, Procarioti.
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Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
Phytoplasma vectors in Italy: knowledge, critical aspects and perspectives
Phytoplasma vectors are heterometabolic phloem-feeding insects that belong
to the order Hemiptera. Within this order, the family Cicadellidae contains most of the
vector species, followed by the families Cixiidae, Delphacidae, Derbidae, Cercopidae
and Flatidae in the superfamily Fulgeroidea. Finally, two genera in the family
Psyllidae also include species that can transmit important phytoplasmas to fruit trees
(Weintraub and Beanland, 2006; Alma, 2008).
Insect vectors of phytoplasmas can be monophagous, oligophagous or
polyphagous, and can transmit one or more phytoplasmas; moreover, a single
phytoplasma can be vectored by different insects, with several implications for disease
epidemiology.
Phytoplasmas are transmitted in a persistent propagative way; in addition,
transovaric pathogen transmission has also been demonstrated for some species
(Alma et al., 1997; Kawakita et al., 2000; Hanboonsong et al., 2000; Tedeschi et
al., 2006). Moreover phytoplasma-vector interactions are complex, and as well as
affecting transmission efficiency, they can have positive or negative influences on the
fitness of the vector itself (Marzachì et al., 2004; Bosco et al., 2007; Galetto et al.,
2009; Malagnini et al., 2010).
Over recent years, in Italy, a lot of research has focused on different aspects
concerning vectors that are well known, while only a little new information has
emerged regarding other insects that are presumed or potential vectors. In several
national agricultural situations, it is not always possible to explain in a complete and
satisfactory way why some phytoplasmoses are rapidly or slowly spreading, based on
the knowledge of the few known vectors.
A typical example is the vineyard agro-ecosystem, where a vector is known
for Flavescence dorée (FD), the leafhopper Scaphoideus titanus Ball, which is
monophagous on grapevine (Belli et al., 2010), while for Bois noir (BN), the only
recognised vector is Hyalesthes obsoletus Signoret, although it only occasionally
colonises grapevine. It is sometimes hard to explain the sporadic occurrence of FD
in areas where S. titanus is not yet present, such as central Italy (Credi et al., 2002);
on the other hand, the epidemic diffusion of BN cannot be ascribed solely to H.
obsoletus, as it is sometimes absent, or present at a very low density, in affected areas,
and considering also its occasional relation with grapevines. Thus studies have been
conducted to identify new potential vectors. In particular, following the detection
of the FD phytoplasma in the plant Clematis vitalba L. present in vineyards or in
neighbouring areas, the role of the polyphagous Dictyophara europaea (L.) has been
investigated, which commonly occurs on this plant and in vineyards in Serbia and
in north-western Italy. This species has been seen to acquire the FD-CS isolate from
clematis, and to transmit it to grapevine under controlled conditions (Filippin et al.,
2009). Such a result could lead to new developments in the study of disease diffusion
in those areas where clematis is abundant and highly infected. Regarding BN, other
cixiids besides H. obsoletus have repeatedly resulted positive for the phytoplasma
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Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
responsible for this disease, such as H. scotti Ferrari, H. luteipes Fieber and Reptalus
quinquecostatus (Dufour) (Trivellone et al., 2005; Alma, 2009). Controlled laboratory
trials have verified the ability of R. quinquecostatus to transmit the phytoplasma to an
artificial feeding system (Pinzauti et al., 2008). Phytoplasma transmission experiments
to grapevine are needed to show the vector roles of this and other species, to better
understand the disease epidemiology.
In orchard agro-ecosystems, the rapid diffusion of European stone fruit yellows
(ESFY) that has been seen in all of northern Italy cannot always be connected with
the presence of the vector Cacopsylla pruni (Scopoli), which often occurs at a low
population density. Also due to a preference for spontaneous Prunus species, such
as P. spinosa L., these have been demonstrated as a reservoir for the phytoplasma,
and are generally asymptomatic (Poggi Pollini and Giunchedi, 2008; Marcone et al.,
2010). Although the possible occurrence of another vector cannot be excluded, the
safety of nursery material must not be underestimated.
In Italy a lack of knowledge still exists about the insect vectors of phytoplasmas.
Indeed, no vectors are known at present for several diseases present in several areas.
As an example, in the last few years, phytoplasma attacks on aromatic plants have
repeatedly been reported; these are niche products, although in some regions, such as
Liguria, they have a considerable economic incidence. Unfortunately, as the vectors
are still unknown, control strategies are difficult to apply. Over the last year, maize
plants infected by phytoplasmas belonging to the groups 16SrI (Aster yellows), 16SrIII
(X disease) and 16SrXII (stolbur) have also been found, and in some cases mixed
infections have been detected (Calari et al., 2010). The vectors of these phytoplasmas
to maize are still unidentified, although in Serbia, controlled transmission trials have
demonstrated that Reptalus panzeri (Löw) can transmit phytoplasmas of the stolbur
group to maize plants (Jović et al., 2009).
Furthermore, in studies of insect vectors of phytoplasmas, some critical aspects
must be considered. First, for some species the specific identification is particularly
troubling. Indeed, in some cases it is extremely difficult, if not impossible, to discriminate
different species only based on morphological features. This inconvenience makes it
difficult to perform any species analysis, to study disease epidemiology, and to apply
specific control strategies. Thus, over the last few years new molecular techniques
have been developed to distinguish the cryptic species with certainty. New primers
designed on the control region (CR) of mitochondrial DNA (Tedeschi and Nardi,
2010) allow to differentiate the psyllid Cacopsylla melanoneura (Förster), vector
of “Candidatus Phytoplasma mali”, from the congeneric C. affinis (Löw), which
cohabits with the former on hawthorn, using a simple PCR. Male specimens of the
two species can be discriminated by observing the genital paramere, although females
and juveniles are not distinguishable by means of morphological comparisons. The
possibility to discriminate the two species will allow new information to be acquired
on their ability to transmit the phytoplasma, in particular concerning C. affinis, which
has already been found to be positive for phytoplasmas of the Apple proliferation (AP)
group (Tedeschi et al., 2009). Similarly, Bertin et al. (2010a, 2010b) developed two
656
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
protocols based on PCR-RFLP analysis, by amplifying portions of the mitochondrial
COI gene and of the internal transcribed spacer 2 (ITS2), followed by digestion with
restriction enzymes, allowing them to discern different cixiid species, four belonging
to the genus Reptalus: R. quinquecostatus, R. melanochaetus (Fieber), R. cuspidatus
(Fieber), and R. panzeri, and three to the genus Hyalesthes: H. obsoletus, H. luteipes,
and H. scotti. Such protocols have important practical implications on fauna studies
and on vector monitoring. Indeed, they make it possible to identify juveniles and
females, allowing the collecting period to be extended to the whole year. In addition,
considering that the young individuals strictly reside on the plant roots, in-depth
studies are needed on the associations between single species and host plants, to
clarify their life cycles.
Host plants represent another critical point in the study of insect vectors.
The host species are different, and not all of them are known; nevertheless, they are
extremely important for the epidemiology of phytoplasmoses, both because they are
essential for insects to complete their life cycles, and because they can be a reservoir
for phytoplasmas. Recently studies have been carried out on the role of hawthorn in the
epidemiology of phytoplasmas of the AP group. This plant is a host for C. melanoneura
and for other psyllid species [C. affinis, C. peregrina (Förster), C. crataegi (Schrank)]
that have been found positive for phytoplasmas of the same group; hawthorn itself
was positive for “Ca. Phytoplasma mali” and for “Ca. Phytoplasma pyri” (Tedeschi
et al., 2009). Additionally, the recent identification of aestivation and overwintering
sites of C. melanoneura opens new perspectives for the study of the epidemiology of
“Ca. Phytoplasma mali”.
The host plant aspect is particularly complex when considering the vectors
of grapevine yellows, specifically with reference to cixiids, for which grape
represents only an occasional host for the adults. They are basically polyphagous;
nevertheless, they prefer to complete their life cycle on specific weeds according also
to the geographical origin, as in the case of H. obsoletus. In Piedmont, H. obsoletus
completes its life cycle on Urtica dioica L., even if young individuals have been found
on bindweed (Lessio et al., 2007, Picciau et al., 2008), which is much more important
as a host in Germany, together with Calystegia sepium (L.) and Ranunculus bulbosus
L. (Langer et al., 2003; Langer and Maixner, 2004). Probably many host plants of
cixiids are still unknown, as demonstrated by the recent report of juveniles found on
roots of Lamium orvala L., where the insect can complete its life cycle (Forte et al.,
2010).
For several phytoplasma vectors, the presence of different intraspecies
populations is supposed. For example, it is presumed that different C. melanoneura
populations exist, because of a difference in transmission efficiencies obtained in
northwestern and northeastern Italy, and Germany (Tedeschi e Alma, 2004; Mattedi
et al., 2008; Mayer et al., 2009). Molecular studies using microsatellites, for example
(Malagnini et al., 2007), as carried out in France for C. pruni (Sauvion et al.,
2009), could clarify these controversial aspects. The influence of different vectorphytoplasma isolate combinations cannot be excluded, with possible influences on
657
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
transmission efficiency (Casati et al., 2010).
The perspectives in the study of insect vectors of phytoplasmas concern
certainly the identification of new control strategies that are more specific and
environmental friendly. The recent techniques regarding new means for species
determination, as well as the recruitment of new host plants, will allow the defining of
timely and proper interventions. Furthermore, the verification of new vector species
by means of controlled transmission trials will allow the addressing of the treatments
for the most harmful species and for the most vulnerable stages, in relation to their
life cycle.
In the context of integrated crop management, the control perspective of insect
vectors using resistance elicitors, molecules or microorganisms that can induce in
the plant a systemic resistance response towards attacks by different pathogens is
desirable (Romanazzi et al., 2009; D’Amelio et al., 2010).
The choice of the insecticide must not be underestimated, along with the active
ingredients with the fastest action, as the insect feeding activity is then inhibited
rapidly, blocking phytoplasma transmission. For example, different insecticide classes
have good activities in cutting down on leafhopper populations, while systemic
neonicotinoids are the most effective for suppressing transmission (Saracco et al.,
2008).
In addition, the study of the symbiotic microbiota of insect vectors opens
innovative perspectives for containing the vector populations by means of symbiotic
control strategies. Recent investigations on the endosymbionts of S. titanus and H.
obsoletus have highlighted that the bacteria of the genus Asaia are dominant within
the microbial community of S. titanus and colonize different organs, including the
salivary glands and reproductive organs, where the phytoplasma is also located.
Such a feature makes these cultivable bacteria good candidates for a paratransgenic
approach for using them in the control of phytoplasma transmission. Furthermore, a
bacterium close to “Ca. Sulcia muelleri” has been observed in different organs of H.
obsoletus (Alma et al., 2010).
Finally, new control approaches against vectors may rise from the use of
vibrational signals produced by the insects themselves. Recent studies concerning
the sexual behaviour of S. titanus have highlighted that females mate only once,
while males mate different times and can produce disturbing signals for competitor
males (Mazzoni et al., 2009a). An attempt for mating inhibition has been realized by
playback reproduction of a disturbing signal (Mazzoni et al., 2009b).
As a basis for every control strategy, monitoring the insect vectors is very
important. Recently new achievements on vector sampling have been obtained.
Marking and re-capture techniques can provide important information on vector flight
activity and dispersal. Lessio et al. (2008) experimented with the marking of S. titanus
with fluorescent markers, while marking trials with proteins of alimentary origin (i.e.
albumin and casein), followed by ELISA analyses, are ongoing.
An innovative technique for the study of the influence of some environmental
factors on S. titanus populations derives from the use of geostatics and of artificial
658
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
neural networks. Preliminary results show that the most conditioning inputs are plant
management, potential solar radiation, altitude, and the perimeter/ area ratio of the
vineyard (Lessio et al., submitted).
Recently, different studies have underlined the complexities in characterising
the relationships between symbiotic or pathogenic microorganisms associated with
insects and their hosts. In particular, it has been seen that bacteria belonging to the
same taxonomic groups, which include the agents of several plant diseases, may be
beneficial for the insect transmitting them, and they may even not induce symptoms in
the plant. The possibility arises that microorganisms, which were primarily secondary
symbionts of insects (i.e. facultative symbionts not essential for host survival, but able
to improve host fitness), have evolved into phytopathogenic agents as a consequence
of their inoculation into the plants. Indeed, the introduction of bacterial cells into the
tissues where the host insects feed is quite common for secondary symbionts, in order
to allow the horizontal transfer from insect to insect, as an additional transmission to
the vertical one. Bressan et al. (2009), stressed that the γ-3 proteobacterium responsible
for the “basses richesses” syndrome of sugar beet and transmitted by the cixiid
Pentastiridius leporinus L., has evolved primarily as an insect-associated bacterium,
as it belongs to a clade that includes different bacteria of the genus Arsenophonous,
which are secondary symbionts of several arthropods.
Among the microorganisms associated with the vector of the phytoplasma
responsible for Pear decline, as the psyllid Cacopsylla pyri L., the α-proteobacterium
‘Ca. Liberibacter europaeus’ belongs to a genus that includes the etiological agents
of diseases of citrus and solanaceous plants (Raddadi et al., in press). Contrary to its
closest relatives, according to the first transmission trials carried out, ‘Ca. Liberibacter
europaeus’ does not seem to be pathogenic for pear, in which it is transmitted by C.
pyri, and the strict association with the insect suggests that the microorganism could
provide benefits for its host.
Such secondary symbionts occurring in the plants and often associated with
different phytoplasmas could have a synergic actions with them in determining
diseases presently associated to Mollicutes as etiological agents.
Key words: Hemiptera, Specific identification, Control, Host plants, Prokaryotes.
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Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
Definizione di protocolli diagnostici di
riferimento per i fitoplasmi delle piante da
frutto
G. Pasquini, L. Ferretti, M. Barba
CRA-PAV – Centro di Ricerca per la Patologia vegetale
Via C.G. Bertero, 22, I-00156 (RM)
E-mail: [email protected]
I patogeni vegetali che causano rilevanti danni economici alle colture agrarie
sono soggetti a normative fitosanitarie volte alla tutela della qualità e sanità del
materiale di propagazione e delle produzioni. L’applicazione di tali normative ha
forti ripercussioni economiche su tutta la filiera agroalimentare dovute, ad esempio,
all’estirpazione obbligatoria di piante affette da patogeni da quarantena, a limitazioni
nella circolazione di prodotti agricoli destinati all’import-export o al blocco della
vendita di materiale di propagazione in vivai con focolai di infezione. La possibilità
di disporre di protocolli diagnostici ufficiali, quindi, è prerogativa per l’uniformità
dei risultati ottenuti nei diversi laboratori preposti alla diagnosi fitopatologica e per
dare valenza legale ai risultati ottenuti ai fini dell’applicazione delle stesse normative
fitosanitarie. In questa direzione, peraltro, si sta muovendo tutta la comunità
internazionale ai fini della standardizzazione della diagnosi.
In tale contesto si inserisce il Progetto finalizzato ‘Biodiversità di agenti
fitopatogeni ed armonizzazione della loro diagnosi’ (ARNADIA), finanziato dal
Ministero per le Politiche Agricole Alimentari e Forestale, il cui obiettivo è la
produzione di protocolli diagnostici ufficialmente riconosciuti a livello nazionale, per
la identificazione dei principali patogeni vegetali.
Uno dei sottoprogetti in cui è articolato ARNADIA prevede la definizione di
protocolli ufficiali per la diagnosi delle principali malattie da fitoplasmi. A tal fine è
stato istituito un Gruppo di lavoro composto dal CRA-PAV Roma, il DIPI Università
di Udine, il DISTA Università di Bologna, il Di.Pro.Ve. Università di Milano e l’IVVCNR Torino. Nell’ambito delle fitoplasmosi di rilevanza economica a livello nazionale
e di cui forte è l’esigenza di una armonizzazione dei protocolli diagnostici la scelta,
operata dal Gruppo di Lavoro, è ricaduta su due importanti fitoplasmi delle piante da
frutto ovvero il ‘Candidatus Phytoplasma mali’ (16SrX-A), agente degli scopazzi del
melo (AP) e il ‘Candidatus Phytoplasma prunorum’ (16SrX-B), agente del giallume
europeo delle drupacee (ESFY).
Il Gruppo di Lavoro ha il compito di individuare protocolli di riferimento tra
quelli già esistenti (es., OEPP o protocolli pubblicati) e/o di procedere alla messa
a punto di nuovi protocolli di diagnosi. Una volta definiti i protocolli più idonei,
si procederà alla loro validazione attraverso il calcolo dei parametri di sensibilità,
specificità, accuratezza, sensibilità analitica e ripetibilità. La riproducibilità verrà
definita mediante l’effettuazione di un ring test che vedrà coinvolti i laboratori di
664
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
diagnosi dei Servizi Fitosanitari Regionali. Attualmente, per entrambi i fitoplasmi
in studio, è in corso il confronto di protocolli molecolari, opportunamente scelti dal
Gruppo di Lavoro, che prevedono la diagnosi a partire sia da DNA sia da RNA, estratti
da campioni target e non-target, prelevati in diverse fasi vegetative delle piante.
Parole chiave: ‘Candidatus Phytoplasma mali’, ‘Candidatus Phytoplasma prunorum’,
Diagnosi, Norme fitosanitarie, Validazione.
Definition of reference diagnostic protocols for fruit plant phytoplasmas
The plant pathogens that cause significant economic damage to agricultural
crops are subjected to phytosanitary regulations that are aimed at protecting the
sanitary and quality of propagating materials and production. The application of
these regulations has major economic repercussions throughout the food chain, due
to compulsory eradication of plants affected by quarantine pathogens, restrictions in
the import-export of agricultural production, and the block of propagative material
in nurseries with outbreaks of infection. The availability of official diagnostic
protocols, therefore, is necessary for the uniformity of results obtained in different
laboratories, and to give these a legal value, which is essential for the application of
the phytosanitary measures. Moreover, the entire international community is moving
in this direction in order to standardise the diagnosis.
The Italian Project ARNADIA, funded by the Ministry of Agriculture Food
and Forestry, aims to produce diagnostic protocols that can be officially recognized at
national level for the identification of major plant pathogens.
One of the sub-tasks of the ARNADIA Project provides for the identification
of official protocols for the diagnosis of phytoplasma diseases. For this purpose, a
Working Group has been established, comprising CRA-PAV Rome, DIPI University of
Udine, DISTA University of Bologna, Di.Pro.Ve. University of Milan and IVV-CNR
Turin. Within the phytoplasma diseases of economic importance at national level, the
Working Group has focused their activities to two important fruit tree phytoplasmas:
‘Candidatus Phytoplasma mali’ (16SrX-A), agent of Apple proliferation (AP), and
‘Candidatus Phytoplasma prunorum’ (16SrX-B), agent of European stone fruit
yellows (ESFY).
The Working Group’s task is to identify the reference protocols among
those already existing (eg. EPPO or published protocols) and to proceed with
the development of new ones. The defined protocols will then be validated by
calculating the parameters of sensitivity, specificity, accuracy, analytical sensitivity
and repeatability. Reproducibility will be evaluated through a ring test, involving the
diagnostic laboratories of the Regional Plant Protection Services. At present, for both
these phytoplasmas, the comparison of different molecular protocols is underway,
as appropriately chosen by the Working Group, starting from both DNA and RNA
nucleic acids extracted from target and non-target samples, collected at different
stages of the plant.
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Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
Key words: ‘Candidatus Phytoplasma mali’, ‘Candidatus Phytoplasma prunorum’,
Diagnosis, Phytosanitary measures, Validation.
Ringraziamenti/Acknowledgements
Attività svolta nell’ambito del Progetto ARON-ARNADIA finanziato dal
Ministero per le Politiche Agricole, Alimentari e Forestali.
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Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
IL GIALLUME EUROPEO DELLE DRUPACEE SU
ALBICOCCO IN EMILIA-ROMAGNA: IL PUNTO SULLA
SITUAZIONE ATTUALE
C. Poggi Pollini1, A.R. Babini2, D. Dradi3, C. Lanzoni1, C. Medoro1,
S. Paolini3, C. Ratti1
Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroambientali, Università di Bologna
Viale Fanin, 44, I-40127 Bologna
2
Servizio Fitosanitario della Regione Emilia-Romagna
Via di Corticella, 133, I-40129 Bologna
3
CSSAA, Az. Sp.le
Martorano, 5, I-47522 Cesena (FC)
1
E-mail: [email protected]
E’ stata valutata l’evoluzione del giallume europeo delle drupacee (ESFY)
in albicoccheti dell’Emilia-Romagna dal 2007 ad oggi, mediante rilievi periodici e
saggi molecolari con la tecnica della Real Time PCR (Pignatta et al., 2008; Minguzzi
et al., 2010), su 1630 piante in 27 aziende. La scelta, effettuata in collaborazione con
Apoconerpo Intesa, Apofruit, Orogelfresco e Terremerse, è stata orientata su piante
giovani (non oltre 5-6 anni) innestate per lo più su mirabolano, in maniera tale da
rappresentare in modo più omogeneo possibile la realtà dell’albicocco in ambito
regionale (aree di pianura e di collina) ed in particolare le varietà più interessanti per
lo sviluppo futuro della frutticoltura locale.
Al fine di confermare la presenza di Cacopsylla pruni (Scopoli), vettore di
‘Candidatus Phytoplasma prunorum’, agente della malattia, e di studiarne il ciclo
biologico sono state effettuate catture in 8 siti con trappole cromotropiche adesive
gialle e mediante “frappage” per il campionamento primaverile-estivo (siepi di
Prunus cerasifera e P. spinosa). E’ stato inoltre effettuato un campionamento nel
periodo autunno-invernale su conifere (soprattutto Picea abies) in 2 aziende e 2
località nella pineta di Ravenna. In aggiunta sono state effettuate prove di valutazione
sulla sensibilità a ESFY delle combinazioni varietà/portinnesto più diffuse in EmiliaRomagna.
I risultati ottenuti mostrano un incremento della malattia che ha raggiunto un
incidenza del 4% nelle piante esaminate; i danni più gravi sono stati riscontrati: 1) in
aziende con presenza di piante di età superiore ai 10 anni, di varietà particolarmente
suscettibili (Alba, ad esempio), 2) su piante innestate su “GF 677”, 3) in aziende
ubicate vicino fasce boscose con abbondante prugnolo. Individui di C. pruni sono
stati catturati in 6 aziende, le popolazioni catturate sono di bassa entità anche se
la percentuale di insetti infetti dal fitoplasma è risultata superiore al 10% in tutte
le annate. Nessun insetto è stato catturato su conifere nel periodo invernale. I dati
ottenuti sulla sensibilità varietale mostrano come la maggior parte delle cv. presenti
(soprattutto Bora, Robadà, Silvercot, Sweetcot e Vitillo) mostri un preoccupante
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Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
livello di sensibilità alla malattia.
In conclusione il forte potenziale epidemico di ESFY è confermato anche
negli albicoccheti emiliano-romagnoli; anche il vettore è diffuso sul territorio: è
bene ricordare che il controllo della malattia affidato alla lotta insetticida si è finora
mostrato di difficile attuazione (Poggi Pollini et al., 2008). Sono così in corso ulteriori
prove di valutazione di nuove varietà (Farbaly e Farhial ad esempio) che possano
associare elevati parametri qualitativi a una scarsa sensibilità alla malattia.
Parole chiave: Prunus armeniaca, ‘Candidatus Phytoplasma prunorum’, Cacopsylla
pruni, Studi epidemiologici, Genotipi tolleranti.
Progress in European stone fruit yellows research in apricot orchards in
Emilia-Romagna region
An epidemiological study aimed at assessing the presence of European stone
fruit yellows (ESFY), which is caused by ‘Candidatus Phytoplasma prunorum’, in
apricot orchards in Emilia-Romagna has been carried out since 2007, using field
observations and molecular analysis with real time PCR (Pignatta et al., 2008;
Minguzzi et al., 2010). ESFY has been investigated on 1,630 apricot trees (5-6 years
old) that are grafted mainly on myrabolan. These are the most economically important
varieties for local growers, and they are located in 27 orchards in the most intensive
growing areas, which were chosen in collaboration with four professional associations
(Apoconerpo Intesa, Apofruit, Orogelfresco and Terremerse).
To obtain more information about the life cycle of the ‘Ca. P. prunorum’
vector, the psyllid Cacopsylla pruni (Scopoli) insects were captured in the period
from 2007 to 2010 using the “frappage” method or chromotropic sticky traps placed
on wild stone fruit bushes (mainly blackthorn Prunus spinosa and P. cerasifera) in
and around the cultivated areas in eight localities. The presence of the vector was
also investigated during the autumn-winter on conifers (mainly Picea abies) in two
apricot orchards and in two locations in the Ravenna pine woods. Evaluation studies
to assess possible ESFY tolerance of some cultivar/ rootstock combinations have also
been performed.
The results obtained showed an annual increase in the number of infected
trees, from 0% in 2006 to 4% in 2010; the most serious damage was found in orchards
where: 1) there were older plants (more than 10 years old) of some cv. such as “Alba”,
which is suspected to be highly susceptible to ESFY; 2) on plants grafted on rootstock
“GF 677”; and 3) in orchards close to blackthorn bushes. Individuals of C. pruni were
captured in six out of the eight locations inspected. The populations had low densities;
however, a relatively high number of insects (more than 10%) were infected with
‘Ca. P. prunorum’ during the 2007 to 2010 seasons. As regards the insect collection
during autumn-winter, so far C. pruni have not been found overwintering on conifers
in this area. The majority of the cultivars spread in Emilia-Romagna orchards showed
668
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
a high level of susceptibility to ESFY, especially Sweetcot, Silvercot, Bora, Robadà
and Vitillo.
In conclusion, the potential epidemic threat of ESFY is confirmed in apricot
orchards in Emilia-Romagna; C. pruni can also be considered relatively widespread.
It is worth noting that most of the insecticides used against C. pruni have little or
no efficacy in controlling the disease (Poggi Pollini et al., 2008). To face up to this
phytosanitary problem, other studies are in progress, to assess possible ESFY tolerance
of some new cultivars, such as Farbaly or Farhial.
Key words: Prunus armeniaca, ‘Candidatus Phytoplasma prunorum’, Cacopsylla
pruni, Epidemiological studies, ESFY susceptibility and resistance.
Ringraziamenti/Acknowledgements
Attività svolta nell’ambito del progetto triennale CRPV “Fitoplasmi
albicocco”, finanziato dalla regione Emilia-Romagna. Si ringraziano i tecnici delle
associazioni di produttori citate per il loro indispensabile supporto nella scelta delle
aziende e nei sopralluoghi.
Lavori citati/References
Minguzzi S., C. Ratti, C. Lanzoni, C. Rubies Autonell, N. Reggiani, C. Poggi Pollini,
2010. Detection and relative quantification of ‘Candidatus Phytoplasma
Prunorum’ by Spot Real Time RT-PCR Taqman assay. Petria, 20(2), 219220.
Pignatta D., F. Forno, L. Giunchedi, M. Gobber, L. Mattedi, P. Miorelli, C. Poggi
Pollini, C. Ratti, N. Reggiani, E. Ropelato, 2008. A real time PCR assay for
the detection of European Stone Fruit Yellow Phytoplasma (ESFYP) in plant
propagation material. Acta Horticulturae, 781, 499-504.
Poggi Pollini C., M. Agosti , A.R. Babini, D. Bellina, L. Bianchi, D. Dradi, M.
Gobber, L. Mattedi, 2008. Il giallume europeo delle drupacee: preoccupa la
situazione nei comprensori frutticoli del Nord. Frutticoltura, 6, 20-24.
669
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
Diagnosi e caratterizzazione molecolare di
ceppi di ‘Candidatus Phytoplasma prunorum’ in
individui di Cacopsylla pruni del Friuli Venezia
Giulia
P. Ermacora, F. Ferrini, N. Loi, R. Osler, M. Martini
Dipartimento di Biologia e Protezione delle Piante, Università di Udine
Via delle Scienze, 208, I-33100 Udine
E-mail: [email protected]
Nel corso degli anni 2008, 2009, 2010, allo scopo di monitorare presenza
e diffusione di ‘Candidatus Phytoplasma (Ca. P.) prunorum’ in Cacopsylla pruni,
vettore naturale del giallume europeo delle drupacee (ESFY), è stato condotto un
esteso monitoraggio nella regione Friuli Venezia Giulia (FVG). Tra i vari protocolli a
disposizione per la diagnosi e caratterizzazione di ‘Ca. P. prunorum’, in questo studio
è stato utilizzato il sistema PCR-RFLP basato sul gene aceF (Danet et al., 2008,
Martini et al., 2009) comparando i risultati con il metodo nested-PCR basato sui geni
ribosomali 16Sr RNA ed i primers P1/16S-SR (Lee et al., 2004) in PCR diretta, e fO1/
rO1 in nested-PCR (Lorenz et al., 1995). In totale sono stati analizzati 304 adulti di C.
pruni raccolti in piccoli appezzamenti di Prunus domestica, in aree montane del FVG.
Gli insetti reimmigranti sono stati catturati nel periodo fine marzo-fine aprile, mentre
gli adulti di nuova generazione, negli anni 2008 e 2010, sono stati raccolti a circa due
mesi dall’inizio delle catture dei reimmigranti. Nel 2010, gli insetti catturati sono stati
anche osservati allo stereomicroscopio allo scopo di determinarne il sesso. Gli acidi
nucleici totali sono stati estratti da ciascun individuo di C. pruni secondo il protocollo
Doyle e Doyle, leggermente modificato. Il gene aceF è stato amplificato utilizzando in
PCR diretta i primers AceFf1/AceFr1 e in nested-PCR i primers AceFf2/AceFr2. Per
la caratterizzazione di ‘Ca. P. prunorum’ i prodotti di amplificazione sono stati digeriti
con le endonucleasi BpiI, HaeIII e Tsp509I.
Gli adulti reimmigranti risultati positivi alle analisi molecolari per il gene
aceF sono stati il 40,5% nel 2008, il 20,0% nel 2009 e il 22,9% nel 2010. La percentuale
di adulti di nuova generazione positivi all’analisi è risultata del 35,7% nel 2008 e del
40,0% nel 2010. L’elevata percentuale di C. pruni positive (mai minore del 20,0%)
sia tra gli individui reimmigranti che di nuova generazione, va probabilmente messa
in relazione con l’alta incidenza di ESFY nell’areale oggetto di studio (Thébaud et al.,
2009). Nel 2010 le analisi per la presenza di ‘Ca. P. prunorum’ non hanno evidenziato
significative differenze tra maschi e femmine (27,8% e 21,3% rispettivamente). Il
confronto tra i due protocolli diagnostici utilizzati, condotto su 234 campioni ha
evidenziato una maggiore sensibilità del sistema basato sul gene aceF che ha rilevato
57 positivi (24,4%) rispetto al metodo basato sul gene 16Sr RNA che ha dato 32
positivi (13,7%). La tipizzazione di ‘Ca. P. prunorum’ in C. pruni, sulla base del gene
aceF, ha dimostrato la presenza di 4 profili RFLP, riferibili ai sottogruppi AceF-A,
670
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
-B, -C, ed -E, confermando i risultati ottenuti da campioni vegetali prelevati nello
stesso areale (Martini et al., 2009). I sottogruppi AceF-C (29,1%), AceF-E (27,8%) e
AceF-A (22,3%) sono predominanti, le infezioni miste di due o più ceppi sono comuni
(18,9%). Il metodo PCR/RFLP basato su aceF è quindi risultato valido anche per la
diagnosi e la tipizzazione di ‘Ca. P. prunorum’ negli insetti vettori.
Parole chiave: 16S rRNA gene, gene aceF, Giallume europeo delle drupacee, PCRRFLP, Psille.
Detection and molecular characterisation of ‘Candidatus Phytoplasma
prunorum’ in individuals of Cacopsylla pruni collected
in Friuli Venezia Giulia region
With the aim to better understand ‘Candidatus Phytoplasma (Ca. P.)
prunorum’ presence and diffusion in Cacopsylla pruni, the vector of European stone
fruit yellows (ESFY), an extended survey was conducted in the Friuli Venezia Giulia
(FVG) region from 2008 to 2010. Several molecular tools are now available for ‘Ca.
P. prunorum’ detection and characterisation. In the present study, we chose to use a
PCR-RFLP method based on the aceF gene (Danet et al., 2008; Martini et al., 2009)
and to compare part of the results with a commonly used nested-PCR method based
on the 16S rRNA gene, using the P1/16S-SR primer pair (Lee et al., 2004) in directPCR, followed by fO1/rO1 primers (Lorenz et al., 1995) in nested-PCR. A total of
304 adults of C. pruni were collected in mountain areas of FVG, in small orchards of
Prunus domestica. Re-immigrant adults were collected in a period starting from the
end of March to the end of April. In 2008 and 2010, adults of the new generations
were also collected in the same areas, about two months later. In 2010, the insects
were visually examined by stereomicroscopy to identify the males and females. Total
DNA was extracted from each distinct individual of C. pruni using a slightly modified
Doyle and Doyle protocol. The aceF gene was amplified by nested-PCR using the
primers AceFf1/AceFr1 followed by AceFf2/AceFr2. BpiI, HaeIII and Tsp509I
restriction enzymes were selected for ‘Ca. P. prunorum’ strain differentiation.
The percentages of re-immigrant adults that tested positive in nested PCR
using the aceF gene were 40.5% in 2008, 20.0% in 2009 and 22.9% in 2010. On
the other hand, the percentage of ‘Ca. P. prunorum’ infected individuals in the new
generation were 35.7% and 40.0% respectively, demonstrating a more constant and
high infection in the immature adults. Overall the percentage of infection in the adults
was quite high (not below than 20%), probably related to the high ESFY infection
pressure in the monitored areas (Thébaud et al., 2009).
In 2010, the results did not demonstrate any significant differences in the
percentages of males infected by ‘Ca. P. prunorum’ in comparison to the infected
females (27.8% vs 21.3%). Comparisons of the two nested-PCR methods on 234
samples emphasised the higher sensitivity of the protocol based on the aceF gene,
671
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
which allowed 57 positive samples (24.4%) to be obtained. This was in contrast to the
method based on the 16S rRNA gene, that showed 32 positives (13.7%). Typing of
‘Ca. P. prunorum’ strains on the bases of the aceF gene demonstrated the presence of
four different RFLP subgroups: AceF-A, -B, -C and -E in C. pruni in FVG, confirming
the subgroups reported previously in stone fruit samples in northeastern Italy (Martini
et al., 2009). In general, the strains of the AceF-C (29.1%), AceF-E (27.8%) and
AceF-A (22.3%) subgroups were the predominant ones; mixed infections of different
strains were also quite common (18.9%). In conclusion, we suggest the use of PCR/
RFLP methods based on the aceF gene for detection and characterisation of ‘Ca. P.
prunorum’ strains in its vector.
Key words: 16S rRNA gene, aceF gene, European stone fruit yellows, PCR-RFLP,
Psyllid.
Lavori citati/References
Danet J.L., H. Bahriz, A. Cimerman, X. Foissac, 2008. New molecular typing tools
to monitor fruit tree phytoplasma variability in the 16SrX taxonomic group.
Acta Horticulturae, 781, 343- 349.
Lee I.-M., M. Martini, C. Marcone, S.F. Zhu, 2004. Classification of phytoplasma
strains in the elm yellows group (16SrV) and proposition of ‘Candidatus
Phytoplasma ulmi’ for the phytoplasma associated with elm yellows.
International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 54,
337-347.
Lorenz K.H., B. Schneider, U. Ahrens, E. Seemüller, 1995. Detection of the apple
proliferation and pear decline phytoplasmas by PCR amplification of
ribosomal and nonribosomal DNA. Phytopathology, 85, 771-776.
Martini M., F. Ferrini, J.-L. Danet, P. Ermacora, G. Sertkaya, D. Delić, N. Loi,
X. Foissac, L. Carraro, 2009. PCR/RFLP based method for molecular
characterization of ‘Candidatus Phytoplasma prunorum’ strains using aceF
gene. In: 21st International Conference on Virus and other Graft Transmissible
Diseases of Fruit Crops. Neustadt, Germany, July 5-10, 80.
Thébaud G., M. Yvon, R. Alary, N. Sauvion, G. Labonne, 2009. Efficient transmission
of ‘Candidatus Phytoplasma prunorum’ is delayed by eight months due to a
long latency in its host-alternating vector. Phytopathology, 99, 265-273.
672
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
CONTROLLO DI CACOPSYLLA PRUNI, IL VETTORE DEL
GIALLUME EUROPEO DELLE DRUPACEE
B. Jarausch1, I. Lampe2, A. Fuchs1, U. Harzer2, W. Jarausch1
1
AlPlanta –Institute for Plant Research, RLP AgroScience
Breitenweg, 71, D-67435 Neustadt an der Weinstraße
2
Kompetenzzentrum Gartenbau, DLR Rheinpfalz
Breitenweg, 71, D-67435 Neustadt an der Weinstraße
E-mail: [email protected]
Il giallume europeo delle drupacee (ESFY) è una delle malattie più importanti
nella coltivazione di albicocco e pesco e causa di gravi danni in quasi tutte le regioni
europee dove sono presenti colture di drupacee (Marcone et al., 2010). Finora, solo
la specie Cacopsylla pruni (Hemiptera, Psyllidae) è stata identificata come vettore di
questa malattia. C. pruni è una specie univoltina strettamente oligofaga delle specie
Prunus in tutte le aree europee coltivate a drupacee. Da diversi anni catture costanti
di C. pruni sono state condotte in frutteti selezionati nel sud ovest della Germania
permettendo di descrivere il ciclo di vita di questa psilla (Jarausch et al., 2007). Si è
osservato che lo sviluppo completo si compie su specie Prunus con 5 stadi larvali fino
ad emergere a nuove imago in estate. Queste, dopo un periodo di circa 2-4 settimane
sui loro ospiti Prunus, migrano su conifere, le quali rappresentano i siti svernanti.
La più alta densità di C. pruni è stata trovata su specie selvatiche di Prunus quali per
esempio P. spinosa o P. cerasifera in confronto a popolazioni con concentrazioni più
basse trovate su Prunus commerciali come P. armeniaca o P. persica. È interessante
notare che un considerevole numero di individui è stato raccolto anche da polloni di
diversi portainnesti.
I parametri di trasmissione per l’agente della malattia, ‘Candidatus Phytoplasma
prunorum’, da parte degli adulti svernanti e di nuove imago di C. pruni sono stati
determinati in serra in condizioni standardizzate, nonché in prove di semi-campo. È
stato possibile dimostrare che entrambe le generazioni sono in grado di trasmettere
con successo il fitoplasma alle piante sane usate nel test. Strategie di controllo diretto
nei confronti di adulti e dei diversi stadi larvali sono stati testati in prove di semicampo. I risultati più promettenti sono stati ottenuti con l’abamectina, sostanza che
influenza lo sviluppo larvale riducendo in tal modo l’emergenza di nuove imago di
C. pruni. Il periodo di applicazione più efficace per l’abamectina è risultato essere
compreso tra metà aprile e metà maggio, quando le prime ninfe (L1 + L2) iniziano ad
emergere. L’analisi dei residui non ha rivelato rischi se viene rispettato un periodo di
carenza di almeno 28 giorni. Di conseguenza, in Germania l’abamectina può essere
utilizzata con un permesso eccezionale per il controllo dello sviluppo larvale di C.
pruni.
Parole chiave: ‘Candidatus Phytoplasma prunorum’, Ciclo biologico, Insetticidi,
Prunus.
673
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
Control of Cacopsylla pruni, the vector of European stone fruit yellows
European stone fruit yellows (ESFY) is one of the most important diseases in
apricot and peach cultivation, and causes severe damage in nearly all stone fruit growing
regions in Europe (Marcone et al., 2010). So far, only the psyllid species Cacopsylla
pruni (Hemiptera, Psyllidae) has been identified as a vector of this disease. C. pruni is
a univoltine species that has one generation per year and that is strictly oligophaguous
on Prunus species in all European stone fruit growing areas. For several years, regular
captures of C. pruni have been conducted in selected orchards in southwest Germany,
and the life-cycle of this psyllid species has been described by this means (Jarausch et
al., 2007). Thus, the complete development occurs on Prunus species, including five
larval instars until the emergence of the new imagines in summer, which migrate to
conifers as overwintering sites after a period of about 2-4 weeks on their Prunus hosts.
The highest density of C. pruni was found on wild Prunus species: e.g. P. spinosa
and P. cerasifera, compared to lower populations on cultivated Prunus, such as P.
armeniaca and P. persica. Interestingly, important numbers of individuals were also
collected from suckers of different rootstocks.
The transmission parameters were determined for the agent of the disease,
‘Candidatus Phytoplasma prunorum’, using overwintered adults and newly hatched
imagines of C. pruni in the greenhouse under standard conditions, as well as in semifield trials. It was shown that both generations were able to transmit the phytoplasma
successfully to healthy test plants. Directed control strategies against adults and
the various larval instars were tested in the semi-field trials. By this means, the
most promising results were obtained with the active ingredient abamectin, which
affects the larval development and thereby reduces the emergence of new imagines
of C. pruni. The most efficient application period for abamectin was between midApril and mid-May, when the first nymphs (L1+L2) started to hatch. The residue
analysis revealed no risk if a preharvest interval of at least 28 days was respected.
Consequently, abamectin can be used with an exemption certificate for the control of
the larval development of C. pruni in Germany.
Key words: Biological cycle, ‘Candidatus Phytoplasma prunorum’, Insecticides,
Prunus.
Lavori citati/References
Jarausch B., A. Fuchs, I. Mühlenz, I. Lampe, U. Harzer, W. Jarausch, 2007. Research
on European stone fruit yellows (ESFY) in Germany. Bulletin of Insectology,
60(2), 389-390.
Marcone C., B. Jarausch, W. Jarausch, 2010. Candidatus Phytoplasma prunorum,
the causal agent of European stone fruit yellows: an overview. Journal of
Plant Pathology, 92, 19-34.
674
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
SELEZIONE DI PORTAINNESTI DI MELO RESISTENTI AD
APPLE PROLIFERATION: A CHE PUNTO SIAMO?
W. Jarausch1, C. Bisognin2, S. Grando2, B. Schneider1, R. Velasco2,
E. Seemüller3
AlPlanta –Institute for Plant Research, RLP AgroScience
Breitenweg, 71, D-67435 Neustadt an der Weinstraße
2
Istituto Agrario San Michele all’Adige, Fondazione Edmund Mach
Via Mach, 1, I-38010 San Michele all‘Adige (TN)
3
Julius Kuehn Institute, Federal Research Centre for Cultivated Plants
Institute for Plant Protection in Fruit Crops and Viticulture
Schwabenheimer Str. 101, D-69221 Dossenheim
1
E-mail: [email protected]
Apple proliferation (AP) è causata dal batttterio privo di parete cellulare
‘Candidatus Phytoplasma mali’ ed è difficile da controllare a causa dei diversi modi
di diffusione possibili: trasmissione tramite psille, anastomosi radicali o diffusione di
materiale vegetale affetto da infezione latente. Lavori precedenti hanno indicato che
la malattia può essere controllata mediante l’uso di portainnesti resistenti sfruttando
il modo in cui l’agente causale colonizza l’ospite (Seemüller et al., 1984). Mentre
uno screening esteso in portainnesti comuni non ha rivelato soddisfacente resistenza
(Kartte e Seemüller, 1991), livelli di resistenza rilevanti sono stati individuati in
portainnesti sperimentali derivati da incroci fra la specie apomittica Malus sieboldii
e genotipi di M. x domestica e M. x purpurea (Bisognin et al., 2008; Seemüller et al.,
2008). Tuttavia, varietà innestate su questi ibridi sono più vigorose e meno produttive
che non su portainnesto standard M9. Per questi motivi, un programma di incrocio è
stato avviato per ridurre il vigore e migliorare la resa incrociando e reincrociando M.
sieboldii e suoi ibridi apomittici con M9 e altri portainnesti caratterizzati da nanismo.
Dal 2001 al 2006 sono stati effettuati un totale di 36 incroci. Tuttavia, solo per 23
progenie è stato ottenuto un numero considerevole di piante, mentre gli altri incroci sono
per la maggior parte falliti a causa dell’incompatibilità del polline. I 3.500 semenzali
ottenuti sono stati tipizzati a livello di DNA utilizzando marcatori SSR codominanti
per distinguere apomittici e ricombinanti nella progenie (Bisognin et al., 2009). Un
totale di 1.800 piante comprendenti tutti i ricombinanti ed un numero rappresentativo
di apomittici sono stati sottoposti a screening per la resistenza ad AP inoculando le
piante tramite innesto. La valutazione della progenie è stata fatta in due fasi: tutta la
progenie inoculata è stata osservata per un periodo di due anni a livello di vivaio,
dopodiché genotipi resistenti sono stati trapiantati in un frutteto sperimentale e sono
stati coltivati in condizioni di crescita caratteristiche della produzione commerciale.
In quest’ultimo passaggio, non solo i sintomi, ma anche il vigore e la produttività della
pianta sono stati registrati. Diverse progenie hanno mostrato una buona ereditarietà
della resistenza. In due di esse (4608 x M9 e D2212 x M9) oltre il 50% degli individui
675
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
non hanno mai sviluppato sintomi. Il fenotipo di resistenza è stato caratterizzato in
base ad assenza di sintomi di AP e da bassa concentrazione di fitoplasma determinata
attraverso analisi con PCR quantitativa. Nel frutteto sperimentale, dopo un periodo di
osservazione da tre a cinque anni, circa 50 genotipi sono stati finora selezionati, i quali
sono rimasti resistenti e hanno mostrato valori agronomici promettenti. Attualmente
questi genotipi sono in via di moltiplicazione per micropropagazione e verranno
sottoposti ad ulteriori valutazioni. Dal 2007, genotipi selezionati dalla progenie sono
stati inoltre utilizzati come parentali in ulteriori incroci.
Parole chiave: Candidatus Phytoplasma mali, Malus sieboldii, Screening per la
resistenza, Analisi SSR.
Breeding of apple proliferation resistant-rootstocks: where are we?
Apple proliferation (AP) is caused by the wall-less bacterium ‘Candidatus
Phytoplasma mali’, and it is difficult to control because of its different ways of
spreading: transmission by psyllid vectors and by root anastomosis, or diffusion by
latently infected planting material. Previous studies have indicated that due to the
colonisation behaviour of the causal agent, the disease can be controlled by the use of
resistant rootstocks (Seemüller et al., 1984). While extensive screening has revealed
no satisfactory resistance in established rootstocks (Kartte and Seemüller, 1991),
substantial levels of resistance were identified in experimental rootstocks derived from
crosses of the apomictic species Malus sieboldii and genotypes of M. x domestica and
M. x purpurea (Bisognin et al., 2008; Seemüller et al., 2008). However, trees on these
hybrids are more vigorous and less productive than trees on standard rootstock M9.
For this reason, a breeding programme was initiated to reduce vigor and improve
yield, by crossing and backcrossing M. sieboldii and its apomictic hybrids with M9
and other dwarfing rootstocks. From 2001 through to 2006, a total of 36 crosses were
made. However, only 23 progenies provided substantial numbers of seedlings, while
the other crosses largely failed due to pollen incompatibility. The 3,500 seedlings
obtained were DNA typed using codominant SSR markers to distinguish apomicts
and recombinants in the progenies (Bisognin et al., 2009). A total of 1,800 seedlings
consisting of all of the recombinants and a representative number of apomicts were
screened for AP resistance by graft inoculation. The evaluation of the progeny was
carried out in two steps: all inoculated progeny were observed for a period of two
years at a nursery scale, and the resistant genotypes were then transplanted to an
experimental orchard scale and were grown under commercial conditions. In the latter
step, not only symptoms but also vigor and productivity of the tree were recorded.
Several progenies showed good inheritance of resistance. In two of them (4608 x M9
and D2212 x M9) more than 50% of the individuals never developed symptoms. The
676
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
resistance phenotype could be characterized by the absence of AP symptoms and a
low concentration of the phytoplasma, as determined by quantitative PCR. After three
to five years observation at the experimental orchard scale, about 50 genotypes have
been selected so far that remained resistant and show promising agronomic value.
These genotypes are currently being multiplied by micropropagation for further
evaluation. Since 2007, selected progeny genotypes were also used as parentals in
further crossings.
Key words: Candidatus Phytoplasma mali, Malus sieboldii, Resistance screening,
SSR analysis.
Lavori citati/References
Bisognin C., B. Schneider, H. Salm, M.S. Grando, W. Jarausch, E. Moll, E.
Seemüller, 2008. Apple proliferation resistance in apomictic rootstocks and
its relationship to phytoplasma concentration and simple sequence repeat
genotypes. Phytopathology, 98, 153-158.
Bisognin C., Seemüller, E., Citterio, S., Velasco, R., Grando, M.S., Jarausch, W.,
2009. Use of SSR markers to assess sexual vs apomictic origin and ploidy
level of breeding progeny derived from crosses of apple proliferationresistant Malus sieboldii and its hybrids with Malus x domestica cultivars.
Plant Breeding, 128, 507-513.
Kartte S., E. Seemüller, 1991. Susceptibility of grafted Malus taxa and hybrids to
apple proliferation disease. Journal of Phytopathology, 131,137-148.
Seemüller E., L. Kunze, U. Schaper, 1984. Colonization behaviour of MLO, and
symptom expression of proliferation diseased apple trees and decline diseased
pear trees over a period of several years. Zeitschrift für Pflanzenkrankheiten
und Pflanzenschutz, 91, 525-532.
Seemüller E., E. Moll, B. Schneider, 2008. Apple proliferation resistance of Malus
sieboldii-based rootstocks in comparison to rootstocks derived from other
Malus species. European Journal of Plant Pathology, 121, 109-119.
677
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
Nuovi approfondimenti sulla natura della
resistenza ad Apple proliferation
M. Moser1, R. Velasco2, C. Bisognin2, W. Jarausch1
AlPlanta –Institute for Plant Research, RLP AgroScience
Breitenweg, 71, D-67435 Neustadt an der Weinstraße
2
Istituto Agrario San Michele all’Adige, Fondazione Edmund Mach
Via Mach, 1, I-38010 San Michele all‘Adige (TN)
1
E-mail: [email protected]
In Europa Apple proliferation (AP) è la più importante malattia del melo,
trasmissibile per mezzo di innesti e di insetti vettori. “Candidatus Phytoplasma
mali” (Ca. P. mali) è l’agente causale di AP. Resistenza ad AP è stata trovata nel
genotipo selvatico Malus sieboldii (MS) e in genotipi ibridi suoi derivati (Bisognin
et al., 2008a; Seemüller et al., 2008). Differenze a livello di espressione genica nel
corso dell’infezione sono stati studiate confrontando genotipi resistenti e sensibili a
“Ca. P. mali” mediante la tecnica cDNA-Amplified Fragment Length Polymorphism
(cDNA-AFLP). La individuazione ed analisi dei geni espressi differenzialmente è
stata effettuata sfruttando un sistema in vitro. Piante sane e infette da “Ca. P. mali”
sono state micropropagate e mantenute in condizioni controllate. In precedenza era
stato dimostrato che in questo sistema è possibile riprodurre il fenotipo di resistenza
(Bisognin et al., 2008b). Inoltre, piante ex vitro sono state generate e analizzate
come controllo indipendente dei geni espressi differenzialmente nelle piante in vitro.
L’analisi cDNA-AFLP in piante in vitro ha prodotto 63 bande caratterizzate da sovraespressione nello stato infetto sia del genotipo H0909 (MS-derivato) che di MS. La
maggior parte (37%) delle sequenze associate ha mostrato omologia con prodotti di
funzione sconosciuta. Gli altri geni individuati sono stati associati con meccanismi di
difesa della pianta, trasporto dell’energia/risposta allo stress ossidativo, metabolismo
delle proteine e crescita cellulare. La tecnica di analisi real-time qPCR è stata
impiegata per validare l’espressione differenziale dei geni individuati. Considerata
la mancanza di controlli interni disponibili per lo studio dell’espressione genica
in Malus, inizialmente è stata effettuata un’analisi sui geni housekeeping. I geni
caratterizzati dalla maggior stabilità dopo l’infezione con “Ca. P. mali” sono risultati
essere il fattore di allungamento-1 α (EF1) e il fattore eucariotico di inizio della
traduzione 4-A (eIF4A). Dodici geni su 20 analizzati attraverso qPCR sono risultati
essere espressi differenzialmente in almeno un genotipo in piante in vitro o in piante
ex vitro. Complessivamente, circa il 20% dei geni hanno confermato il pattern di
espressione osservato nell’analisi cDNA-AFLP in MS o H0909 mentre il 30% dei
geni ha mostrato una sotto-espressione o nessuna differenza di espressione. Per il
restante 50% dei geni è stato osservato un comportamento contrastante. I dati ottenuti
in qPCR suggeriscono che le attività fotosintetiche e la fotorespirazione subiscono
uno squilibrio in presenza di infezione da fitoplasmi con sottoregolazione di geni
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Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
coinvolti nella fotosintesi e nella catena di trasferimento elettronico. Come risultato, e
differentemente a quanto osservato in genotipi M. x domestica, in MS è stata osservata
una sovraregolazione dei geni della risposta generale contro i patogeni. Questi geni
coinvolgono il metabolismo della H2O2 e la produzione di metaboliti secondari.
L’ipotesi che ne deriva è che in MS una risposta con accumulo di H2O2 ed attivazione
di meccanismi da essa dipendenti sia alla base della resistenza a “Ca. P. mali”. Questo
meccanismo presenta analogie con il fenomeno noto come “recovery” (Musetti et
al., 2004) dove, in piante sensibili di una certa età, si può osservare la remissione
spontanea dei sintomi ma in modo stocastico, mentre in MS la resistenza risulta essere
una caratteristica inducibile ma stabile.
Parole chiave: Candidatus Phytoplasma mali, Malus sieboldii, Geni differenzialmente
espressi, cDNA-AFLP, qPCR.
New insights into the nature of resistance to Apple proliferation disease
Apple proliferation (AP) disease is the most important graft-transmissible and
vector-borne disease of apple in Europe. “Candidatus Phytoplasma mali” (Ca. P. mali)
is the causal agent of AP. Resistance to AP was found in the wild genotype Malus
sieboldii (MS) and in MS-derived hybrids (Bisognin et al., 2008a; Seemüller et al.,
2008). Differences in gene expression between “Ca. P. mali”-resistant and -susceptible
genotypes during infection were investigated through the cDNA amplified fragment
length polymorphism (cDNA-AFLP) technique. Individuation and analysis of the
differentially expressed genes was carried out by exploiting an in-vitro system. Healthy
and “Ca. P. mali”-infected micropropagated plants were maintained under controlled
conditions, showing that the resistance phenotype could be reproduced in this system
(Bisognin et al., 2008b). In addition, ex-vitro plants were generated as an independent
control of the genes differentially expressed in the in-vitro plants. The cDNA-AFLP
analysis in in-vitro plants yielded 63 bands characterised by over-expression in the
infected state of both H0909 (MS-derived) and MS genotypes. The major part (37%)
of the associated sequences showed homology with products of unknown function.
The other genes were associated with plant defence, energy transport/oxidative stress
responses, protein metabolism and cellular growth. Real-time qPCR analysis was
used to validate the differential expression of the individuated genes. Since no internal
controls were available for the study of gene expression in Malus, an analysis for
housekeeping genes was performed. The most stably expressed genes were elongation
factor-1 α (EF1) and eukaryotic translation initiation factor 4-A (eIF4A). Twelve out
of the 20 genes investigated through qPCR were significantly differentially expressed
in at least one genotype, either in in-vitro plants or in ex-vitro plants. Overall, about
20% of the genes confirmed their cDNA-AFLP expression pattern in MS or H0909,
while 30% of the genes showed down-regulation or were not differentially expressed.
For the remaining 50% of the genes, contrasting behaviour was observed. The qPCR
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Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
data suggest that the phytoplasma infection unbalances photosynthetic activities
and photorespiration, down-regulating genes involved in photosynthesis and in the
electron-transfer chain. As a result, and in contrast to the M. x domestica genotypes,
an up-regulation of genes of the general response against pathogens was found in
MS. These genes involved the pathway of H2O2 and the production of secondary
metabolites. We hypothesise that a response based on the accumulation of H2O2 in
MS would be at the basis of this resistance. This resembles a phenomenon known as
“recovery” (Musetti et al., 2004), where the spontaneous remission of the symptoms
is observed in old susceptible plants which occurs in a stochastic way, while the
resistance in MS is an inducible but stable feature.
Key words: Candidatus Phytoplasma mali, Malus sieboldii, Differentially expressed
genes, cDNA-AFLP, qPCR.
Lavori citati/References
Bisognin C., B. Schneider, H. Salm, M.S. Grando, W. Jarausch, E. Moll, E.
Seemüller, 2008a. Apple proliferation resistance in apomictic rootstocks
and its relationship to phytoplasma concentration and simple sequence repeat
genotypes. Phytopathology, 98, 153-158.
Bisognin C., C. Ciccotti, A. Salvadori, M. Moser, M.S. Grando, W. Jarausch,
2008b. In vitro screening for resistance to apple proliferation in Malus ssp.
Plant Pathology, 57, 1163-1171.
Musetti R, L. Sanitá di Toppi, P. Ermacora, M.A. Favali, 2004. Recovery in apple
trees infected with the apple proliferation phytoplasma: an ultrastructural and
biochemical study. Phytopathology, 94, 203-208.
Seemüller E., E. Moll, B. Schneider, 2008. Apple proliferation resistance of Malus
sieboldii-based rootstocks in comparison to rootstocks derived from other
Malus species. European Journal of Plant Pathology, 121, 109-119.
680
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
Siti di estivazione e svernamento di Cacopsylla
melanoneura (Förster) vettore di “Candidatus
Phytoplasma mali”
A. Pizzinat, R. Tedeschi, A. Alma
DIVAPRA, Entomologia e Zoologia applicate all’Ambiente “C. Vidano”,
Università degli Studi di Torino
Via Leonardo da Vinci, 44, I-10095 Grugliasco (TO)
E-mail: [email protected]
La specie Cacopsylla melanoneura (Förster) è ritenuta essere il più importante
vettore di “Candidatus Phytoplasma mali”, agente causale della malattia degli
scopazzi del melo (Apple Proliferation, AP), nell’Italia nordoccidentale. Le piante
colpite producono frutti di dimensioni ridotte e insipidi, con gravi ripercussioni dal
punto di vista economico. Numerosi studi intrapresi negli ultimi anni sulla biologia,
l’infettività e l’efficienza di trasmissione di questa psilla (Alma et al., 2000; Tedeschi
et al., 2002, 2003; Tedeschi e Alma, 2004; Pedrazzoli et al., 2007) hanno messo
in luce il ruolo importante degli adulti svernanti nell’epidemiologia della malattia.
Questi raggiungono, già infetti, il melo e il biancospino, ospiti per la riproduzione e
lo sviluppo postembrionale, a fine gennaio e ivi permangono per circa 14 settimane.
Al contrario, gli adulti neosfarfallati, che compaiono a fine maggio, presentano una
percentuale di infezione molto più bassa e tendono rapidamente a migrare su ospiti
alternativi per l’estivazione e lo svernamento.
Dalla letteratura è noto che gli ospiti per l’estivazione e lo svernamento sono
prevalentemente piante di conifere (Conci et al., 1992; Ossiannilsson, 1992; Lauterer,
1999), ma in Italia non sono mai stati fatti studi approfonditi a tal riguardo.
Per questo motivo nuove ricerche sono state intraprese allo scopo di trovare
alcuni siti di estivazione e svernamento di C. melanoneura in Piemonte e in Valle
d’Aosta, dove molto diffuso è il problema di AP. L’individuazione di boschi di
conifere potenzialmente raggiungibili dalla psilla è stata fatta, come suggerito
da Cĕrmák e Lauterer (2008), tenendo conto della direzione delle correnti calde
ascensionali, che a partire dai meleti situati nelle zone pedemontane risalgono le
vallate favorendo gli spostamenti dell’insetto. In seguito, campionamenti settimanali
a diverse altitudini durante il periodo estivo e autunnale sono stati eseguiti con retino
entomologico con manico telescopico lungo 5 m. Adulti di C. melanoneura sono stati
raccolti prevalentemente ad altitudini comprese tra 1300 e 1500 m s.l.m. su Abies
alba (Miller), Picea abies (L.), Pinus sylvestris (L.) e Larix decidua (Miller). Una
volta selezionati i siti di maggiore concentrazione della psilla, adulti neosfarfallati
raccolti in campo sia su melo sia su biancospino sono stati isolati su varie specie di
conifere in appositi manicotti, per seguire l’intero ciclo dell’insetto fino al periodo di
reimmigrazione su melo e biancospino. A gennaio esemplari vivi sono stati osservati
negli isolatori posti su abete bianco, abete rosso, pino cembro e pino silvestre, ma
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Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
non su larice, che, probabilmente, non è idoneo per il completamento del ciclo della
psilla in quanto pianta decidua. E’ stato quindi possibile, per la prima volta, seguire
C. melanoneura durante il suo intero ciclo biologico e individuare le specie vegetali
utilizzate dalla psilla come piante rifugio durante l’estivazione e lo svernamento
nell’Italia nordoccidentale.
La conoscenza dei siti colonizzati da C. melanoneura durante buona parte
dell’anno, dopo la migrazione da melo e biancospino apre nuove prospettive sullo
studio del rapporto fitoplasma-vettore e dell’epidemiologia della malattia. Inoltre,
queste informazioni potrebbero fornire nuove indicazioni per strategie di difesa più
mirate e tempestive.
Parole chiave: Apple proliferation, Conifere, Psilla, Piante rifugio.
Aestivation and overwintering sites of Cacopsylla melanoneura (Förster) vector
of “Candidatus Phytoplasma mali”
The species Cacopsylla melanoneura (Förster) is acknowledged as the most
important vector of “Candidatus Phytoplasma mali”, the causal agent of Apple
proliferation (AP) in northwestern Italy. The affected plants produce tasteless
dwarf fruits, causing heavy economic losses. Over the last ten years, several studies
concerning the biology, infectivity and transmission efficiency of this psyllid have
highlighted the important role of the overwintered adults in the epidemiology of the
disease (Alma et al., 2000; Tedeschi et al., 2002, 2003; Tedeschi and Alma, 2004;
Pedrazzoli et al., 2007). At the end of January, when they are already infected, they
reach apple and hawthorn plants, the hosts for reproduction and nymph development,
where they remain for about 14 weeks. The newly emerged adults that appear at the
end of May have a lower infection rate and rapidly migrate to alternative hosts for
aestivation and overwintering. From the literature, it is known that these aestivation
and overwintering hosts are conifer plants (Conci et al., 1992; Ossiannilsson, 1992;
Lauterer, 1999), but in Italy in-depth studies on this subject are lacking.
For this reason, new surveys were carried out to identify aestivation and
overwintering sites of C. melanoneura in Piedmont and Aosta Valley, where AP
is widespread. Conifer forests that were potentially reachable by the psyllids were
spotted, as suggested by Cĕrmák and Lauterer (2008), following the direction of the
warm ascending air. These flows rise from apple orchards located in lowlands up to the
mountains, and they promote psyllid movements. Then, during summer and autumn,
samplings were carried out once a week at different altitudes by means of a sweep net
with a 5 m telescopic handle. Adults of C. melanoneura were collected predominantly
at altitudes between 1,300 and 1,500 m a.s.l., on Abies alba (Miller), Picea abies (L.),
Pinus sylvestris (L.) and Larix decidua (Miller). As the high-concentration psyllid
sites were identified, the newly emerged adults were collected on apple and hawthorn
plants and caged on branches of different species of conifers, to observe the entire
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Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
cycle of the insect until re-immigration onto apple and hawthorn plants. In January,
living specimens were found in the cages placed on white spruce, red spruce, Swiss
stone pine and Scots pine, but not on larch, which is probably not suitable for the
whole biological cycle of the psyllids because it is deciduous. Thus, it was possible,
to observe C. melanoneura during its complete life cycle for the first time, and to
identify the plant species used by the psyllid as shelter plants during aestivation and
overwintering in northwestern Italy.
The knowledge of the sites colonised by C. melanoneura during a large part of
the year and after migration from apple and hawthorn plants opens new perspectives
in the study of the phytoplasma-vector relationships and in the epidemiology of AP.
Moreover this information could provide new indications for prompt control strategies.
Key words: Apple proliferation, Conifers, Psyllid, Shelter plants.
Lavori citati/References
Alma A., P. Navone, C. Visentin, A. Arzone, D. Bosco, 2000. Rilevamenti di
fitoplasmi di “Apple proliferation” in Cacopsylla melanoneura (Förster)
(Homoptera Psyllidae). Petria, 10, 141-142.
Cĕrmák V., P. Lauterer, 2008. Overwintering of psyllids in South Moravia (Czech
Republic) with respect to the vectors of the apple proliferation cluster
phytoplasmas. Bulletin of Insectology, 61, 147-148.
Conci C., C. Rapisarda, L. Tamanini, 1993. Annotated catalogue of the Italian
Psylloidea. First part (Insecta Homoptera). Atti dell’Accademia Roveretana
degli Agiati, 245, ser. VII, vol. II,B, 33-136.
Lauterer P., 1999. Results of the investigations on Hemiptera in Moravia, made
by the Moravian museum (Psylloidea 2). Acta Musei Moraviae (Scientiae
biologicae), Brno, 84, 71-151.
Ossiannilsson F., 1992. The Psylloidea (Homoptera) of Fennoscandia and Denmark.
In: Fauna Entomologica Scandinava, vol. 26. Leiden the Netherlands: E. J.
Brill.
Pedrazzoli F., V. Gualandri, F. Forno, L. Mattedi, V. Malagnini, A. Salvadori,
G. Stoppa, C. Ioriatti, 2007. Acquisition capacities of the overwintering
adults of the psyllid vectors of “Candidatus Phytoplasma mali”. Bulletin of
Insectology, 60(2), 195-196.
Tedeschi R., D. Bosco, A. Alma, 2002. Population dynamics of Cacopsylla
melanoneura (Homoptera: Psyllidae), a vector of apple proliferation
phytoplasma in northwestern Italy. Journal of Economic Entomology, 95,
544-551.
683
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
Tedeschi R., C. Visentin, A. Alma, D. Bosco, 2003. Epidemiology of apple
proliferation (AP) in northwestern Italy: evaluation of the frequency of APpositive psyllids in naturally infected populations of Cacopsylla melanoneura
(Homoptera: Psyllidae). Annals of Applied Biology, 142, 285-290.
Tedeschi R., A. Alma, 2004. Transmission of apple proliferation phytoplasma by
Cacopsylla melanoneura (Homoptera: Psyllidae). Journal of Economic
Entomology, 97, 8-13.
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Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
RISPOSTA A DIFFERENTI INFEZIONI VIRALI DI ALCUNE
SELEZIONI DI MELO RESISTENTI E SUSCETTIBILI AD
APPLE PROLIFERATION
C. Bisognin, A. M. Ciccotti, I. Battocletti, M. Deromedi, M. Filippi, P.
Bragagna, M. S. Grando
Centro Ricerca e Innovazione, Fondazione E. Mach
Via Mach, 1, I-38010 San Michele all’Adige (TN)
E-mail: [email protected]
Apple proliferation (AP) è la più importante malattia da fitoplasmi del
melo, diffusa nell’Europa meridionale e trasmissibile per innesto, insetti vettori ed
anastomosi radicali. L’assenza di trattamenti specifici per contrastare efficacemente
questa malattia ha favorito le ricerche volte alla individuazione di genotipi resistenti
attraverso una attività di miglioramento genetico. Dal programma di miglioramento
genetico in cui si è utilizzato Malus sieboldii come donatore della resistenza e
incrociato principalmente con il portinnesto standard M9 sono stati ottenuti circa 6000
semenzali (Bisognin et al., 2009). Lo screening ad AP ha evidenziato l’ereditarietà
del tratto di resistenza nelle progenie e attualmente sono in corso prove per testare il
valore agronomico delle selezioni ottenute. Accanto allo screening per la resistenza
ad AP si è voluto indagare anche la risposta dei parentali degli incroci e di alcuni
ibridi all’infezione con tre virus che frequentemente colpiscono il melo. Tre repliche
per ciascuna combinazione genotipo-virus sono state inoculate, in condizioni
controllate, con apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV), apple stem grooving virus
(ASGV) e apple stem pitting virus (ASPV). Nella primavera successiva all’infezione
è stata verificata, mediante test Elisa, l’effettiva presenza del virus nella pianta e
sono stati osservati i sintomi sulle giovani foglie. Come testimone sono stati inseriti
alcuni genotipi suscettibili ad AP. In un secondo esperimento è stata valutata per
ciascun genotipo la reazione alla presenza contemporanea di ACLSV, ASGV e ASPV
mediante una “superinfezione”. Dall’analisi dei dati preliminari è risultato che in
entrambi gli esperimenti il parentale D2212 e alcuni ibridi derivanti dal programma
di miglioramento genetico oltre che la selezione CAT 7 non risultano particolarmente
sensibili ai tre virus se inoculati singolarmente o mediante superinfezione.
Parole chiave: Scopazzi del melo, Virus latenti, Screening, Miglioramento genetico.
Response of Apple proliferation resistant and susceptible genotypes to different
viral infections
Apple proliferation (AP) is the most important phytoplasma-associated disease
affecting apple in southern Europe. It is transmissible by grafting, insects vectors and
root bridges. The failure to control this disease by standard methods has strongly
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Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
increased the importance of using resistant genotypes. About 6,000 seedlings were
obtained from a breeding programme, crossing Malus sieboldii, the donor of resistance
to AP, with standard apple rootstock (M9 mainly), as the donor of agronomic value
(Bisognin et al., 2009). Resistance screening showed that the trait was inherited by the
progeny, and trials are in progress to test the agronomical value of these genotypes.
As well as AP resistance screening, the responses to three different virus infections
were investigated in the parents of the crosses and in some hybrids. Three replicates
for each genotype-virus combination were inoculated with apple chlorotic leaf spot
virus (ACLSV), apple stem grooving virus (ASGV) and apple stem pitting virus
(ASPV), under standardised conditions. The presence of the viruses was assessed
by ELISA tests, the following spring after infection and symptoms were recorded
on young leaves. Some AP susceptible genotypes were used as controls. In a second
experiment, a contemporary infection with the three viruses (ACLSV, ASGV and
ASPV) was obtained by “superinfection”, and the reactions of the plants were studied.
Preliminary results from both of these experiments have shown that the genotype
D2212, some hybrids of the crossings, and CAT 7 selection did not show sensitivity
to the three viruses examined.
Key words: Apple proliferation, Latent virus, Resistance screening, Breeding.
Ringraziamenti/Acknowledgements
Lavoro svolto nell’ambito del progetto SMAP finanziato dal Fondo Unico per
i Progetti di ricerca della Provincia Autonoma di Trento.
Lavori citati/References
Bisognin C., E. Seemuller, S. Citterio, R. Velasco, M.S. Grando, W. Jarausch, 2009.
Use of SSR markers to assess sexual vs. apomictic origin and ploidy level of
breeding progeny derived from crosses of apple proliferation-resistant Malus
sieboldii and its hybrids with Malus x domestica cultivars. Plant Breeding,
128, 507-513.
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Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE DI ISOLATI DI
“CANDIDATUS PHYTOPLASMA PRUNORUM” RINVENUTI
SU DRUPACEE NELLE MARCHE
S. Murolo, G. Murri, G. Romanazzi
Dipartimento di Scienze Ambientali e delle Produzioni Vegetali,
Università Politecnica delle Marche
Via Brecce Bianche, I-60131 Ancona
E-mail: [email protected]
La realtà frutticola marchigiana non è rilevante in termini generali,
rappresentando appena il 2,2% dell’intera PLV nazionale, ma assume un ruolo
strategico per alcune aree circoscritte quali il Piceno, dove si concentra circa il
70% della superficie totale regionale, localizzata soprattutto in Valdaso. Tra le
specie frutticole le drupacee, ed in particolare pesco, susino europeo ed albicocco,
hanno storicamente caratterizzato la regione. Recentemente, ampio spazio è stato
dato alle nuove varietà di susino cino-giapponese, caratterizzate da un’elevata
adattabilità all’ambiente pedoclimatico marchigiano e ritenute valide per fornire una
diversificazione del prodotto. A questa innovazione varietale negli ultimi anni ha fatto
seguito una recrudescenza dei sintomi e della dannosità del giallume europeo delle
drupacee (European stone fruit yellows, ESFY) indotto da ‘Candidatus Phytoplasma
prunorum’ (Marcone et al., 2010), nella regione Marche soprattutto su susino, pesco
ed albicocco (Murolo e Romanazzi, 2008). La malattia, presente in Europa fin dal
ventesimo secolo, colpisce varie specie del genere Prunus, sia coltivate sia spontanee
(Seemüller e Schneider, 2004) e ha visto una significativa diffusione nei decenni
più recenti in impianti frutticoli dell’Italia settentrionale (Poggi Pollini et al., 2001;
Carraro et al., 2002; Loi et al., 2007) e sporadicamente dell’Italia centro-meridionale
(Marcone et al., 2002; Pastore et al., 2008).
Scopo del lavoro è stato quindi l’identificazione, mediante tecniche di analisi
molecolare, dei fitoplasmi associati a piante di Prunus che mostravano sintomi di
giallume.
Nella primavera 2010 sono stati effettuati sopralluoghi per l’individuazione
della malattia in diversi frutteti commerciali della Valdaso. Sono stati prelevati 20
campioni fogliari di susino e 10 di albicocco, da piante che presentavano una ripresa
vegetativa anticipata e soprattutto l’emissione delle foglie prima dei fiori. Inoltre,
10 piante di pesco, che nella tarda estate precedente avevano mostrato una vivace
colorazione rossastra sono state sottoposte all’estrazione del DNA totale mediante
il kit commerciale DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germania). Il DNA è
stato amplificato con la coppia di primer universali P1/P7 ed in nested-PCR con i
primer R16F2/R2 e i primer gruppo specifici fO1/rO1, R16(I)F1/R1, R16(V)F1/R1 e
R16(III)F1/R2. La maggior parte dei campioni analizzati, 30 su 40, è risultata infetta
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Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
da fitoplasmi appartenenti al gruppo ribosomico 16SrX. L’amplificato R16F2/R2 degli
stessi campioni, quando digerito in presenza dell’enzima RsaI, ha mostrato profilo
di restrizione caratteristico di ‘Ca. Phytoplasma prunorum’. Inoltre, si è proceduto
ad una caratterizzazione molecolare basata sul gene non ribosomico tuf, andando ad
amplificare i campioni prima con la coppia tuf1f/tuf1r e in nested PCR con la coppia
tuf2f/tuf2r e successiva analisi RFLP con l’enzima NlaIII (Ferretti et al., 2007). Tutti
gli isolati hanno mostrato un identico profilo paragonabile a quello del tuf tipo a.
Ulteriori indagini sono in corso per rinvenire eventuali isolati con profilo diverso e per
correlare tali pattern a caratteristiche biologiche.
Parole chiave: Albicocco, European stone fruit yellows, gene tuf, Pesco, Susino.
Molecular characterisation of “Candidatus Phytoplasma prunorum” isolates
found on stone fruits in Marche region
Fruit farming in the Marche region represents only 2.2% of the overall national
production, but it has assumed a strategic role in particular areas, such as the Piceno
area, where about 70% of the total regional cultivated area is concentrated, mainly in
Valdaso. Among the fruit species, the stone fruits, as mainly peach, European plum,
and apricot have historically characterised this region. Recently, wide interest has
been shown for the new varieties of the Chino-Japanese plum, which are characterised
by high adaptability to the Marche pedoclimatic environment, and usefulness towards
diversifying fruit production. The varietal innovation has in the last few years
corresponded to a recrudescence of symptoms and severity of European stone fruit
yellows (ESFY), which is induced by ‘Candidatus Phytoplasma prunorum’ (Marcone
et al., 2010), as recorded in the Marche region mainly in plum, peach and apricot
(Murolo e Romanazzi, 2008). The disease has spread through Europe since the XX
century, and has infected several cultivated and wild Prunus species (Seemüller and
Schneider, 2004), while over the last decade it has increased its diffusion in northern
Italy (Poggi Pollini et al., 2001; Carraro et al., 2002; Loi et al., 2007), and sporadically
in central and southern Italy fields (Marcone et al., 2002; Pastore et al., 2008).
The aim of this study was the identification of phytoplasma associated with
Prunus with yellows symptoms, using molecular tools.
In the spring of 2010, in some of the commercial orchards located in Valdaso,
surveys for the disease were carried out. Twenty leaf samples of plum and 10 of
apricot were collected, which showed early vegetative growth and especially the
emission of leaves before the flowers. Moreover, 10 peach samples were collected
from plants showing reddened and curled leaves in the previous late summer, and they
were processed for DNA extraction using DNeasy Plant Mini Kits (Qiagen, Hilden,
Germania). The DNA was amplified using the P1/P7 universal primers, followed in
nested-PCR using R16F2/R2 and the group-specific primers fO1/rO1, R16(I)F1/R1,
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Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
R16(V)F1/R1, and R16(III)F1/R2. Most of samples analyzed, as 30 out of 40, were
infected by phytoplasma belonging to the 16SrX ribosomic group. When digested
with the endonuclease RsaI, R16F2/R2 amplicons showed the characteristic restriction
pattern of ‘Ca. Phytoplasma prunorum’. Moreover, molecular characterisation was
carried out based on the non-ribosomal tuf gene, by amplifying the samples with
the primer pair tuf1f/tuf1r, and in nested PCR using tuf2f/tuf2r, followed by RFLP
analysis with endonuclease NlaIII (Ferretti et al., 2007). All of the isolates showed
the same RFLP profile, which was similar to tuf type a. Further investigations are in
progress to determine isolates that might produce different profiles, and to find any
link between the pattern and the biological properties.
Key words: Apricot, European stone fruit yellows, Peach, Plum, tuf gene.
Ringraziamenti/Acknowledgements
Si ringrazia la Dott. G. Pasquini per aver gentilmente fornito la sequenza dei
primer per l’amplificazione del gene tuf.
Lavori citati/References
Carraro L., F. Ferrini, P. ermacora, N. Loi, 2002. Role of wild Prunus species in the
epidemiology of European stone fruit yellows. Plant Pathology, 51, 513-517.
Loi N., F. Ferrini, A. Loschi, 2007. Recovery e giallume europeo delle drupacee: un
caso studio. In: Atti Convegno Nazionale “Nuove possibilità di lotta contro
le fitoplasmosi della vite e dei fruttiferi basate su recovery, resistenze indotte
e antagonisti. Ancona, 17-18 Settembre, 15-16.
Marcone C., A. Camele, A. Lanzieri, G.L. Rana, 2002. Individuazione dei fitoplasmi
del giallume europeo delle drupacee e della moria del pero in specie arboree
da frutto in Calabria e Basilicata. Petria, 12, 423-425.
Marcone C., B. Jarausch, W. Jarausch, 2010. Candidatus Phytoplasma prunorum,
the causal agent of European stone fruit yellows: an overview. Journal of
Plant Pathology, 92, 19-34.
Murolo S., G. Romanazzi, 2008. Caratterizzazione molecolare di fitoplasmi delle
drupacee nelle Marche. Petria, 18(2), 188-190.
Pastore M., F. Gervasi, M. Del vaglio, M. Petriccione, A. Bertaccini, 2008. Differenti
reazioni indotte in susino cino-giapponese (Prunus salicina) da infezioni
ottenute mediante innesti di materiale infetto da ‘Candidatus Phytoplasma
prunorum’. Atti Giornate Fitopatologiche, 2, 585-588.
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Seemüller E., B. Schneider, 2004. ‘Candidatus Phytoplasma mali’, ‘Candidatus
Phytoplasma pyri’ and ‘Candidatus Phytoplasma prunorum’, the causal
agents of Apple proliferation, Pear decline and European stone fruit
yellows, respectively. International Journal of Systematic and Evolutionary
Microbiology, 54, 1217-1226.
690
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
UTILIZZO DI UNA SONDA LNA IN REAL TIME-PCR PER LA
DIAGNOSI DI FITOPLASMI IN SOLANUM TUBEROSUM
S. Palmano1, C. Jeffries2, V. Mulholland2, G.S. Saddler2
1
Istituto di Virologia Vegetale, CNR
Strada delle Cacce, 73, I-10135 Torino
2
Science and Advice for Scottish Agriculture, SASA
Roddinglaw Road, UK-EH12 9FJ Edinburgh
E-mail: [email protected]
I fitoplasmi sono procarioti non coltivabili, privi di parete cellulare, diffusi
a livello mondiale e patogeni di molte specie vegetali. Diversi fitoplasmi sono stati
associati a fitopatie della patata, tra cui due malattie da quarantena: “purple top wilt” e
“stolbur”. Seguendo la classificazione basata sull’analisi dei frammenti di restrizione
(RFLP) della sequenza della subunità 16S dell’RNA ribosomale (16SrDNA),
i fitoplasmi associati alle malattie delle patate sono risultati appartenere ai gruppi
16SrI, 16SrII, 16SrVI, 16SrXII e alla specie proposta come ‘Candidatus Phytoplasma
americanum’ (Lee et al., 2006). Più recentemente è stato riportata la presenza in
patate sintomatiche anche del gruppo 16SrIII in Montana (Lee et al., 2009) e del ‘Ca.
Phytoplasma australiense’ in Nuova Zelanda (Liefting et al., 2009). Data questa grande
varietà di fitoplasmi che infettano una coltura così importante, risulta di particolare
interesse possedere un unico metodo diagnostico sensibile ed affidabile. L’utilizzo di
primers universali disegnati sul 16SrDNA, hanno prodotto falsi positivi dovuti alla
presenza di altri batteri, endofiti naturalmente presenti nei campioni analizzati. Da
un’analisi filogenetica delle sequenze degli ampliconi ottenuti, questi batteri sono
risultati essere strettamente correlati ai fitoplasmi. L’introduzione della nested-PCR
è risultata perciò necessaria per aumentare la specificità dei test; tuttavia utilizzando
diverse combinazioni dei primers disponibili in letteratura, si sono ottenuti risultati tra
loro spesso contrastanti.
Di conseguenza è stato messo a punto un metodo diagnostico alternativo,
basato sull’uso di una sonda “locked nucleic acid” (LNA) in real-time PCR. La
chimica della sonda LNA offre i vantaggi di un’elevata specificità e sensibilità,
di gran lunga superiori alle altre sonde a DNA (Costa et al., 2004; Josefsen et al.,
2009). Il metodo sviluppato è stato validato su 100 campioni di Solanum tuberosum
e l’incremento in specificità, sensibilità e ripetibilità si è dimostrato evidente una
volta comparato ai risultati ottenuti con i metodi diagnostici convenzionali. Questa
è la prima segnalazione dell’uso di una sonda LNA in Real Time-PCR come mezzo
diagnostico per fitoplasmi.
Parole chiave: Locked Nucleic Acid, Patata, Fitoplasma.
691
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
Phytoplasma detection by LNA probe-based real-time PCR in
Solanum tuberosum
Phytoplasmas are unculturable, wall-less prokaryotes that cause diseases in
many plant species worldwide. Different phytoplasmas have been associated with
diseases of potatoes, including virescence, witches’ broom, and the two quarantine
diseases: purple top wilt and stolbur. Following classification of the 16SrRNA
gene sequence based on RFLP analysis, potato-associated phytoplasmas were
found to belong to the 16SrI, 16SrII, 16SrVI, 16SrXII groups and to the proposed
species ‘Candidatus Phytoplasma americanum’ (Lee et al., 2006). More recently, a
16SrIII group Phytoplasma in Montana (Lee et al., 2009) and the ‘Ca. Phytoplasma
australiense’ in New Zealand (Liefting et al., 2009) have been reported. Due to the
wide diversity found in phytoplasmas affecting this host, a detection method that
is specific, yet sensitive and reliable is required. Phytoplasma detection using the
available universal primers designed from the 16SrRNA gene have produced many
false positives, which result from the presence of other bacteria that are naturally
present in the potato samples analysed. Once sequenced, these bacteria were found
to be close relatives of phytoplasmas, on the basis of their 16SrRNA gene. A similar
approach based on nested-PCR has improved the specificity of this diagnostic test, but
with inconsistent results using different primer combinations.
As a consequence, an alternative approach based on the use of locked nucleic
acid (LNA) probes and real-time PCR was investigated. The chemistry of LNA probes
offers advantages of improved specificities and sensitivities over conventional DNA
probes (Costa et al., 2004; Josefsen et al., 2009). The detection assay developed
using this approach has been trialed with 100 potato samples, and improvements
in specificity, repeatability and sensitivity were all evident when compared against
results obtained using conventional PCR. This is the first report of the use of LNA
probes in real-time PCR as diagnostic tool for phytoplasmas.
Key words: Locked Nucleic Acid, Potato, Phytoplasma.
Lavori citati/References
Costa J.M., P. Ernault, M. Olivi, T.l. Gaillon, K. Arak, 2004. Chimeric LNA/DNA
probes as a detection system for real-time PCR. Clinical Biochemistry, 37,
930-932.
Josefsen M.H., C. Löfström, H.M. Sommer, J. Hoorfar, 2009. Diagnostic PCR:
Comparative sensitivity of four probe chemistries. Molecular and Cellular
Probes, 23, 201-203.
Lee I.M., K.D. Bottner, G. Secor, V. Rivera-Varas, 2006. ‘Candidatus Phytoplasma
americanum’, a phytoplasma associated with a potato purple top wilt
disease complex. International Journal of Systematic and Evolutionary
Microbiology, 56, 1593-1597.
692
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
Lee I.M., K.D. Bottner, M. Sun, 2009. An emerging potato purple top disease
associated with a new 16SrIII group phytoplasma in Montana. Plant Disease,
93, 970.
Liefting L.W., S. Veerakone, L.I. Ward, G.R.G. Clover, 2009. First report of
‘Candidatus Phytoplasma australiense’ in potato. Plant Disease, 93, 969.
693
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
‘Candidatus Phytoplasma phoenicium’ in Libano
M. Molino Lova1, Y. Abou-Jawdah2, E. Choueiri3, L. Geagea4, H. Abdul-Nour5,
N. Geze5, H. Sobh2, S. El Zammar3, R. El Khoury4, M. Nehme2, R. El Amil3, R.
Fakhr4, A. Haidar2, C. Mortada3, A. Alma6, L. Picciau6, R. Tedeschi6, A. Vercesi1,
P. Casati1, M. Perini7, R. Maacaroun7, C. Mahfoud7, E. Mouannes7, W. Sakr7,
P.A. Bianco1
DI.PRO.VE. Sez. Patologia vegetale, Università di Milano
Via Celoria, 2, I-20133 Milano
2
Faculty of Agricultural and Food Sciences (FAFS), American University of Beirut
P.O. Box 11-0236, Beirut, Lebanon
3
Lebanese Agricultural Research Institute, Tal Amara, Rayak, PO Box 287,
Zahlé, Lebanon
4
FAS, USEK, P.O.Box: 446, Jounieh, Lebanon
5
Lebanese University, Sciences Faculty II, Fanar, Lebanon
6
DIVAPRA, Entomologia e Zoologia applicate all’Ambiente, Università di Torino
Via Leonardo Da Vinci, 44, I-10095 Grugliasco (TO)
7
AVSI Libano, P.O. Box 92, Jounieh Ghadir, Lebanon
1
E-mail: [email protected]
‘Candidatus Phytoplasma phoenicium’, fitoplasma appartenente al gruppo
tassonomico 16SrIX, è stato indicato come il presunto agente eziologico della malattia
degli scopazzi del mandorlo (Almond witches’ broom, AlWB) in Libano, causando
la morte di più di 100.000 piante di mandorlo (Abou-Jawdah et al., 2002; Verdin
et al., 2003). In dieci anni, il patogeno ha continuato a diffondersi in nuove aree
coltivate e sono state recentemente osservate gravi infezioni anche su piante di pesco
e nettarine, due colture economicamente molto importanti per l’agricoltura libanese
(Abou-Jawdah et al., 2009).
Nell’ambito dei progetti di cooperazione allo sviluppo agricolo in Libano,
finanziati dalla Cooperazione Italiana (Ministero degli Affari Esteri), la ONG AVSI
ha coordinato il progetto di ricerca “Lotta integrata al fitoplasma delle drupaceee
in Libano”, in collaborazione con Università ed Enti di ricerca italiani e libanesi.
Il problema è stato affrontato attraverso un accurato monitoraggio della malattia,
analisi di laboratorio e campagna informativa per gli agricoltori, volta a coinvolgere
le comunità locali di agricoltori nell’affronto della malattia e nella successiva
applicazione di misure di controllo.
Per localizzare le regioni nuovamente colpite dalla malattia, è stato condotto
un monitoraggio nazionale che ha coperto tutte le 26 Caza (regioni amministrative)
libanesi, che ha permesso di disegnare la mappa della diffusione della malattia nel
2010. Il progetto, in 12 mesi, ha coinvolto 557 agricoltori, 910 frutteti, regolarmente
osservati, in 490 villaggi appartenenti alle 26 Caza. Il risultato di tale indagine
ha identificato 40.000 nuove piante colpite dalla malattia localizzate in 16 Caza e
694
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
successivamente georeferenziate. L’evoluzione dei sintomi nel corso della stagione
è stata descritta grazie all’osservazione, durata tutto un anno, di piante infette di
mandorlo, pesco e nettarine. Sulla base dei sintomi sono stati raccolti campioni da
piante sintomatiche, asintomatiche e dubbie. Sono state quindi effettuate sia prove
di nested PCR, utilizzando i primer universali P1/P7 (Deng e Hiruki, 1991) seguiti
dai primer F2n/R2 (Gundersen e Lee, 1996) sia analisi di PCR diretta, con i primer
AlWF2/AlWR2 (Abou-Jawdah et al., 2003) disegnati per l’individuazione specifica
di ‘Ca. Phytoplasma phoenicium’. Dalle prove condotte è stata evidenziata la presenza
di fitoplasmi del gruppo tassonomico 16SrIX in campioni di mandorlo, pesco e
nettarine. Dal momento che il vettore non è ancora noto, è stata effettuata un’intensa
campagna di raccolta con metodi diretti ed indiretti di insetti in due frutteti interessati
dalla malattia, per ottenere, identificare e analizzare i possibili vettori del fitoplasma.
Cinquantanove specie di cicaline e sette specie di psille sono state finora identificate
e analizzate. Al momento, nessun insetto è risultato positivo alle analisi PCR.
L’identificazione dei cixiidi catturati e le analisi per l’eventuale individuazione in essi
del fitoplasma di AlWB sono tuttora in corso. Ulteriori ricerche saranno incentrate
sull’indagine approfondita dell’ecologia e dell’epidemiologia di ‘Ca. Phytoplasma
phoenicium’ in Libano e nei Paesi limitrofi.
Parole chiave: Scopazzi del mandorlo, Sintomatologia, Diagnostica PCR, Insetto
vettore, Lotta integrata.
‘Candidatus Phytoplasma phoenicium’ in Lebanon
‘Candidatus Phytoplasma phoenicium’ is a member of the 16S rRNA group IX,
and it has been reported as the presumptive aetiological agent of the “Almond witches’
broom” disease in Lebanon, which has caused the death of more than 100,000 almond
trees (Abou-Jawdah et al., 2002). After 10 years, the pathogen continues to spread to
new cultivated areas, and severe infections have also been observed on peache and
nectarine, two important crops for Lebanese agriculture (Abou-Jawdah et al., 2009).
In the framework of the cooperation projects on rural development in Lebanon,
which are financed by the Italian Cooperation (Ministry of Foreign Affairs), the
NGO AVSI has run a research project on “Integrated management of stone fruits
phytoplasma in Lebanon” in collaboration with Italian and Lebanese Universities
and research institutions. The ‘Almond witches’ broom issue’ was addressed by an
integrated method, which has involved field monitoring, laboratory research, and
awareness training and information for farmers.
To localize the new infected regions, a national survey has been conducted in
2010 that covered all the 26 Lebanese Cazas, and that has allowed the drawing up of
the disease-spread map. Over the 12 months, the project has involved 557 farmers,
with 910 orchards regularly monitored in 490 villages that belong to all of the 26
Lebanese “Caza”. A total of at least 40,000 new infected trees were detected in 16
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Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
Cazas, and localized by GPS. The seasonal symptoms evolution has been described
through one-year-long observations of infected almond, peach and nectarine trees. On
the basis of the symptoms, samples have been collected from symptomatic, doubtful,
and asymptomatic plants. To detect phytoplasma in the analyzed samples, nested PCR
was performed using the universal primers P1/P7 (Deng and Hiruki, 1991), followed
by primers F2n/R2 (Gundersen and Lee, 1996), or direct PCR was performed using
semi-specific primers AlWF2/AlWR2 (Abou-Jawdah et al., 2003). ‘Ca. Phytoplasma
phoenicium’ was detected in almond, peach and nectarine samples. Since the insect
vector is still not known, a wide insect collection has been carried out in two infected
orchards, to collect, identify and analyse the putative phytoplasma vector(s). Fiftynine species of leafhoppers and seven species of psyllids have been identified and
analyzed by nested PCR using universal primers P1/P7 followed by F2n/R2. At the
moment, no insects have shown positive in the PCR reactions. Identification of the
collected cixiids and the phytoplasma detection analyses are in progress. Future
studies will be focused on in-depth investigating ecologies and epidemics of ‘Ca.
Phytoplasma phoenicium’ in Lebanon and in the neighbouring countries.
Key words: Almond witches’ broom, Symptomatology, PCR detection, Insect vector,
Integrated management.
Lavori citati/References
Abou-Jawdah Y., A. Karakashian, H. Sobh, M. Martini, I-M. Lee, 2002. An epidemic
of almond witches’-broom in Lebanon: classification and phylogenetic
relationship of the associated phytoplasma. Plant Disease, 86, 477-484.
Abou-Jawdah Y., H. Dakhil, S. El-Mehtar, I-M. Lee, 2003. Almond witches’-broom
phytoplasma: a potential threat to almond, peach, and nectarine. Canadian
Journal of Plant Pathology, 25, 28-32.
Abou-Jawdah Y., H. Sobh, M. Akkary, 2009. First report of Almond witches’ broom
phytoplasma ‘Candidatus Phytoplasma phoenicium’) causing a severe
disease on nectarine and peach trees in Lebanon. Bulletin OEPP/EPPO
Bulletin, 39, 94-98.
Deng S., G. Hiruki, 1991. Amplification of 16S rRNA genes from culturable and
nonculturable Mollicutes. Journal of Microbiological Methods, 14, 53-61.
Gundersen D.E., I.M. Lee, 1996. Ultrasensitive detection of phytoplasmas by nestedPCR assays using two universal primer pairs. Phytopathologia Mediterranea,
35, 144-151.
Verdin E., P. Salar, J-L. Danet, E. Choueiri, F. Jreijiri, S. El Zammar, B. Gelie, J.M.
Bovè, M. Garnier, 2003. “Candidatus Phytoplasma pheonicium” sp. nov., a
new phytoplasma associated with an emerging lethal disease of almond trees
in Lebanon and Iran. International Journal of Systematic Bacteriology, 53,
833-838.
696
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
Gravi malformazioni in melanzana in Sicilia
associate alla presenza di fitoplasmi
S. Paltrinieri1, N. Contaldo1, M. Davino2, S. Davino3, A. Bertaccini1
Alma Mater Studiorum, Università di Bologna – DiSTA, Patologia Vegetale
Viale Fanin, 42, I-40127 Bologna
2
Università degli Studi, Dipartimento di Scienze e Tecnologie Fitosanitarie
Via S. Sofia, 100, I-95123 Catania
3
Università degli Studi, Dipartimento di Scienze Entomologiche, Fitopatologiche,
Microbiologiche Agrarie e Zootecniche
Viale delle Scienze, I-90128 Palermo
1
E-mail: [email protected]
In impianti di melanzana siti in Sicilia (Ragusa), sono state ripetutamente
osservate sintomatologie rappresentate da nanismi e malformazioni fogliari durante lo
stadio vegetativo della coltura, spesso una parte della pianta mostrava un accentuato
nanismo mentre l’altra metà risultava asintomatica. La malattia si manifesta durante
le prime settimane dopo il trapianto ed impedisce la normale crescita e produzione; le
piante colpite risultano distribuite casualmente in campo e sono presenti in percentuali
inferiori al 10%. Sono stati effettuati prelievi da piante sintomatiche ed asintomatiche
e campioni di nervature e germogli sono stati impiegati per effettuare l’analisi
molecolare volta ad identificare la possibile presenza di fitoplasmi. L’impiego di PCR
nested con i primers P1/P7 seguiti da R16mF1/R16mR1 (Gundersen e Lee, 1996)
ha permesso di ottenere bande della lunghezza attesa, circa 1.500 nucleotidi, dai soli
campioni sintomatici. Il sequenziamento di uno degli amplificati, purificato con il
kit NucleoSpin (Macherey-Nagel), con i primers R16mF1, R16mR1 e M1 (Gibb et
al., 1995), ha permesso di ottenere una sequenza di 1.379 nucleotidi, che è risultata
essere completamente omologa a fitoplasmi correlati a ‘Candidatus Phytoplasma
aurantifolia’; in particolare la sequenza 16Sr ottenuta è risultata praticamente identica
a quella ottenuta da Opuntia sp. con sintomi di malformazione in Sicilia (AY995133;
Granata et al., 2006). Si è proceduto a riamplificare i campioni positivi con i primers
R16F2/R2 per effettuare l’analisi RFLP con gli enzimi TruI, Hpy8I e TaqI che hanno
permesso di verificare che i fitoplasmi individuati nei campioni di melanzana erano
identici fra loro ed appartengono al sottogruppo 16SrII-C. Si tratta della prima
identificazione di un fitoplasma appartenente a questo gruppo in melanzana, coltura
che però risulta infetta da altri fitoplasmi in diverse aree del mondo quali Bangladesh
(16SrI), Turchia (16SrVI) e Brasile (16SrIII). In Italia meridionale sono stati descritti
in melanzana sintomi riferiti a fitoplasmi del gruppo stolbur ma non ne è stata effettuata
l’identificazione molecolare (Polizzi et al., 1990).
Parole chiave: Melanzana, Fitoplasmi, Malformazioni, Diagnosi.
697
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
Phytoplasma detection in eggplants showing severe malformation in Sicily
Stunting and leaf malformations have been repeatedly observed during
vegetative growth in eggplant cultivations located in Sicily (Ragusa). The symptoms
have appeared during the first few weeks after transplantation, and they include
modifications to the normal shape of the plants as well as decreases in their production.
The disease was distributed in scattered patterns in the fields, and with percentages
below 10%. Samples were collected from symptomatic and asymptomatic plants, and
the shoots and midribs were used for nucleic acid extraction to determine possible
phytoplasma presence and identity. Nested PCR assays with the primers P1/P7 followed
by R16mF1/R16mR1 (Gundersen and Lee, 1996) resulted in bands of the expected
length (about 1,500 bp) only from symptomatic samples. Sequencing of one of the
amplicons after purification with the NucleoSpin kit (Macherey-Nagel) was obtained
with primers R16mF1, R16mR1 and M1 (Gibb et al., 1995); a 1,379 bp sequence
that was fully homologous to phytoplasma related to ‘Candidatus Phytoplasma
aurantifolia’ was obtained; in particular, the 16Sr sequence obtained was identical
to that described in cactus pear with malformation symptoms in Sicily (AY995133;
Granata et al., 2006). Reamplification of positive samples with the primers R16F2/
R2 followed by RFLP analyses with TruI, Hpy8I and TaqI allowed the classification
of the eggplant phytoplasma into the 16SrII-C subgroup. This is the fist identification
of phytoplasmas of this subgroup in eggplant. This plant species is however quite
susceptible to phytoplasma infection worldwide, since these prokaryotes have been
identified in Bangladesh (16SrI), Turkey (16SrVI) and Brazil (16SrIII). In southern
Italy, phytoplasma symptoms have been described in eggplant and attributed to
stolbur; however, molecular identification was not carried out (Polizzi et al., 1990).
Key words: Eggplant, Phytoplasmas, Malformations, Detection.
Lavori citati/References
Gibb K.S., A.C. Padovan, B.D. Mogen, 1995. Studies on sweet potato little-leaf
phytoplasma detected in sweet potato and other plant species growing in
Northern Australia. Phytopathology, 85, 169-174.
Granata G., S. Paltrinieri, S. Botti, A. Bertaccini, 2006. Aetiology of Opuntia ficusindica malformations and stunting disease. Annals of Applied Biology, 149,
317-325.
Gundersen D.E., I.-M. Lee, 1996. Ultrasensitive detection of phytoplasmas by nestedPCR assays using two universal primer pairs. Phytopathologia Mediterranea,
35, 144-151.
Polizzi G., V. Grimaldi, A. Catara, 1990. Procarioti simili a micoplasmi (MLO)
associati a fenomeni di ipertrofia del calice e fillodia su melanzana. Colture
Protette, 6, 88-89.
698
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
STOLBUR SU POMODORO: IDENTIFICAZIONE E
caratterizzazione MOLECOLARE dEL FITOPLASMA
in Emilia-RomagnA
F. Terlizzi1, C. Delvago2, R. Zambini2, V. Testi2, S. Saccò3, R. Credi1
1
Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroambientali (DiSTA), Alma Mater
Studiorum-Università di Bologna Viale Fanin, 40, I-40127 (BO)
2
Consorzio Fitosanitario Provinciale di Parma
Viale Gramsci, 26/C, I-43100 (PR)
3
Centro Ricerche Produzioni Vegetali (CRPV)
Via dell’Arrigoni, 120, I-47023 (FC)
E-mail: [email protected]
In varie località emiliane, da alcuni anni si stanno registrando preoccupanti
infezioni del fitoplasma dello stolbur (sottogruppo 16Sr XII-A) a danno delle
coltivazioni di pomodoro (Lycopersicon esculentum Mill.) da industria (Testi et
al., 2006, 2007). Le piante colpite sono facilmente riconoscibili per la caratteristica
sintomatologia: vegetazione clorotica e cespugliosa conseguente all’eccessiva
emissione di germogli ascellari; fusto e germogli ingrossati con internodi corti
e formazione di radici avventizie; foglie piccole e laciniate, specialmente quelle
apicali, accartocciate verso l’alto ed ingiallite e/o con una tipica colorazione bronzeaviolacea; fiori totalmente o parzialmente sterili, con sepali e calici ipertrofici, petali
verdi (virescenza) e organi fiorali trasformati in foglie (fillodia).
Trattasi di una grave malattia che può indurre significativi danni economici
e già oggetto di attenzione da parte degli studiosi (Mazzoni et al., 2008). Nel corso
del 2009 si sono comunque intraprese ulteriori indagini sperimentali, con l’obiettivo
di approfondire le particolarità eziologiche-epidemiologiche che caratterizzano
il fenomeno nelle nostre realtà agronomiche. Allo scopo sono stati ispezionati un
centinaio di impianti di pomodoro da industria di svariate cultivar, localizzati nelle
province di Parma, la maggioranza, Piacenza, Reggio Emilia, Ferrara e Ravenna. Le
osservazioni sintomatologiche svolte hanno permesso di stimare una incidenza della
malattia variabile fra lo 0% e il 18%. Per gli opportuni approfondimenti eziologici
venivano poi campionate ed analizzate 29 piante di pomodoro con i tipici sintomi
dell’affezione, 7 piante di pomodoro asintomatiche e 34 piante erbacee infestanti,
rappresentative di otto diverse specie. I saggi diagnostici sono stati effettuati mediante
una tecnica di real-time PCR (Terlizzi et al., 2005), utilizzando succo grezzo dei
tessuti fogliari sottoposti a retrotrascrizione secondo una recente metodica analitica di
reverse-transcription PCR (Margaria et al., 2007). Tutti i pomodori sintomatici sono
risultati positivi allo stolbur, mentre quelli senza sintomi non evidenziavano alcuna
amplificazione. Riguardo le specie spontanee, il patogeno è stato identificato solo in
una pianta di vilucchio comune (Convolvulus arvensis L.) e in due di vilucchione o
campanelle (Calystegia sepium R. Br.).
699
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
Gli isolati del fitoplasma reperiti sono stati infine caratterizzati sotto l’aspetto
molecolare amplificando il gene non ribosomico tuf. Ciò è avvenuto con la coppia di
primers fTuf1/rTuf1 (1100 bp), in PCR diretta, e poi utilizzando i primers fTufAy/
rTufAy (940 bp) in nested-PCR; il prodotto finale ottenuto veniva poi analizzato
mediante RFLP, previa digestione con l’enzima di restrizione HpaII (Schneider et
al., 1997; Langer e Maixner, 2004). Il profilo individuato nei 32 isolati di stolbur è
risultato sempre il tuf-b o VK-II. Come riportato, questo ceppo risulta specificatamente
associato alle due menzionate piante infestanti, C. arvensis e C. sepium, che fungono sia
come importanti serbatoi di conservazione del fitoplasma, che ospiti e fonti d’inoculo
per il suo principale insetto vettore, il cixiide Hyalesthes obsoletus Signoret (Langer
e Maixner, 2004). I risultati ottenuti confermano ed ampliano le prime acquisizioni su
questa emergente malattia del pomodoro (Mazzoni et al., 2008).
Parole chiave: PCR-RFLP, Pomodoro da industria, Tipo tuf-b (VK-II).
Stolbur on tomato: detection and molecular characterisation of the
phytoplasma in Emilia-Romagna
A tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) disease associated with the stolbur
phytoplasma (16Sr XII-A subgroup) occurred in the Po valley of the Emilia-Romagna
region of northern Italy. Diseased plants showed general chlorosis, excessive branching
of axillary shoots, upwardly rolled leaves with purple discolorations, and abnormal
floral structures: sepal hypertrophy, virescence, phyllody (Testi et al., 2006, 2007).
In this region, stolbur epidemics have also been observed recently, with
preliminary investigations carried out (Mazzoni et al., 2008). Additional studies
have attempted to acquire further etiological and epidemiological information.
Surveys were carried out for 100 fields of different processing tomato cultivars that
are mainly located in the Parma production areas, although also distributed in the
Piacenza, Reggio-Emilia, Ferrara and Ravenna provinces. The disease incidence
appeared variable, ranging from 0% to 18%. Crude extracts from the sampled tomato
plants, 29 with symptoms and 7 asymptomatic, and from 34 plants of 8 different
weed species were obtained following a reverse-transcription procedure (Margaria et
al., 2007) and tested by a real-time RT-PCR techniques (Terlizzi et al., 2005). All of
the symptomatic tomato samples were infected by stolbur phytoplasma. In contrast,
no positive reactions were obtained with asymptomatic samples. For the weeds, the
phytoplasma was only detected in one and two plants of Convolvulus arvensis L. and
Calystegia sepium R. Br., respectively.
To better characterise the 32 stolbur isolates, the tuf non-ribosomal gene was
amplified in nested-PCR using primers fTuf1/rTuf1 (1100 bp), followed by fTufAy/
rTufAy (940 bp) and RFLP analysis (Schneider et al., 1997; Langer and Maixner,
2004). Amplicons of the expected size were obtained from all of the phytoplasma
isolates, and their TufAy/HpaII restriction profiles showed no polymorphism. The
700
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
RFLP patterns obtained were similar, corresponding to the tuf-b type (VK-II) reported
to be associated with C. arvensis and C. sepium, the main hosts and sources of
inoculum for the insect vectors (Langer and Maixner, 2004). Our results confirm and
extend previous findings on this argument (Mazzoni et al., 2008).
Key words: PCR-RFLP, Processing tomato, Tuf-b type (VK-II).
Ringraziamenti/Acknowledgements
Lavoro svolto nell’ambito del Progetto “Stolbur del Pomodoro”, finanziato
dalla Regione Emilia-Romagna (Legge Regionale 28/98) e coordinato dal Centro
Ricerche Produzioni Vegetali.
Lavori citati/References
Langer M., M. Maixner, 2004. Molecular characterization of grapevine yellows
associated phytoplasmas of the stolbur-group based on RFLP-analysis of
non-ribosomal DNA. Vitis, 43, 191-199.
Margaria P., C. Rosa, C. Marzachì, M. Turina, S. Palmano, 2007. Detection of
Flavescence dorée phytoplasma in grapevine by reverse-transcription PCR.
Plant Disease, 91, 1496-1501.
Mazzoni E., A. Gentili, M. Romanini, C. Delvago, V. Testi, G. Pasquini, 2008. Studi
preliminari sul ciclo epidemiologico dello stolbur in campi di pomodoro
infetti localizzati nell’Italia settentrionale. Petria, 18(2), 333-337.
Schneider B., S.B. Gibb, E. Seemüller, 1997. Sequence and RFLP analysis of
the elongation factor Tu gene used in differentiation and classification of
phytoplasmas. Microbiology, 143, 3381-3389.
Terlizzi F., A.R. Babini, C. Ratti, R. Credi, 2005. Prove di multiplex real-time PCR
per la diagnosi del Legno nero e della Flavescenza dorata della vite. Petria,
15(1/2), 217-219.
Testi V., C. Delvago, C. Vitali, B. Robuschi, P. Grillini, V. Vicchi, 2006. Comparsa
e diffusione di stolbur su pomodoro nel Parmense. L’Informatore Agrario,
43, 44-45.
Testi V., C. Delvago, C. Vitali, B. Robuschi, E. Mazzoni, M. Romanini, 2007. Stolbur
ancora in espansione su pomodoro da industria. L’Informatore Agrario, 10,
37-39.
701
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
Gravi infezioni di stolbur su cetriolo
in Veneto
M. Pasini1, N. Mori2, L. D. Boscaini3, S. Paltrinieri4, N. Contaldo4,
A. Bertaccini4
1
Agrea Centro Studi
Via Garibaldi, 5/16, I-37057 S. Giovanni Lupatoto (VR)
2
Dipartimento di Agronomia ambientale e Produzioni vegetali - Entomologia,
Università di Padova, Agripolis
Viale dell’Università, 16, I-35020 Legnaro (PD)
3
APO Scaligera
Località Ponte Rosso Santa Maria di Zevio, I-37050 Zevio (VR)
4
Alma Mater Studiorum, Università di Bologna – DiSTA, Patologia Vegetale
Viale Fanin, 42, I-40127 Bologna
E-mail: [email protected]
Il cetriolo (Cucumis sativus L.) è una cucurbitacea coltivata in Italia su
una superficie di circa 1.200 ha (ISTAT, 2008). In Veneto viene coltivato su circa
90 ha in coltura protetta principalmente nelle provincie di Verona e Venezia per il
consumo fresco. Tra le avversità biotiche della coltura risultano particolarmente
dannosi gli attacchi dei funghi Erisiphe cichoracearum, Pseudoperonospora cubensis
e Botrytis cinerea. Per quanto riguarda i fitofagi sono stati segnalati attacchi del
tripide Frankliniella occidentalis, dell’afide Aphis gossypii, dei lepidotteri Heliothis
armigera e Udea ferrugalis, dei ditteri Liriomyza spp. e dell’acaro Tetranychus
urticae. Inoltre il cetriolo è soggetto a gravi infezioni dovute ai virus del mosaico del
cetriolo (Cucumber Mosaic Virus, CMV), del mosaico del tabacco (Tobacco Mosaic
Virus, TMV) e del mosaico giallo dello zucchino (Zucchini Yellow Mosaic Virus,
ZYMV). Nel 2009 nei comuni di Verona e Oppeno, in provincia di Verona, sono
state osservate piante con sintomi ascrivibili alla presenza di fitoplasmi: taglia ridotta
con accrescimento anomalo di germogli laterali, lamine fogliari distorte, di ridotte
dimensione e con margini sovente clorotici e con pochi fiori malformati; i frutti erano
di dimensioni ridotte e non adatti alla commercializzazione. Durante i mesi di luglio
sono stati raccolti campioni dalle piante sintomatiche e si è proceduto alla estrazione
degli acidi nucleici da diverse strutture vegetative (germogli, nervature e piccioli),
utilizzando il metodo del fenolo/cloroformio (Prince et al., 1993). L’identificazione
del fitoplasma è stata ottenuta mediante amplificazione genica (PCR) con i primers
R16F2/R16R2 specifici per il gene 16S rRNA dei fitoplasmi (Lee et al., 1995), seguita
dall’analisi RFLP utilizzando gli enzimi TruI, BfaI, e HhaI. Inoltre è stata condotta
l’amplificazione nested con i primers R16(I)F1/R1 specifici per alcuni dei gruppi di
fitoplasmi conosciuti. I campioni sintomatici hanno evidenziato la presenza di profili
702
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
identici fra loro ed indistinguibili da quello del campione STOL (stolbur da peperone
dalla Serbia, 16SrXII-A), impiegato come ceppo di riferimento. Tale fitoplasma non
risulta finora segnalato in cetriolo, la specie è però risultata recentemente infetta da
fitoplasmi del gruppo 16SrII in Iran quando presentava sintomi di fillodia (Tazehkand
et al., 2010). Le piante oggetto di indagine provenivano da diversi fornitori vivaistici
ed appartenevano alle cultivar di tipo ginoico Jazzer e Sargon. L’incidenza della
malattia era del 4-6%, con una diffusione casuale delle piante manifestanti sintomi
all’interno degli appezzamenti. Sono in corso ulteriori indagini e studi epidemiologici.
Parole chiave: Cetriolo, Fitoplasmosi, Stolbur, Diagnosi.
Severe stolbur infections on cucumber in Veneto region
Cucumber (Cucumis sativus L.) is widely cultivated in Italy, over about
1,200 ha (ISTAT, 2008). In the Veneto region, cucumber for fresh consumption is
grown under screens over about 90 ha, mainly in the Verona and Venezia provinces.
Different pathogens can infect cucumber, such as the fungi Erisiphe cichoracearum,
Pseudoperonospora cubensis and Botrytis cinerea. Among the pests, Frankliniella
occidentalis, Aphis gossypii, Heliothis armigera, Udea ferrugalis, Liriomyza spp. and
Tetranychus urticae affect cucumber. Cucumber mosaic virus (CMV), Tobacco mosaic
virus (TMV) and Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) can also severely affect
cucumber. During 2009, in Verona and Oppeno (Verona province), cucumber plants
showed symptoms that indicated possible phytoplasma infection, including stunting
and abnormal growth, distortion of leaves, which were small in size, and chlorotic
borders; a reduced number of flowers were produced, which were malformed, and
the fruits were stunted and malformed. In July, 2009, samples were collected from
symptomatic and asymptomatic plants and nucleic acid extraction was carried out
using a phenol/chloroform method (Prince et al., 1993), using the shoots, midribs and
petioles. Phytoplasma identification was obtained using PCR with primers R16F2/
R16R2, specific for phytoplasma 16S rRNA (Lee et al., 1995), followed by RFLP
analyses with TruI, BfaI and HhaI, and nested-PCR with primers R16(I)F1/R1, which
are specific for some of the phytoplasma ribosomal groups described. In amplicons
from symptomatic samples, identical RFLP profiles were observed in all of the
cucumber samples and these profiles were indistinguishable from one of the STOL
strain (Stolbur from pepper from Serbia, 16SrXII-A), which was used as the reference
strain. To our knowledge, this is the first report of stolbur in cucumber; however, the
same species was recently reported to be infected by 16SrII phytoplasmas in Iran,
where phyllody symptoms were seen (Tazehkand et al., 2010). The plants studied here
were produced in different nurseries and belonged to the ginoic cultivars Jazzer and
Sargon. Disease incidence in the field was 4% to 6%, which was randomly distributed
703
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
in the infected plots. Further studies on phytoplasma characterization and on its
epidemiological spread in cucumber are in progress.
Key words: Cucumber, Phytoplasma diseases, Stolbur, Detection.
Lavori citati/References
Lee I.-M., A. Bertaccini, M. Vibio, D.E. Gundersen, 1995. Detection of multiple
phytoplasmas in perennial fruit trees with decline symptoms in Italy.
Phytopathology, 85, 728-735.
Prince J.P., R.E. Davis, T.K. Wolf, I.-M. Lee, B.D. Mogen, E.L. Dally, A. Bertaccini,
R. Credi, M. Barba, 1993. Molecular detection of diverse mycoplasma like
organisms (MLOs) associated with grapevine yellows and their classification
with aster yellows, X-disease and elm yellows MLOs. Phytopathology, 83,
1130-1137.
Tazehkand A.S., A. Hosseini Pour, J. Heydarnejad, A. Varsani, H. Massumi, 2010.
Identification of phytoplasmas associated with cultivated and ornamental
plants in Kerman Province, Iran. Journal of Phytopathology, in stampa, DOI
10.1111/j.1439-0434.2010.01682.x
704
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
Diffusione di ‘Candidatus phytoplasma asteris’
in colza
N. Mori1, L. Marini1, E. Rampin1, F. Zanetti1, G. Mosca1, N. Contaldo2,
A. Bertaccini2
Dipartimento di Agronomia ambientale e Produzioni vegetali - Entomologia,
Università di Padova, Agripolis
Viale dell’Università, 16, I-35020 Legnaro (PD)
2
Alma Mater Studiorum, Università di Bologna – DiSTA, Patologia Vegetale
Viale Fanin, 42, I-40127 Bologna
1
E-mail: [email protected]
Il colza (Brassica napus L. var. oleifera) è una Brassicacea oleaginosa
coltivata su una superficie di circa 25.000 ha in Italia (ISTAT, 2009). Il seme viene
principalmente utilizzato per la produzione di olio, a destinazione biodiesel, e di
farina, destinata al settore mangimistico. Nel 2009 nel comune di Legnaro (PD) e
nel 2010 nello stesso comune e nei comuni di Padova, Verona e Zevio (VR) sono
state osservate piante con sintomi ascrivibili alla presenza di fitoplasmi: formazione
di scopazzi, lamine fogliari con un’intensa e disomogenea colorazione rossastra, fiori
con estese malformazioni e fenomeni di fillodia; le poche silique presenti erano di
dimensioni ridotte con semi raggrinziti e scarsamente germinabili. Durante il mese di
maggio, in entrambi gli anni, sono stati raccolti campioni dalle piante sintomatiche
per l’estrazione degli acidi nucleici totali da diverse strutture vegetative (germogli,
nervature e piccioli). L’identificazione del fitoplasma è stata ottenuta mediante
amplificazione genica (PCR), applicando i primers universali P1/P7 che amplificano
il gene 16S rRNA e la regione spaziatrice ad esso adiacente, seguita da analisi
RFLP, utilizzando gli enzimi di restrizione TruI, e HhaI. Tutti i campioni esaminati
hanno evidenziato la presenza di profili identici ed indistinguibili da quello di
‘European aster yellows’ (16SrI-B) ceppo di riferimento appartenente al ‘Candidatus
Phytoplasma asteris’. Tale fitoplasma è già stato identificato in colza da Bertaccini et
al. (1998) nella Repubblica Ceca e da Maliogka et al. (2009) in Grecia. In Italia dalla
sua prima recentissima segnalazione (Rampin et al., 2010), sembra si stia lentamente
diffondendo. Complessivamente nei due anni sono state analizzate 51 cultivars
appartenenti a diverse tipologie genetiche (ibridi CHH, ibridi CHH semi-dwarf,
CHL e linee a impollinazione libera) e qualitative (LEAR e HEAR, rispettivamente a
basso ed alto contenuto di acido erucico nell’olio). Di queste, 31 hanno manifestato
i sintomi descritti con un’incidenza variabile da 0,03% a 1,89%. Valutando i diversi
input agronomici impiegati nella tecnica di coltivazione, la diffusione del fitoplasma
non sembra essere influenzata dalla concimazione, mentre la densità di semina
sembra rivestire un ruolo significativo nella epidemiologia. In tutti gli appezzamenti
presi in esame è stato osservato un gradiente di diffusione della malattia dai bordi
verso l’interno facendo supporre un’attività di trasmissione mediante insetti vettori.
705
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
Infatti in natura questo fitoplasma è trasmesso da diverse cicaline fra cui Euscelidius
variegatus Kirschbaum, Euscelis incisus Kirschbaum, Macrosteles quadripunctulatus
Kirschbaum, M. quadrilineatus Forbes e M. laevis Ribaut che risultano molto comuni
nell’areale Padano-Veneto.
Parole chiave: Colza, Fitoplasmosi, ‘Candidatus Phytoplasma asteris’.
Spreading of ‘Candidatus Phytoplasma asteris’ in oilseed rape
Oilseed rape (Brassica napus L. var. oleifera) is cultivated over about 25,000
ha in Italy (ISTAT, 2009). The seeds are mainly used for oil for biodiesel production,
as well as for flour for animal feed. In 2009, in Legnaro (PD), and in 2010 in the
same area as well as in oilseed rape production areas in Padova, Verona and Zevio
(VR), plants showing phytoplasma-like symptoms were seen: witches’ broom, leaf
malformation and abnormal reddening, flowers with malformation and phyllody; only
a small proportion of flowers setting seeds in affected inflorescences, which were
shrivelled and not germinating. In May of both of these two years, symptomatic
samples were collected for nucleic acid extraction from shoots, midribs and petioles.
Phytoplasma detection and identification were obtained using direct PCR with the
phytoplasma universal primers P1/P7, amplifying 16S rRNA and spacer region,
followed by RFLP analyses with TruI and HhaI as restriction enzymes. All of the
samples were positive and showed identical RFLP profiles, with the two enzymes
indistinguishable from each other, as one of the European aster yellows (16SrI-B)
reference strains that belonged to ‘Candidatus Phytoplasma asteris’. The same
phytoplasma has been reported in oilseed rape in the Czech Republic (Bertaccini et
al., 1998) and in Greece (Maliogka et al., 2009). In Italy, after its first report (Rampin
et al., 2010), this phytoplasma is slowly spreading. Over the two years of the survey,
51 cultivars were tested, across diverse genetic types (hybrids CHH, CHH semi-dwarf,
CHL and free pollinates lines) and with diverse qualitative characteristics (LEAR
and HEAR, with low and high contents of erucic acid, respectively). Among those,
31 showed the above-described symptoms, with incidences ranging from 0.03% to
1.89%. Phytoplasma diffusion appeared not to be influenced by fertilization, while
the number of seeds per square centimetre appears to influence its spreading. In all
of the fields examined, a gradient of disease from the field borders towards the centre
was observed, leading to the hypothesis of important activities among insect vectors.
Aster yellows phytoplasma is naturally transmitted by different leafhoppers, such
as Euscelidius variegatus Kirschbaum, Euscelis incisus Kirschbaum, Macrosteles
quadripunctulatus Kirschbaum, M. quadrilineatus Forbes and M. laevis Ribaut, all of
which are quite common in the Padano-Veneto agricultural areas.
Key words: Oilseed rape, Phytoplasma, ‘Candidatus Phytoplasma asteris’.
706
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
Lavori citati/References
Bertaccini A., Z. Vorackova, M. Vibio, J. Franova, M. Navratil, J. Spak, J.
Nebesarova, 1998. Comparison of phytoplasmas infecting winter oilseed
rape in the Czech Republic with Italian Brassica phytoplasmas and their
relationship to the aster yellows group. Plant Pathology, 47, 317-324.
Maliogka V.I., J.T. Tsialtas, A. Papantoniou, K. Efthimiou, N.I. Katis, 2009. First
report of a phytoplasma associated with an oilseed rape disease in Greece.
Plant Pathology, 88, 792-792.
Rampin E., N. Mori, L. Marini, F. Zanetti, G. Mosca, V. Girolami, N. Contaldo, A.
Bertaccini, 2010. Segnalato su colza il fitoplasma del giallume dell’astro.
L’Informatore Agrario, 17, 59-60.
707
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
Individuazione del fitoplasma del giallume
dell’astro in Centaurium erythraea Rafn.
N. Contaldo, S. Paltrinieri, A. Bertaccini, M. G. Bellardi
Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroambientali (DiSTA), Patologia Vegetale,
Alma Mater Studiorum Università di Bologna
Viale Fanin, 42, I-40127 Bologna
E-mail: [email protected]
Centaurium erythraea Rafn. (sin. Erythraea centaurium Pers.; Gentianaceae),
nota anche come centaurea minore, è una pianta officinale annuale o biennale,
originaria dell’Europa e dell’Africa settentrionale, che cresce spontanea in tutta
Italia. Ha proprietà amaricanti, aperitive, digestive, febbrifughe, depurative ed
antinfiammatorie. Per il suo sapore amaro dovuto principalmente alla eritrocentaurina,
la centaurea minore viene usata, come pianta intera, nelle industrie di liquori e
bevande digestive. Non è una pianta facilmente coltivabile e, per questo motivo, si
utilizza esclusivamente quella che cresce allo stato spontaneo, la raccolta avviene in
luglio ad inizio fioritura. Per meglio approfondire alcuni aspetti agronomico-colturali
della centaurea minore, sono stati allestiti dei campi sperimentali presso un Centro di
Ricerca Agronomico del Trentino utilizzando seme. Nel mese di luglio del 2008 in
uno di questi impianti è stata osservata una sintomatologia associabile alla presenza
di fitoplasmi: i primi sintomi sono comparsi già nel mese di maggio e la problematica
è stata riscontrata con sempre maggiore frequenza nei mesi successivi, soprattutto
durante la fioritura. In alcuni casi, durante la fase vegetativa si sono osservati
ingiallimenti fogliari e riduzione di crescita; mentre al momento della fioritura
erano visibili virescenza e fillodia, associati a parziale o completo rosettamento e
malformazione dei capolini fiorali. Campioni sintomatici ed asintomatici sono
stati sottoposti alle analisi di laboratorio per individuare ed identificare i fitoplasmi
eventualmente presenti. E’ stata applicata la tecnica PCR utilizzando i primers P1/
P7 seguita da ‘nested’ PCR con i primers F1/B6 e 16SF2/R2 (Duduk et al., 2004). Le
analisi RFLP eseguite con l’impiego degli enzimi di restrizione TruI e HhaI hanno
confermato la presenza nei soli campioni sintomatici di fitoplasmi appartenenti al
sottogruppo ribosomico 16SrI-B (giallume dell’astro), ‘Candidatus Phytoplasma
asteris’. Questo della centaurea minore costituisce il primo caso di infezione naturale
da fitoplasmi in questa specie. Precedentemente in Lazio nel 2001 era stata segnalata
la presenza di fitoplasmi appartenenti al gruppo 16SrVI ‘Candidatus Phytoplasma
trifolii’ in Centaurea solstitialis, una pianta spontanea appartenente alla famiglia delle
Asteraceae (Faggioli et al., 2003). Risalgono al 1995 e 1997, in Tailandia e Giappone
708
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
rispettivamente, le prime segnalazioni di questi procarioti in specie della famiglia
delle Gentianaceae, fra cui Genziana sp., riscontrata infetta da fitoplasmi appartenenti
al gruppo 16SrIII-B (Okuda et al., 1997).
Parole chiave: Centaurea minore, Diagnosi, Fillodia, Giallume dell’astro.
Detection of aster yellows phytoplasma in Centaurium herythraea Rafn.
Centaurium erythraea Rafn. (sin. Erythraea centaurium Pers.; Gentianaceae),
which is also known as the red centaury (or European centaury), is an annual or
biennial medicinal and aromatic plant that is native to Europe and north Africa, and
is wild in Italy. European centaury is beneficial for the liver and kidneys, it ‘purifies
the blood’, and it has long been used for the cure of intermittent fever. This plant
contains a bitter principle, erytrhocentaurin, which constitutes an excellent tonic that
is widely used in the liquor industry. As it cannot be easily cultivated, it is harvested
as the wild plant in July, when it is just breaking into flower. To better understand
the agronomic aspects of this species, some experimental fields were set up at an
Agronomic Research Centre located in the Trentino Region (northern Italy). In July
2008, a phytoplasma-like disease was noted. After the first symptoms which were seen
in May, an increasing percentage of symptomatic plants was found over the following
months, at the blooming stage. Yellows symptoms were present in the leaves, and in
some cases, the plants showed a reduction in leaf size, and stunting. At blooming,
the plants showed abortion of buds, flower virescence, rosetting and malformation.
To verify the presence of phytoplasma, and to determine their identity, samples from
symptomatic and asymptomatic plants were collected and tested by direct PCR with
primers P1/P7 followed by nested PCR with primers F1/B6 and 16SF2/R2 (Duduk
et al., 2004). RFLP analyses performed with the TruI and HhaI enzymes allowed the
identification in the symptomatic plants of phytoplasmas belonging to group 16SrI-B
(‘Candidatus Phytoplasma asteris’). This is the first report of a natural phytoplasma
infection in a European centaury. Indeed, a phytoplasma from the clover proliferation
group (16SrVI) was reported in 2001 in Centaurea solstitialis, a weed plant belonging
to the family Asteraceae (Faggioli et al., 2003). To date, only phytoplasmas belonging
to the 16SrIII-B subgroup (clover yellow edge) have been found naturally infecting
species of the Gentianaceae family (such as Gentiana sp.) in Japan and Thailand,
from 1995 and 1997, respectively (Okuda et al., 1997).
Key words: Aster yellows, Centaurium erythraea Rafn., Detection, Phyllody.
709
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
Lavori citati/References
Duduk B., S. Botti, M. Ivanović, B. Krstić, N. Dukić, A. Bertaccini, 2004.
Identification of phytoplasmas associated with grapevine yellows in Serbia.
Journal of Phytopathology, 152, 575-579.
Faggioli F., G. Pasquini, V. lumia, G. Campobasso, T.L. Widmer, P.G. Quimby,
2004. Molecular identification of a new member of the clover proliferation
Phytoplasma group (16SrVI) associated with Centaurea solstitialis
virescence in Italy. European Journal of Plant Pathology, 110, 353-360.
Okuda S., J.P. Prince, R.E. Davis, E.L. Dally, I.-M. Lee., B. Mogen, S. Kato, 1997.
Two groups of phytoplasmas from Japan distinguished on the basis of
amplification and restriction analysis of 16S rDNA. Plant Disease, 81, 301305.
710
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
Malattie da fitoplasmi di piante medicinali e
nutraceutiche in Italia meridionale
C. Marcone
Dipartimento di Scienze Farmaceutiche, Università degli Studi di Salerno
Via Ponte Don Melillo, I-84084 Fisciano (SA)
E-mail: [email protected]
Nella società moderna c’è un interesse crescente nell’uso di piante
medicinali e nutraceutiche per i loro effetti benefici sulla salute umana. A partire
da vari anni, in Italia meridionale, piante medicinali e nutraceutiche sono affette da
malattie caratterizzate da giallumi, scopazzi e deperimento. Queste malattie intaccano
considerevolmente il contenuto in fitoterapici e la produttività delle piante affette. La
presente comunicazione che è un insieme di informazioni originali e pubblicate in
precedenza, riassume le conoscenze attuali delle suddette malattie che interessano un
certo numero di specie di piante.
Spartium junceum (ginestra odorosa) è gravemente affetta da spartium
witches’-broom (SpaWB). I sintomi più appariscenti consistono in scopazzi vistosi,
raccorciamento degli internodi e attività vegetativa fuori stagione. SpaWB è associata
alla presenza di due fitoplasmi, geneticamente differenti, i quali inducono gli stessi
sintomi. Questi agenti sono ‘Candidatus Phytoplasma spartii’, membro del gruppo
16SrX ed un fitoplasma che appartiene al gruppo del giallume dell’olmo (EY) o
gruppo 16SrV, sottogruppo 16SrV-C (Marcone et al., 1996, 2004a; Lee et al., 2004b).
In piante malate, i fiori contengono un quantitativo di oli essenziali inferiore a quello
dei fiori di piante sane. Inoltre, la presenza di un marcato incremento in sesquiterpeni
e di una notevole riduzione di n-alcani e composti alifatici è stata osservata nella
frazione volatile estratta da fiori di piante infette (Mancini et al., 2010).
Eucalyptus spp. (eucalipto) sono affette da eucalyptus little-leaf. I
sintomi consistono in una estrema riduzione della lamina fogliare, ingiallimento,
raccorciamento degli internodi e proliferazione di germogli ascellari. Nelle piante
infette è stato individuato un fitoplasma del gruppo EY (Marcone, 2002).
Rubus fruticosus (rovo selvatico) è affetto dal nanismo del rovo. I sintomi
principali includono nanismo, riduzione del lembo fogliare e proliferazione di
germogli ascellari. L’agente causale è un membro del gruppo 16SrV, sottogruppo
16SrV-E (Marcone et al., 1997).
Taraxacum officinale (tarassaco) e Cichorium intybus (cicoria) mostranti
sintomi di ingiallimento, proliferazione di esili germogli secondari, riduzione del
lembo fogliare e fillodia sono infette da un fitoplasma del gruppo 16SrII, sottogruppo
16SrII-E (Marcone et al., 2001).
Brassica spp. (Brassica oleracea var. capitata, italica, palmifolia, rapifera
e botrytis), Raphanus raphanistrum) (ravanello selvatico), Allium cepa (cipolla),
711
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
Catharanthus roseus (pervinca), Calendula officinalis (calendula), Primula sp.
(primula), manifestanti sintomi di virescenza, fillodia, ingiallimento, portamento
eretto della vegetazione, foglie di ridotte dimensioni e nanismo, Daucus carota
(carota) con sviluppo di germogli avventizi, rimpiccioliti ed eretti, Portulaca oleracea
(portulaca) con vegetazione affusolata e a portamento eretto, foglie rimpicciolite e
clorosi, Plantago lanceolata (piantaggine) con crescita stentata, foglie clorotiche e
riduzione del parenchima internervale, sono ampiamente diffuse in Italia meridionale.
Le piante malate di dette specie albergano il fitoplasma del giallume dell’astro ‘Ca. P.
asteris’, gruppo 16SrI, sottogruppo 16SrI-B (Marcone et al., 2000, 2001; Lee et al.,
2004a).
Capsicum annuum (peperone) e Lycopersicon esculentum (pomodoro)
manifestanti tipici sintomi di stolbur, Apium graveolens (sedano) mostrante
ingiallimento e nanismo, Convolvulus arvensis (convolvolo) con ingiallimento,
nanismo e/o proliferazione di germogli a portamento eretto, e Vitis vinifera (vite) con
sintomi tipici dei giallumi della vite, sono tutte infette da fitoplasmi del sottogruppo
16SrXII-A (Marcone et al., 2001).
Cynodon dactylon (gramigna) e Digitaria sanguinalis (sanguinella)
manifestanti sintomi di foglia bianca sono infette da ‘Ca. P. cynodontis’ (16SrXIV
group) (Marcone et al., 2004b).
Parole chiave: Giallume dell’astro, Giallume dell’olmo, Gruppo 16Sr, Scopazzi,
Stolbur.
Phytoplasma diseases of medicinal and nutraceutical plants in southern Italy
In modern society, there is an increasing interest in the use of medicinal
and nutraceutical plants because of their role in promoting human health. For many
years, medicinal and nutraceutical plants in southern Italy have been affected by
yellows, witches’ broom and decline diseases. These diseases severely impair the
phytochemical content and productivity of the affected plants. The present report is a
mix of original and previously published information, and it summarizes our current
knowledge about these diseases in a number of selected plant species.
Spartium junceum (Spanish broom) is severely affected by spartium witches’
broom (SpaWB) disease. The most characteristic symptoms are pronounced witches’
brooms, shortened internodes, and off-season growth. SpaWB is associated with two
genetically different phytoplasmas that induce the same symptoms. These agents
are ‘Candidatus Phytoplasma spartii’, which is a member of the 16SrX group, and a
phytoplasma that belongs to the Elm yellows (EY) group, or 16SrV group, subgroup
16SrV-C (Marcone et al., 1996, 2004a; Lee et al., 2004b). In SpaWB-affected Spanish
broom plants, the flowers contain less essential oils than those of healthy plants.
Also, a marked increase in sesquiterpenes and a decrease in n-alkanes and aliphatic
712
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
compounds are known to occur in the volatile fractions extracted from flowers of
these infected plants (Mancini et al., 2010).
Eucalyptus spp. (eucalyptus) are affected by eucalyptus little-leaf. The
symptoms include abnormally small leaves that are yellowing and have shortened
internodes, with proliferation of axillary shoots. A phytoplasma of the EY group has
been identified in the affected plants (Marcone, 2002).
Rubus fruticosus (wild blackberry) is affected by Rubus stunt (RuS) disease.
The main symptoms here are stunting, small leaves and proliferation of axillary
shoots. The RuS agent is a member of the 16SrV group, subgroup 16SrV-E (Marcone
et al., 1997).
Taraxacum officinale (dandelion) and Cichorium intybus (common chicory)
are showing symptoms of yellowing, proliferation of slender secondary shoots, small
leaves and phyllody, and they are infected by a phytoplasma of the 16SrII group,
subgroup 16SrII-E (Marcone et al., 2001).
Brassica spp. (Brassica oleracea var. capitata, italica, palmifolia, rapifera and
botrytis), Raphanus raphanistrum) (wild radish), Allium cepa (onion), Catharanthus
roseus (periwinkle), Calendula officinalis (pot marigold), Primula sp. (primrose)
are showing symptoms of virescence, phyllody, yellowing, upright growth habit,
little leaves, and general stunting, Daucus carota (carrot) with clusters of dwarfed,
chlorotic, upright adventitious shoots, Portulaca oleracea (purslane) with spindling
upright growth, small leaves, and chlorosis, and Plantago lanceolata (English
plantain) with poor growth and narrow and chlorotic leaves, are all widespread in
southern Italy. The diseased plants of these species are known to harbor the Aster
yellows phytoplasma ‘Ca. P. asteris’, 16SrI group, subgroup 16SrI-B (Marcone et al.,
2000, 2001; Lee et al., 2004a).
Capsicum annuum (red pepper) and Lycopersicon esculentum (tomato) are
showing typical stolbur symptoms, and Apium graveolens (celery) with yellowing
and stunting, Convolvulus arvensis (field bindweed) with yellowing, stunting and/
or proliferating and erect growth habit, and Vitis vinifera (grapevine) with typical
grapevine yellows symptoms, are all infected by subgroup 16SrXII-A phytoplasmas
(Marcone et al., 2001).
Cynodon dactylon (Bermuda grass) and Digitaria sanguinalis (crab grass)
with white-leaf symptoms are infected by ‘Ca. P. cynodontis’ (16SrXIV group)
(Marcone et al., 2004b).
Key words: Aster yellows, Elm yellows, 16Sr group, Stolbur, Witches’-brooms.
713
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
Lavori citati/References
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taxon associated with aster yellows and related diseases. International
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Lee I.-M., M. Martini, C. Marcone, S.F. Zhu, 2004b. Classification of phytoplasma
strains in the elm yellows group (16SrV) and proposal of ‘Candidatus
Phytoplasma ulmi’ for the phytoplasma associated with elm yellows.
International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 54,
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Mancini E., C. Marcone, V. De Feo, F. Senatore, C. Formisano, 2010. Changes
in volatile compounds of Spartium junceum induced by the phytoplasmal
disease spartium witches’-broom. Plant Biosystems, 145(3) (in stampa).
Marcone C., A. Ragozzino, B. Schneider, U. Lauer, C.D. Smart, E. Seemüller, 1996.
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with spartium witches’-broom disease. Plant Disease, 80, 365-371.
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of the phytoplasma associated with elm yellows in southern Italy and its
relatedness to other phytoplasmas of the elm yellows group. European
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Marcone C., I.-M. Lee, R.E. Davis, A. Ragozzino, E. Seemüller, 2000. Classification
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and Evolutionary Microbiology, 50, 1703-1713.
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spartii’, ‘Candidatus Phytoplasma rhamni’ and ‘Candidatus Phytoplasma
allocasuarinae’, respectively associated with spartium witches’-broom,
buckthorn witches’-broom and allocasuarina yellows diseases. International
Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 54, 1025-1029.
Marcone C., B. Schneider, E. Seemüller, 2004b. ‘Candidatus Phytoplasma
cynodontis’, the phytoplasma associated with Bermuda grass white leaf
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714
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
Indagini sulla diffusione di fitoplasmi in una
parcella sperimentale di olmo
A. Santini1, M. Barcia1, V. Mancini2, P. Capretti2
1
Istituto per la Protezione delle Piante - C.N.R.
Via Madonna Piano, I-50019 Sesto Fiorentino (FI)
2
Dipartimento di Biotecnologie Agrarie - Università degli studi di Firenze
Piazzale delle Cascine, 24, I-50144 Firenze
Email: [email protected]
Fino agli anni ‘80 del secolo scorso il giallume dell’olmo (Elm Yellows, EY)
si riteneva fosse una malattia strettamente limitata al Nord America. La presenza di
giallume e scopazzi in olmo in Europa, osservata come evento sporadico fin dal 1951
(Goidanich, 1951) ed ufficialmente riportata nel 1981 (Pisi et al., 1981), non aveva
destato particolare allarme, finché Mittempergher et al. (1990) non ne dimostrarono la
pericolosità anche in Europa, sia su olmi ibridi euro-asiatici, particolarmente suscettibili,
che su olmi indigeni (Mittempergher, 2000). Il ceppo europeo di EY è diverso da
quello americano, sebbene siano filogeneticamente correlati (Mittempergher, 2000).
Nell’ambito del progetto Res-Gen 96-78 per la conservazione ex situ
del germoplasma degli olmi europei, sono state costituite collezioni clonali a
livello nazionale, dove venivano raccolti esemplari ottenuti per talea autoradicata.
Nell’ambito di ciascuna collezione nazionale venivano anche inseriti cloni di paesi
limitrofi per proteggersi da eventuali possibili perdite. Nella collezione italiana,
costituita da 376 cloni indigeni (4 piante per clone) e da 75 cloni ibridi euroasiatici
resistenti alla grafiosi, sono presenti oltre a cloni di provenienza italiana anche cloni
spagnoli, francesi, greci e maltesi. Nel corso degli ultimi anni tale collezione ha
presentato un numero crescente di casi di EY che, in alcuni casi, hanno anche avuto
esito letale.
Scopo di questo lavoro è stato quello di verificare la diversa suscettibilità
ad infezioni naturali di EY di specie e provenienze di olmo. A tal fine, l’ANOVA
è stata utilizzata per verificare l’effetto delle diversi fonti di variazione (specie,
provenienza del clone, ubicazione nella particella) sulla suscettibilità alla malattia.
Nell’ambito di questo lavoro si è anche studiato la struttura degli anelli legnosi in
piante sane ed infette. Il 10% delle piante presenti nella collezione presentava sintomi
variabili di EY, che andavano da ingiallimento e microfillia al totale disseccamento
della chioma. L’ipotesi nulla è stata accettata per le variabili “specie di olmo”
e “ubicazione nella particella”, mentre la variabile “provenienza del clone” si è
dimostrata altamente significativa. I cloni spagnoli sono significativamente più
suscettibili all’EY, secondo il test di Duncan. La struttura degli anelli legnosi dei cloni
infetti presenta modificazioni rispetto a quella di cloni sani. Tali modificazioni sono
maggiori all’aumentare dei sintomi esterni. Piante con scarsi sintomi esterni mostrano
una riduzione dell’accrescimento e del lume dei vasi, mentre quelle con sintomi più
715
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
marcati mostrano una struttura irregolare dell’anello e una forte alterazione della
funzionalità delle cellule cambiali.
I risultati ottenuti sembrano indicare che alcune provenienze sono
maggiormente suscettibili a questa classe di patogeni e che all’aumentare di
sintomi esterni corrisponde una progressiva disfunzionalità dei tessuti cambiali e
conseguentemente della struttura del legno.
Parole Chiave: Giallume dell’olmo, Olmi ibridi, Ulmus glabra, Ulmus laevis, Ulmus
minor.
Survey on phytoplasmas spread in an elm experimental plot
Since the 1980s, Elm yellows (EY) was believed to be a North American
disease. Isolated cases of witches’ brooms on field elm have been reported since 1951
(Goidanich, 1951), with an official report in 1981 (Pisi et al., 1981) considered as a
sporadic event and not worth further consideration. In 1990, Mittempergher et al.
(1990) clearly showed the danger even in Europe, both for Euro-Asian hybrid elms,
which are highly susceptible, and for native European elm species (Mittempergher,
2000). The European strain of EY is different from that of North America, although
their phylogenetical relatedness has been demonstrated (Mittempergher, 2000).
In the framework of the Res-Gen 96-78 project, the aim of which was ex-situ
conservation of European elm germplasm, several national clonal collections have
been formed. Within each collection, there are elm clones from neighboring countries,
in order to save from accidental losses. The Italian collection maintains 376 native
clones (four plants for each clone) and 75 hybrid Euro-Asian DED resistant clones.
The native clones are from Italy, France, Spain, Greece and Malta. Over the last few
years, an increasing number of EY infections have been reported in the collection,
that, in some cases, have been lethal.
The aim of this study was to check the susceptibility to natural EY infections
of different elm species and provenances. ANOVA was used to assess the effects of
different sources of variation (species, clone provenance, location within the plot) on
disease susceptibility. In the framework of this study, the wood rings structure was
also taken into account in both sound and infected trees. Ten percent of the plants
of the collection showed differing degrees of EY symptoms, from yellowing and
witches’ broom, to total dieback. The null hypothesis was accepted for the variables of
“species” and “location”, while the variable of “provenance” was highly significant,
and Spanish clones are significantly more attacked, according to Duncan’s test. The
tree rings structure of infected trees showed alterations with respect to those of sound
trees. Alterations become stronger as the external symptoms increase. Plants with
few external symptoms showed slower growth and narrower vases, while those with
important symptoms showed an irregular tree ring structure and a strong alteration in
the cambial tissue functionality.
716
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
These results appear to demonstrate that some provenances are more
susceptible to this pathogen class, and that the increasing external symptoms correspond
to a progressive loss of functionality of the cambial tissues, and consequently, of the
wood structure.
Key words: Elm yellows, Hybrid elms, Ulmus glabra, Ulmus laevis, Ulmus minor.
Lavori citati/References
Goidanich G., 1951. Gli scopazzi dell’olmo. Informatore Fitopatologico, 14, 8.
Mittempergher L., Fagnani A., Ferrini F., D’Agostino G., 1990. Elm yellows, a disease
to be taken into consideration when breeding elm for disease resistance. In:
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Union, Agadir, Morocco, October 28-November 3, 1990, 433-435.
Mittempegher L., 2000. Elm yellows in Europe. In: C.P. Dunn (Ed.), The elms:
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Pisi A., Marani F., Bertaccini A., 1981. Mycoplasma-like organisms associated with
elm witches’-broom symptoms. Phytopathologia Mediterranea 20, 189-191.
717
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
Profili alcaloidei di piante di ginestra affette
da spartium witches’-broom
E. Mancini, C. Marcone, L. De Martino, V. De Feo
Dipartimento di Scienze Farmaceutiche, Università degli Studi di Salerno
Via Ponte Don Melillo, I-84084, Fisciano (SA)
E-mail: [email protected]
Gli alcaloidi di origine vegetale comprendono un ampio gruppo di composti
azotati, di basso peso molecolare, derivanti essenzialmente da aminoacidi, i quali
sono presenti in circa il 20% delle specie di piante. Questi composti, essendo
metaboliti secondari, svolgono nelle piante un importante ruolo di difesa nei confronti
di microrganismi fitopatogeni, di erbivori e fattori abiotici sfavorevoli. Essi possono
essere presenti in una pianta durante il suo intero ciclo vitale oppure possono essere
prodotti in reazione ad infezioni da parte di patogeni o in seguito a danni causati da
agenti abiotici e/o biotici (Wink, 1988; Zulak et al., 2006). A causa della loro potente
attività biologica, molti dei circa 12.000 alcaloidi noti sono stati utilizzati come
farmaci (Zulak et al., 2006; Hisiger e Jolicoeur, 2007). Nell’ambito dei principali
gruppi di alcaloidi vegetali, oltre 200 alcaloidi chinolizidinici sono stati rinvenuti
principalmente nella famiglia Fabaceae. In particolare, oltre 100 di tali composti sono
prodotti da membri del genere Lupinus. Gli alcaloidi chinolizidinici sono in genere
composti tossici con una potente attività antimicrobica (Kinghorn e Balandrin, 2001;
Zulak et al., 2006).
Nel presente studio, gli effetti di infezioni fitoplasmatiche sulla presenza di
alcaloidi in piante di Spartium junceum (ginestra), in condizioni naturali di infezione,
sono stati esaminati confrontando il contenuto e i profili di composti alcaloidei in piante
sane e piante affette dalla malattia nota come spartium witches’-broom (SpaWB),
mediante l’ausilio di tecnologie cromatografiche e spettrometriche. Piante di ginestra
facenti parte di ecosistemi naturali, mostranti sintomi tipici di SpaWB nonché piante
apparentemente sane sono state campionate in Campania, in una località presso Salerno,
nel corso della primavera degli anni 2007 e 2008. L’accertamento e l’identificazione
dei fitoplasmi associati alla malattia SpaWB sono stati condotti mediante la tecnica
della reazione a catena della polimerasi seguita dall’analisi del polimorfismo della
lunghezza dei frammenti di restrizione dell’rDNA fitoplasmatico amplificato, secondo
metodiche già descritte (Mancini et al., 2010). Per le analisi cromatografiche, sono
stati impiegati campioni costituiti da porzioni di fusti e rametti sia di piante sane
che di piante malate. Questi campioni sono stati sottoposti a tre serie di estrazioni
utilizzando cloroformio. I residui sono stati poi separati mediante cromatografia su
colonna di gel di silice utilizzando come eluente cloroformio e miscele di cloroformiometanolo a polarità crescente e le frazioni derivanti sono state raggruppate in
frazioni principali sulla base delle loro similarità chimiche, come dimostrato dalla
718
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
cromatografia in strato sottile (TLC). Le frazioni principali che contenevano alcaloidi
così come evidenziato tramite il reattivo di Dragendorff, sono state analizzate mediante
cromatografia in fase liquida ad alta pressione (HPLC) e spettrometria di massa (MS)
al fine di identificare gli alcaloidi rinvenuti. I risultati ottenuti hanno evidenziato che il
contenuto di alcaloidi in piante sane è considerevolmente più basso di quello di piante
malate. Sette composti alcaloidei sono stati identificati soltanto nelle piante malate.
Questi composti comprendono la N-metilcitisina, il suo isomero, N-formilcitisina e
un derivato idrossilato della sparteina. Quattro differenti alcaloidi, i quali includono
derivati idrossilati della citisina e dell’anagirina, sono stati rinvenuti sia nelle piante
sane che in quelle malate. Tutti gli alcaloidi identificati sono risultati appartenere
al gruppo dei composti chinolizidinici. I dati del presente studio evidenziano
ulteriormente il ruolo di infezioni fitoplasmatiche nello stimolare reazioni di difesa
delle piante, conformemente a quanto già dimostrato per altre combinazioni pianta
ospite-fitoplasma, sia in condizioni di infezione sperimentali che in quelle naturali
(Choi et al., 2004; Favali et al., 2004; Bruni et al., 2005; Musetti, 2010).
Parole chiave: Fitoplasmi, Metaboliti secondari, Reazioni di difesa della pianta,
Spartium junceum, Tecnologia HPLC.
Alkaloid profiling of spartium witches’-broom-affected Spanish broom plants
Plant alkaloids include a wide array of low-molecular-weight, nitrogencontaining compounds that are mostly derived from amino acids; these have been
reported to occur in about 20% of plant species. As secondary metabolites, the
alkaloids are believed to have an important defensive role in plants, against pathogenic
microorganisms, herbivores, and adverse abiotic factors. These compounds can
be present in a plant throughout its lifetime, or they can be produced in response
to infections by pathogens or following injury by abiotic and/or biotic agents
(Wink, 1988; Zulak et al., 2006). Due to their potent biological activity, many of
the approximately 12,000 known alkaloids have been exploited as pharmaceuticals
(Zulak et al., 2006; Hisiger and Jolicoeur, 2007). Among the major groups of plantderived alkaloids, more than 200 quinolizidine alkaloids are known to occur mainly
in the family Fabaceae. Over 100 of these compounds are produced by members of
the genus Lupinus. Quinolizidine alkaloids are generally toxic compounds with potent
antimicrobial activity (Kinghorn and Balandrin, 2001; Zulak et al., 2006).
In this study, the effects of phytoplasma infections on alkaloid occurrence in
Spartium junceum (Spanish broom) plants, under natural infection conditions were
investigated by comparing alkaloid contents and profiles from healthy and spartium
witches’-broom (SpaWB)-affected Spanish broom plants using chromatographic and
spectrometric methods. Field-grown symptomatic and non-symptomatic Spanish
broom plants were sampled in a location near Salerno in the Campania region
(southern Italy), in the spring of 2007 and 2008. Detection and identification of the
719
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
infecting phytoplasmas were performed using polymerase chain reaction (PCR)
technology, followed by restriction fragment length polymorphism analysis of
PCR-amplified phytoplasma rDNA, as reported previously (Mancini et al., 2010).
For chromatographic analyses, stem and shoot samples from healthy and SpaWBaffected Spanish broom plants were used. These samples were extracted three times
with chloroform. The chloroform extracts obtained were then fractioned on a silicagel column, using chloroform and chloroform-methanol mixtures of increasing
polarities. The resulting fractions were grouped into major fractions on the basis of
their chemical similarity, as demonstrated by thin-layer chromatography (TLC). Major
fractions, which proved to contain alkaloids in the TLC assays, as revealed by the use
of Dragendorff reagent, were analyzed by high-performance liquid chromatography
(HPLC) and mass spectrometry (MS), to identify the alkaloids. Data obtained revealed
that the alkaloid content was considerably lower in samples of healthy plants than in
those of diseased plants. Seven different alkaloids were identified only in diseased
plants. These compounds included N-methylcytisine, its isomer, N-formylcytisine,
and a hydroxy-substituted derivative of sparteine. Four alkaloids, including hydroxyderivatives of cytisine and anagyrine, were shared by both healthy and diseased plants.
All alkaloids identified were quinolizidine alkaloids. The results of the present study
further support the involvement of phytoplasma infections in triggering plant defence
responses, as previously shown for other host plant–phytoplasma systems under both
experimental and natural infection conditions (Choi et al., 2004; Favali et al., 2004;
Bruni et al., 2005; Musetti, 2010).
Key words: HPLC technology, Phytoplasmas, Plant defence responses, Secondary
metabolites, Spartium junceum.
Lavori citati/References
Bruni R., F. Pellati, M.G. Bellardi, S. Benvenuti, S. Paltrinieri, A. Bertaccini,
A. Bianchi, 2005. Herbal drug quality and phytochemical composition of
Hypericum perforatum L. affected by ash yellows phytoplasma infection.
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53, 964-968.
Choi Y.H., E.C. Tapias, H.K. Kim, A.W.M. Lefeber, C. Erkelens, J.T.J. Verhoeven, J.
Brzin, J. Zel, R. Verpoorte, 2004. Metabolic discrimination of Catharanthus
roseus leaves infected by phytoplasma using 1H-NMR spectroscopy and
multivariate data analysis. Plant Physiology, 135, 2398-2410.
Hisiger S., M. Jolicoeur, 2007. Analysis of Catharanthus roseus alkaloids by HPLC.
Phytochemistry Reviews, 6, 207-234.
Favali M.A., R. Musetti, S. Benvenuti, A. Bianchi, L. Pressacco, 2004. Catharanthus
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the composition of volatile compounds of Spartium junceum induced by the
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Empoasca decipiens: un nuovo vettore di
fitoplasmi
L. Galetto1, D. Pacifico1, C. Marzachì1, D. Bosco2
1
Istituto di Virologia Vegetale- CNR
Strada delle Cacce, 73, I-10135 Torino
2
Di.Va. P. R. A. - Entomologia e Zoologia Applicate all’Ambiente “Carlo Vidano”,
Università degli Studi di Torino Via Leonardo Da Vinci, 44,
I-10095 Grugliasco (TO)
E-mail: [email protected]
I fitoplasmi sono batteri fitopatogeni privi di parete cellulare che colonizzano
il floema e vengono trasmessi da cicaline e psille con modalità persistente-propagativa.
Molte specie di insetti vettori sono state identificate (Weintraub e Beanland, 2006),
ma molte altre sono ancora sconosciute. Tra i cicadellidi, esemplari appartenenti a
specie dei generi Empoasca e Asymmetrasca (Cicadellidae Typhlocybinae) sono
risultati positivi per la presenza di fitoplasmi (Pastore et al., 2004; Parrella et al.,
2008; Alhudaib et al., 2009). Tuttavia solo la specie E. papayae Oman è stata
recentemente identificata come vettrice del ‘Candidatus Phytoplasma aurantifolia’,
associato alla malattia della papaia nota come Papaya Bunchy Top disease (Perez et
al., 2010). Gli empoascini si nutrono principalmente nel mesofillo, ma l’ingestione
di elementi floematici è stata dimostrata almeno in E. fabae (Harris) (Backus et al.,
2005). Le specie del genere Empoasca sono polifaghe, ampiamente diffuse e in grado
di raggiungere elevati livelli di popolazione: il loro possibile ruolo come vettori
potrebbe avere un grande impatto sull’epidemiologia delle malattie da fitoplasmi e
sulle strategie di lotta e gestione conseguenti.
Lo scopo di questo lavoro è la valutazione della capacità di acquisizione e
trasmissione di fitoplasmi da parte di E. decipiens Paoli in condizioni controllate.
A questo scopo sono stati usati il fitoplasma associato al giallume del crisantemo
(chrysanthemum yellows phytoplasma-CYP, ‘Ca. P. asteris’, 16Sr-IB) e quello
associato alla Flavescenza dorata (Flavescence dorée phytoplasma-FDP, 16SrV-C) e
come piante ospiti Chrysanthemum carinatum Schousboe e Vicia faba (L.). Euscelidius
variegatus Kirschbaum, noto vettore di CYP e FDP, è stato posto ad acquisire sulle
stesse piante infette insieme agli individui di E. decipiens, come controllo positivo
di acquisizione. E. decipiens ha acquisito e trasmesso CYP su crisantemo, sebbene
con bassa efficienza. Un’elevata proporzione di cicaline, in seguito a nutrizione su
crisantemi infetti, è risultata positiva in PCR al fitoplasma, ma, in linea con il basso
tasso di trasmissione, CYP è stato rilevato nelle ghiandole salivari di un numero esiguo
di adulti di E. decipiens infetti. L’identificazione di CYP isolato in insetti e piante
ospiti infettate è stata confermata mediante l’analisi dei profili di PCR-RFLP dopo
digestione con due enzimi di restrizione dei geni 16Sr e secY. Il titolo di fitoplasma,
quantificato in real time PCR, era compreso in un intervallo simile a quello misurato
722
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
nei vettori di CYP, ed aumentava nel corso del tempo nel corpo dell’insetto, anche se
in maniera non significativa. Per contro, lo stesso insetto non ha acquisito nè trasmesso
CYP e FDP durante la nutrizione su fava. E. decipiens produceva sulle foglie di fava
segni tipici di nutrizione nel mesofillo, con svuotamento del contenuto di singole
cellule. Tali segni non erano chiaramente osservabili su crisantemo. Differenze nel
comportamento nutrizionale dell’insetto, in relazione alle differenti specie di pianta,
possono spiegare le diverse capacità di E. decipiens nell’acquisire e trasmettere
fitoplasmi.
Parole chiave: Crisantemo, Fava, Flavescenza dorata, Giallume del crisantemo,
Piante ospiti.
Empoasca decipiens: a new vector of phytoplasmas
Phytoplasmas are phloem-restricted plant pathogens, which are transmitted
by leafhoppers, planthoppers, and psyllids in a persistent propagative manner. Many
vectors have been identified, and most of them belong to the Cicadellidae family
(Weintraub and Beanland, 2006), although many others still remain to be discovered.
Among cicadellids, Empoasca and Asymmetrasca spp. (Cicadellidae Typhlocybinae)
have tested positive for the presence of some phytoplasmas (Pastore et al., 2004;
Parrella et al., 2008; Alhudaib et al., 2009), but transmission evidence has been
provided recently only for E. papayae Oman, which can transmit the ‘Candidatus
Phytoplasma aurantifolia’, which is associated with Papaya Bunchy Top disease
(Perez et al., 2010). Empoasca spp. are mainly mesophyll feeders, but ingestion from
phloem elements has been demonstrated, at least for E. fabae (Harris) (Backus et al.,
2005). These species are polyphagous, widespread, and can reach high population
densities: their possible roles as vectors may have a great impact on the epidemiology
of phytoplasma-associated diseases and on disease-management strategies.
The aim of this study was to investigate phytoplasma acquisition and
transmission by E. decipiens Paoli, using as pathogens, Chrysanthemum yellows
phytoplasma (CYP) ‘Ca. P. asteris’ (16Sr-IB) and Flavescence dorée phytoplasma
(FDP) (16SrV-C), and as host plants, Chrysanthemum carinatum Schousboe and Vicia
faba (L.). Euscelidius variegatus Kirschbaum, known vector of both CYP and FDP,
was caged together with E. decipiens on the same source plants, as positive control of
acquisition. E. decipiens acquired and transmitted CYP when fed on chrysanthemum,
although with low efficiency. A high proportion of the leafhoppers fed on CYP-infected
daisies acquired the phytoplasma, but, consistent with the low transmission rate, CYP
was found in the salivary glands of very few CYP-infected E. decipiens, indicating
that the salivary glands represent an important barrier to phytoplasma colonisation.
The identity of the CYP strain in the leafhopper and test plants was confirmed by
PCR-RFLP patterns of 16Sr and secY genes, digested with two restriction enzymes.
The CYP titre in E. decipiens was quantified by real-time PCR, and increased over
723
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
time, although not significantly, in a range similar to that found for other vector
species. On the other hand, the same leafhopper species failed to acquire and transmit
CYP and FDP when feeding on broad bean. Moreover, when feeding on broad bean,
E. decipiens left signs of single-cell puncture feeding, suggesting the ingestion of
individual mesophyll cell contents. These signs were less pronounced on daisy plants
exposed to the same leafhopper. Differences in feeding behaviour on different plant
species may explain the diverse phytoplasma acquisition and transmission capabilities
showed by E. decipiens.
Key words: Broad bean, Chrysanthemum, Chrysanthemum yellows, Flavescence
dorée, Host plants.
Lavori citati/References
Alhudaib K., Y. Arocha, M. Wilson, P. Jones, 2009. Molecular identification,
potential vectors and alternative hosts of the phytoplasma associated with a
lime decline disease in Saudi Arabia. Crop Protection, 28, 13-18.
Backus E.A., M.S. Serrano, C.M. Ranger, 2005. Mechanisms of hopperburn: an
overview of insect taxonomy, behavior, and physiology. Annual Review of
Entomology, 50, 125-151.
Parrella G., S. Paltrinieri, S. Botti, A. Bertaccini, 2008. Molecular identification
of phytoplasmas from virescent ranunculus plants and from leafhoppers in
Southern Italian crops. Journal of Plant Pathology, 90, 537-543.
Pastore M., E. Baffone, M. Santonastaso, R. Priore, S. Paltrinieri, A. Bertaccini,
A.M. Simeone, 2004. Phytoplasma detection in Empoasca decedens and
Empoasca spp. and their possible role as vectors of European Stone Fruit
Yellows (16SrX-B) phytoplasma. Acta Horticulturae, 657, 507-511.
Pérez K.A., B. Pinol, Y. Arocha, M. Wilson, E. Boa, J. Lucas, 2010. Transmission
of the phytoplasma associated with bunchy top symptom of papaya by
Empoasca papayae Oman. Journal of Phytopathology, 158, 194-196.
Weintraub P.G., L. Beanland, 2006. Insect vectors of phytoplasmas. Annual Review
of Entomology, 51, 91-111.
724
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
UNO SGUARDO D’INSIEME SU QUARANTENA E
MALATTIE DA FITOPLASMI
S. Nardi1, E. Rossini1 , B.C. Faraglia2
Servizio Fitosanitario Regionale - Agenzia Servizi Settore
Agroalimentare delle Marche
Via Alpi, 21, I-60131 Ancona
2
COSVIR XI, Servizio Fitosanitario Centrale - Ministero delle politiche agricole
alimentari e forestali
Via XX Settembre, 20, I-00187 Roma
1
E-mail: [email protected]
La quarantena vegetale è regolamentata dalla Convenzione Internazionale per
la Protezione dei Vegetali (CIPV) della FAO, cui sino ad oggi hanno aderito 173
Paesi. A sostegno della CIPV e per favorire la cooperazione internazionale nel settore
fitosanitario sono state istituite 9 Organizzazioni Regionali per la Protezione dei
Vegetali, che operano a livello delle aree geografiche della FAO. L’Organizzazione
Europea per la Protezione delle Piante (OEPP), è l’organizzazione di riferimento per
l’Europa ed il bacino del Mediterraneo. Questi organismi redigono ed aggiornano
elenchi delle avversità dei vegetali più pericolose delle quali non si vuole l’introduzione,
o, se introdotte, l’ulteriore diffusione nell’area di riferimento, raccomandando il
loro inserimento nelle legislazioni per la protezione dei vegetali dei singoli Paesi.
Le liste stilate dall’OEPP sono rispettivamente: A1, A2, Alert list ed Action list.
Nella lista A1 dove sono elencati gli organismi da quarantena assenti nell’area
OEPP, i fitoplasmi sono 6 (Candidatus Phytoplasma ulmi, Palm lethal yellowing
phytoplasma, Peach rosette phytoplasma, Peach yellows phytoplasma, Potato purpletop wilt phytoplasma, Western X-disease phytoplasma). Nella lista A2 che include
organismi presenti solo localmente in alcune zone, dei quali si vuole evitare l’ulteriore
diffusione, i fitoplasmi da quarantena sono 4 (Ca. Phytoplasma mali, Ca Phytoplasma
pyri, Ca. Phytoplasma solani e Ca. Phytoplasma vitis). L’Alert list include gli
organismi nocivi che possono presentare un rischio fitosanitario potenzialmente
elevato e da sottoporre alla valutazione del rischio medesimo (Pest risk analysis).
Al momento non vi sono fitoplasmi nell’Alert list, così come non sono presenti in
Action list. L’Unione Europea (UE) nella normativa di riferimento (DIR 2000/29/
CE) riporta, in Allegato I parte A sezione I, 5 fitoplasmi da quarantena non presenti
sul proprio territorio (Micoplasma delle necrosi del floema dell’olmo, Peach rosette
mycoplasm, Peach X-disease mycoplasm, Peach yellows mycoplasm e Strawberry
witches’ broom mycoplasm), mentre nella sezione II ne elenca 3 presenti localmente
(Apple proliferation mycoplasm, Apricot chlorotic leafroll mycoplasm e Pear decline
mycoplasm). La stessa direttiva in Allegato II ha in elenco 2 fitoplasmi da quarantena
(Palm lethal yellowing mycoplasm e Witches’ broom MLO) dei quali non si vuole
l’introduzione sul proprio territorio se associati a specifici vegetali, come pure 2 sono
725
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
i fitoplasmi (Grapevine Flavescence dorée MLO e Potato stolbur mycoplasm) tra gli
organismi nocivi di cui è nota la presenza ma che non devono essere ulteriormente
diffusi se associati al vegetale che danneggiano. Infine un solo fitoplasma (Grapevine
Flavescence dorée MLO) è associato ad alcune zone protette dell’UE. Si può
immediatamente osservare che il numero di fitoplasmi da quarantena che causano
malattie delle piante non è elevato se rapportato a quello di altri microrganismi presenti
negli elenchi specificati; tuttavia alcuni di essi risultano particolarmente pericolosi per
i danni arrecati alle coltivazioni suscettibili. Conseguentemente a livello nazionale
sono stati emanati due decreti di lotta obbligatoria nei confronti della flavescenza
dorata della vite e del citoplasma degli scopazzi del melo. Dal confronto tra le scelte
operate in sede OEPP e quelle dell’UE si osserva una non completa corrispondenza,
con un maggior numero di organismi nocivi indicati negli allegati della direttiva
DIR 2000/29/CE. Anche la terminologia dei fitoplasmi da quarantena utilizzata
nelle diverse norme presenta alcune difformità, che possono interferire con i criteri
di classificazione e la diagnosi dei singoli microrganismi. Si sottolinea infine che in
caso di identificazione di un organismo nocivo da quarantena è obbligatorio darne
comunicazione immediata al Servizio Fitosanitario Nazionale per la predisposizione
del necessario piano di eradicazione e degli altri adempimenti di legge.
Parole chiave: Diffusione, Introduzione, Organismi nocivi.
Phytoplasmas as quarantine pests: an overview
Quarantine plant health agreements are laid down in the International Plant
Protection Convention (IPPC), with 173 current signatories. To support IPPC around
the World, there are nine Regional Plant Protection Organisations (RPPOs), which
are responsible for cooperation in plant health, and organised according to the FAO
geographical areas. The European Plant Protection Organization (EPPO) is relevant
to Europe and the Mediterranean Basin. The RPPOs list and update quarantine pests
that are absent into their areas, or even if they occur, the introduction and spread of
which shall be banned. They recommend the inclusion of quarantine pests in plant
health regulations of the contracting countries. The EPPO lists are respectively:
A1, A2, Alert list and Action list. In the A1 list, including quarantine pests absent
from the EPPO region, there are six phytoplasmas (Candidatus Phytoplasma ulmi,
Palm lethal yellowing phytoplasma, Peach rosette phytoplasma, Peach yellows
phytoplasma, Potato purple-top wilt phytoplasma, Western X-disease phytoplasma).
In the A2 list, including quarantine pests locally present in the EPPO region, there are
four phytoplasmas (Ca. Phytoplasma mali, Ca. Phytoplasma pyri, Ca. Phytoplasma
solani and Ca. Phytoplasma vitis). The alert list contains harmful organisms that
are associated with potentially high phytosanitary risk, to submit them to Pest Risk
Analysis (PRA). At the moment, no phytoplasmas are on the Alert list, nor the Action
list. The European Union (EU) Directive 29/2000/EC, Annex I, part A, section I, lists
726
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
five quarantine phytoplasmas that are absent into its territory (Elm phlöem necrosis
mycoplasm, Peach rosette mycoplasm, Peach X-disease mycoplasm, Peach yellows
mycoplasm and Strawberry witches’ broom mycoplasm), while three phytoplasmas
(Apple proliferation mycoplasm, Apricot chlorotic leafroll mycoplasm and Pear
decline mycoplasm), which are present locally in the EPPO area, are listed in section
II. The same regulation, Annex II, contains two quarantine phytoplasmas (Palm lethal
yellowing mycoplasm and Witches’ broom MLO), the introduction of which into,
and spread within, all of the Member States shall be banned if they are present on
certain plants or plant products, as well as two harmful organisms known to occur in
the community and relevant for the entire community (Grapevine Flavescence dorée
MLO and Potato stolbur mycoplasm). Finally, only one phytoplasma (Grapevine
Flavescence dorée MLO) is associated with protected zones. It is clear that the
number of quarantine phytoplasmas is not so high if this is compared to the other
microorganisms listed in quarantine regulations; anyway, some of these pests are
very dangerous and they can deeply damage susceptible plants. In Italy, two Decrees
for the compulsory control of grapevine Flavescence dorée and Apple proliferation
phytoplasma have been defined. Comparing EPPO lists and the Annexes of Directive
29/2000/EC, the higher number of quarantine phytoplasmas in the EU regulation
can be noted. The terminology used to name each phytoplasma can be different, and
some of these differences can give troubles in the use of taxonomy criteria and the
analysis of the results. In the end, it is important to emphasize that when a quarantine
harmful organism is detected, it is compulsory to quickly note its presence to the Plant
Protection Service to allow the relevant authorities to organise an eradication plan and
other regulated provisions.
Key words: Harmful organisms, Introduction, Spread.
Lavori citati/References
Direttiva 2000/29/CE del Consiglio, dell’8 maggio 2000, concernente le misure
di protezione contro l’introduzione nella Comunità di organismi nocivi ai
vegetali o ai prodotti vegetali e contro la loro diffusione nella Comunità - GU
L 169 del 10.7.2000, 1–112.
D.M. 31 maggio 2000 – Misure per la lotta obbligatoria contro la Flavescenza dorata
della vite – G.U. 10 luglio 2000, n. 159.
D.M. 23 febbraio 2006 – Misure per la lotta obbligatoria contro il fitoplasma Apple
Proliferation Phytoplasma - G.U. 14 marzo 2006, n. 61.
www.eppo.org
www.ippc.int
727
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
Identificazione molecolare di Cixiidi vettori,
accertati e potenziali, del fitoplasma
associato al Legno Nero della vite
S. Bertin1, L. Picciau1, Z. Ács2, A. Alma1, D. Bosco1
1
DIVAPRA – Entomologia e Zoologia applicate all’Ambiente “Carlo Vidano”,
Università di Torino
Via L. da Vinci, 44, I-10095 Grugliasco (TO)
2
Fitolab Plant Pest Diagnostic and Advisory
Ltd. Istenhegyi út, 29, H-1125, Budapest
E-mail: [email protected]
La famiglia di insetti Cixiidae include specie economicamente importanti
per il loro ruolo di vettori di fitoplasmi appartenenti al gruppo stolbur (Candidatus
Phytoplasma solani, sottogruppo 16SrXII-A). Hyalesthes obsoletus Signoret trasmette
il fitoplasma associato al giallume della vite noto come Legno nero (LN) (Maixner,
2006), mentre Reptalus panzeri Löw è il vettore di una fitopatia del mais nota come
arrossamento del mais (Jović et al., 2007). Sebbene H. obsoletus sia l’unico vettore
accertato di LN, altre specie di cixiidi potrebbero essere coinvolte nella trasmissione
di questa fitoplasmosi. Infatti, le specie R. panzeri and H. luteipes Fieber sono
state trovate positive al LN e R. quinquecostatus Dufour è in grado di inoculare il
fitoplasma in mezzo artificiale (Palermo et al., 2004; Trivellone et al., 2005; Pinzauti
et al., 2008).
Ad oggi, l’identificazione delle specie di cixiidi è riservata a pochi entomologi
esperti ad è basata sulla morfologia dell’armatura genitale maschile, impedendo di
fatto il riconoscimento degli stadi giovanili e delle femmine. Metodi molecolari basati
sull’analisi del DNA possono essere di supporto ai tradizionali strumenti tassonomici.
Il nostro lavoro descrive l’efficacia delle regioni geniche mitocondriali e ribosomali
nell’identificazione di alcune specie appartenenti ai generi Hyalesthes e Reptalus.
Saggi di PCR-RFLP eseguiti con l’enzima di restrizione AluI sul gene
mitocondriale codificante per la subunità 1 della citocromo ossidasi (COI)
hanno prodotto profili specie-specifici per quattro specie del genere Reptalus:
R. quinquecostatus, R. cuspidatus Fieber, R. panzeri e R. melanochaetus Fieber.
L’amplificazione della regione ribosomale spaziatrice ITS2 fornisce frammenti
di dimensione specifica per R. quinquecostatus e R. melanochaetus e un’ulteriore
digestione enzimatica dei prodotti di PCR con TaqI consente di discriminare tra R.
cuspidatus e R. panzeri. Analogamente, tre specie di Hyalesthes, H. obsoletus, H.
luteipes e H. scotti Ferrari, possono essere identificate grazie al polimorfismo di
dimensione dei frammenti di PCR della regione ITS2. Alternativamente, le tre specie
possono essere identificate mediante un saggio di PCR-RFLP eseguito con TaqI sul
gene COI.
La ripetibilità dei marcatori ribosomali e mitocondriali è stata convalidata su
728
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
un ampio numero di campioni raccolti su diverse piante ospiti e provenienti da diverse
aree geografiche dell’Italia e dell’Est Europa. Entrambe le chiavi di identificazione
molecolare sono risultate attendibili e forniscono un rapido strumento identificativo
che può contribuire ad allargare la ristretta cerchia di entomologi specializzati nel
riconoscimento dei cixiidi. Inoltre, questi marcatori possono essere applicati con
successo agli stadi giovanili, privi di tratti morfologici distintivi, consentendo di
ampliare il periodo di monitoraggio degli insetti vettori e permettendo l’inequivocabile
associazione di ciascuna specie con l’effettiva pianta ospite. Le nuove chiavi
molecolari potranno pertanto facilitare l’attività di monitoraggio dei potenziali vettori
di stolbur.
Per quanto riguarda H. obsoletus, le sequenze ITS2 e COI sono state analizzate
anche a livello intra-specifico. Entrambi i marcatori hanno confermato un elevato grado
di conservazione genetica all’interno della specie, poiché popolazioni provenienti da
diverse regioni geografiche e raccolte su diverse piante ospiti non hanno rivelato alcun
polimorfismo.
Parole chiave: Hyalesthes, Identificazione specifica, ITS2, mtCOI, Reptalus.
Molecular identification of the Cixiid species known or suspected to be vectors
of Bois noir
The insect family Cixiidae includes economically important vectors of
phytoplasmas belonging to the stolbur group (Candidatus Phytoplasma solani,
16SrXII-A subgroup). Hyalesthes obsoletus Signoret transmits the phytoplasma
associated with a serious grapevine yellows known as Bois noir (BN) (Maixner,
2006), while Reptalus panzeri Löw is the vector of maize redness (Jović et al., 2007).
Although H. obsoletus is the only ascertained vector of BN, other cixiids are suspected
to be involved in disease transmission. Indeed R. panzeri and H. luteipes Fieber have
been found positive to BN, and R. quinquecostatus Dufour has successfully inoculated
the phytoplasma into an artificial medium (Palermo et al., 2004; Trivellone et al.,
2005; Pinzauti et al., 2008).
To date, cixiid species recognition is restricted to a few specialist entomologists,
and it is based on the morphology of the male genitalia, thus hampering the identification
of juveniles and adult females. DNA-based approaches can offer valuable support to
the traditional taxonomic methods. Our study reports the suitability of both ribosomal
and mitochondrial DNA regions for the identification of Hyalesthes and Reptalus
species.
PCR-RFLP assays carried out on the mitochondrial cytochrome oxidase I
gene (COI) with AluI provided species-specific profiles for four Reptalus species: R.
quinquecostatus, R. cuspidatus Fieber, R. panzeri and R. melanochaetus Fieber. The
amplification of a ribosomal internal transcribed spacer region (ITS2) also provided
specific fragments for R. quinquecostatus and R. melanochaetus; a further digestion
729
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
of the ITS2 PCR products with TaqI allowed discrimination of R. cuspidatus and R.
panzeri. Three Hyalesthes species, H. obsoletus, H. luteipes and H. scotti Ferrari, can
be identified by their species-specific ITS2 amplicon sizes. Alternatively, the three
Hyalestes species can be identified by TaqI-RFLP profiles of the mtCOI gene.
The repeatability of the markers was validated on a large number of individuals
collected on different host plants at multiple sites in Italy and eastern Europe. These
molecular identification keys are fast and reliable, and they can help to broaden the
current handful of entomologists who are involved in cixiid identification. Furthermore,
these markers can be successfully applied to nymphs, morphological distinctive traits
of which are not available. The identification of nymphs greatly extends the vector
monitoring period, and allows unambiguous association with the actual host plants.
Thus, these molecular tools will help monitoring activities of potential stolbur vectors.
For H. obsoletus, the ITS2 and COI sequences were analysed at the intraspecific level. Both markers confirmed a high degree of genetic conservation within
the species, and populations from different geographic areas or different host plants
did not show any polymorphism.
Key words: Hyalesthes, ITS2, mtCOI, Reptalus, Species identification.
Lavori citati/References
Jović J., T. Cvrković, M. Mitrović, S. Krnjajić, M.G. Redinbaugh, R.C. Pratt, R.E.
Gingery, S.A. Hogenhout, I. Toševski, 2007. Roles of stolbur phytoplasma
and Reptalus panzeri (Cixiidae, Auchenorrhyncha) in the epidemiology of
Maize redness in Serbia. European Journal of Plant Pathology, 118, 85-89.
Maixner M., 2006. Grapevine yellows – Current developments and unsolved
questions. Extended abstracts of the 15th meeting of the International Council
for the Study of Virus and Virus-like Diseases of the Grapevine (ICVG),
Stellenbosch, South Africa, April 3-7, 86-87.
Palermo S., M. Elekes, S. Botti, I. Ember, A. Alma, A. Orosz, A. Bertaccini, M.
Kölber, 2004. Presence of stolbur phytoplasma in Cixiidae in Hungarian
vineyards. Vitis, 43, 201-203.
Pinzauti F., V. Trivellone, B. Bagnoli, 2008. Ability of Reptalus quinquecostatus
(Hemiptera: Cixiidae) to inoculate stolbur phytoplasma to artificial feeding
medium. Annals of Applied Biology, 153, 299-305.
Trivellone V., F. Pinzauti, B. Bagnoli, 2005. Reptalus quinquecostatus (Dufour)
(Auchenorrhyncha Cixiidae) as a possible vector of Stolbur-phytoplasma in
a vineyard in Tuscany. Redia, 88, 103-108.
730
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
Impiego della geostatistica e delle reti
neurali artificiali per lo studio della
distribuzione spaziale di
Scaphoideus titanus Ball
F. Lessio1, E. Borgogno Mondino2, A. Alma1
1
DIVAPRA, Entomologia e Zoologia applicate all’Ambiente “C. Vidano”, Università
degli Studi di Torino
Via Leonardo da Vinci, 44, I-10095 Grugliasco (TO)
2
DEIAFA, Costruzioni Rurali e Topografia, Università degli Studi di Torino
Via Leonardo da Vinci, 44, I-10095 Grugliasco (TO)
E-mail: [email protected]
Scaphoideus titanus Ball (Hemiptera: Cicadellidae) è ritenuto il principale
vettore del fitoplasma 16SrV (sottogruppi C e D) agente causale della Flavescenza
dorata della vite (FD) (Weintraub e Beanland, 2006). Una delle problematiche di
attualità riguarda la presenza di vigneti non correttamente sottoposti a trattamenti
insetticidi e di incolti con presenza di vite inselvatichita, che possono fungere da
serbatoi del fitoplasma e dell’insetto vettore (Lessio et al., 2007). La presente ricerca
aveva lo scopo di studiare la mutua influenza di tali agroecosistemi riguardo alla
dispersione e alla diffusione di S. titanus e i fattori condizionanti la sua densità di
popolazione.
Le indagini sono state condotte nel 2007 nei comuni di Calliano,
Castell’Alfero, Portacomaro e Tonco (AT), esaminando 58 particelle così ripartite:
41 vigneti a gestione integrata, 4 biologici, 5 non trattati e 8 incolti. Gli adulti di
S. titanus sono stati campionati con trappole cromotattiche gialle, 230 complessive,
ognuna delle quali è stata georeferenziata. Le catture sono state sottoposte ad analisi
geostatistica per verificare la correlazione spaziale: il semivariogramma sperimentale
è stato interpolato con tre modelli teorici (sferico, esponenziale e gaussiano) e
sottoposto a cross-validation per l’adattamento del modello stesso (Liebhold et al.,
1993). L’influenza dei fattori ambientali è stata studiata impiegando una rete neurale
artificiale (Rumelhart et al., 1986), utilizzando come input sette variabili: quota
assoluta, pendenza, quota relativa, diversità del paesaggio, rapporto perimetro-area
parcella, radiazione solare potenziale e gestione fitosanitaria; l’output era costituito
dalle catture degli adulti di S. titanus in un dato punto di campionamento.
La correlazione spaziale è risultata evidente a bassi valori di lag, decadendo
invece per distanze maggiori (70-121 m). L’adattamento al modello è stato significativo
per i semivariogrammi esponenziale e gaussiano, ma non per quello sferico. Il grado di
correlazione è risultato moderato (46%) per il semivariogramma esponenziale e scarso
(20%) per quello gaussiano. La rete neurale ha simulato con buona approssimazione
i dati delle catture di S. titanus a partire dai dati di input. I fattori maggiormente
condizionanti sono risultati la gestione fitosanitaria, e secondariamente il grado di
731
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
diversità del paesaggio. La rete neurale è stata quindi impiegata per simulare la densità
di popolazione di S. titanus nell’areale d’indagine, utilizzando dati cartografici per
desumere gli input e ipotizzando diversi scenari riguardanti la gestione fitosanitaria.
Tale modello potrebbe trovare impiego, nelle aree viticole esistenti o di nuovo
impianto, per la valutazione del rischio legato alla presenza e alla consistenza delle
popolazioni dell’insetto vettore.
Parole
chiave: Cicalina,
Semivariogramma.
Correlazione
spaziale,
Mappa
d’interpolazione,
Use of geostatistics and artificial neural networks for studying the spatial
distribution of Scaphoideus titanus Ball
Scaphoideus titanus Ball (Hemiptera: Cicadellidae) is deemed to be the
main vector of the 16SrV phytoplasma (subgroups C and D), the agent of grapevine
Flavescence dorée (FD) (Weintraub and Beanland, 2006). One of the main problems
is the presence of untreated vineyards and uncultivated areas with wild grapevines
(as overgrown cast-aside rootstock) that can act as sources of infestation of the insect
vector (Lessio et al., 2007). The aim of this study was to investigate the mutual
influence of these agroecosystems on the dispersal and spread of S. titanus, and to
determine the factors that influence the S. titanus population density.
The study was conducted during 2007, in the Calliano, Castell’Alfero,
Portacomaro and Tonco districts (province of Asti). Fifty-eight plots were examined,
which included: 41 standard IPM vineyards, 4 organic, 5 untreated, and 8 uncultivated
areas. S. titanus adults were sampled with yellow traps: 230 traps were used, and
each one was georeferenced. The captures were subject to geostatistical analyses, to
determine the spatial correlation. The sample variogram was fitted to three theoretical
models (spherical, exponential and Gaussian), and a cross-validation procedure was
performed for model adaptation (Liebhold et al., 1993). The influence of environmental
factors was studied using an artificial neural network (Rumelhart et al., 1986), using
seven inputs: elevation, slope, height above channel, landscape diversity, perimeterto-area ratio, potential solar radiation, and pest management; the output consisted of
the adults of S. titanus captured at a given location.
Spatial correlation was evident at low lag distances, and decreased at higher
distances (70-121 m). Model adaptation was significant for the exponential and
Gaussian variograms, but not for the spherical one. The correlation was moderate
(46%) for the exponential, and low (20%) for the Gaussian variogram. The neural
network achieved a good prediction of S. titanus capture data from the input variables.
The most important factor was pest management, and secondarily, landscape diversity.
The neural network was then used to simulate the population density of S. titanus in
the study area, using land-map data for calculating the input factors, and by theorizing
different pest management scenarios. This model can be used in present and future
732
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
viticulture areas as a tool for risk assessment of the presence and population density
of the insect vector.
Key words: Interpolation map, Leafhopper, Spatial correlation, Variogram.
Lavori citati/References
Lessio F., R. Tedeschi, A. Alma, 2007. Presence of Scaphoideus titanus on
American grapevine in woodlands, and infection with “Flavescence dorée”
phytoplasmas. Bulletin of Insectology, 60, 373-374.
Liebhold A., R.E. Rossi, W.P. Kemp, 1993. Geostatistic and geographic information
systems in applied insect ecology. Annual Review of Entomology, 38, 303327.
Rumelhart D.E., G.E. Hinton, R.J. Williams, 1986. Learning internal representations
by error propagation. In: D.E. Rumelhart, J.L. McClelland (Eds.), Parallel
Distributed Processing, vol. 1. MIT Press, Cambridge, Maryland, USA, 318-362.
Weintraub P.G., L. Beanland, 2006. Insect vectors of phytoplasmas. Annual Review
of Entomology, 51, 91-111.
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Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
Presenza di vettori dei giallumi della vite
nella filiera vivaistica in Veneto
F. Tessari1, N. Mori2, A. Zorloni3, F. Quaglino3, G. Zanini4, P.A. Bianco3
1
Agrea Centro Studi
Via Garibaldi, 5/16, I-37057 San Giovanni Lupatoto (VR)
2
Dipartimento di Agronomia ambientale e Produzioni vegetali – Sezione
Entomologia, Università di Padova
Viale dell’Università, 16, I-35020 Legnaro (PD)
3
Dipartimento di Produzione Vegetale - Sezione Patologia Vegetale
Via Celoria, 2, I-20133 Milano
4
Servizio Fitosanitario Regione Veneto, Unità periferica di Verona
Viale dell’Agricoltura, 1A, I- 37060 Buttapietra (VR)
E-mail: [email protected]
Dal 1973, anno di segnalazione dei giallumi della vite (GY) in Italia (Belli et al.,
1973), la Flavescenza dorata (FD, associata a fitoplasmi dei sottogruppi tassonomici
16SrV-C e -D) ed il Legno nero (LN, associato a fitoplasmi del sottogruppo tassonomico
16SrXII-A) rappresentano un problema fitosanitario di rilevanza nazionale (Barba et
al., 2006). Le strategie di contenimento di FD sono basate sul controllo del vettore
Scaphoideus titanus Ball; nel caso di LN, invece, considerando l’inefficacia della
tradizionale lotta insetticida al vettore Hyalesthes obsoletus Signoret, l’unica forma
di lotta efficace è l’eliminazione selettiva delle piante ospiti di tale cicalina. In ogni
caso, vista la difficoltà nel contenimento di GY in alcune aree viticole, risulta molto
importante la prevenzione. E’ dimostrato infatti che FD e LN possono diffondersi
anche attraverso la commercializzazione del materiale vivaistico in modo più o meno
rilevante (dall’1% al 4%) a seconda della sanità del materiale di partenza (Osler et
al., 2002): la commercializzazione di poche piante ammalate risulta cruciale per la
diffusione di GY in quelle aree viticole dove la malattia non è presente (Credi et al.,
2007).
Durante le stagioni vegetative 2008-2009 è stata indagata (con strumenti di
cattura diretta ed indiretta) la presenza degli insetti vettori di GY nella filiera vivaistica
veneta (Piante Madri Portainnesti - PMP, Piante Madri Marze - PMM ed i Barbatellai)
al fine di fornire indicazioni utili alla lotta insetticida. Complessivamente sono stati
monitorati 16 appezzamenti situati nelle province di Verona e Venezia.
S. titanus è stato riscontrato principalmente (96% delle catture) nei PMP con
sistema d’allevamento strisciante, occasionalmente (4% delle catture) nei PMM o nei
PMP allevati su rete; nei barbatellai non è stato catturato alcun individuo. L’88%
degli insetti è stato catturato mediante trappole cromotropiche, il restante 12% con il
retino entomologico. Nei siti monitorati S. titanus è stato rilevato per l’82% lungo i
bordi, facendo ipotizzare una re-infestazione da fonti d’inoculo esterne più che ad una
inefficacia dei trattamenti insetticidi eseguiti. Dalle analisi molecolari condotte, nessun
734
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
individuo di S. titanus è risultato positivo all’amplificazione condotta con primers
specifici per i sottogruppi tassonomici16SrV-C/-D. I dati ottenuti suggeriscono che,
per garantire l’assenza del vettore di FD nella filiera vivaistica, è indispensabile che
in tutto l’areale di coltivazione si effettui una corretta lotta insetticida e per i campi
PMP si adottino forme di allevamento adeguate che consentano l’esecuzione dei
trattamenti in modo efficiente. H. obsoletus, invece, è stato riscontrato in tutti i PMP,
PMM e barbatellai con quantità di catture legate alla presenza di U. dioica. Il 90%
degli individui rilevati è stato catturato mediante sfalcio con il retino entomologico ed
il 95% delle catture è stato effettuato sui bordi. Le analisi molecolari condotte hanno
evidenziato che il 9,2% degli individui catturati nel 2008 e l’8,1% nel 2009, sono
risultati positivi all’amplificazione condotta con primers specifici per il sottogruppo
tassonomico 16SrXII-A. Questi risultati confermano che l’eliminazione di ortica e
convolvolo dai vigneti consente di contenere la presenza del vettore di LN.
Parole chiave: Flavescenza dorata, Hyalesthes obsoletus, Legno nero, Scaphoideus
titanus, Vite.
Insect vectors of grapevine yellows in nursery industry of Veneto region
Since first report of grapevine yellows (GY) in 1973 in Italy (Belli et al., 1973),
Flavescence dorée (FD, associated with the 16SrV-C/-D subgroup of phytoplasmas)
and Bois noir (BN, associated with 16SrXII-A subgroup of phytoplasma) are still
important problems throughout the country (Barba et al., 2006). FD management is
based on controlling the insect vector, Scaphoideus titanus Ball. In the case of BN,
considering the fewer effective insecticide treatments against H. obsoletus, the sole
efficient control strategy against BN is the specific elimination of the insect vector
plant hosts. As GY control is difficult, preventive measures are crucial. Interestingly,
it was reported that FD and BN can spread by propagating material (from 1% to 4%)
(Osler et al., 2002). Even if the role of nursery activities is marginal, marketing of a
few diseased plants in areas where GY are absent is critical (Credi et al., 2007).
To plan pesticides treatments, the presence of GY-phytoplasma insect vectors
in the nursery industry (rootstock mother plants [RMP], mother plants [MP], and
rootling plantlets [RP]) was surveyed in the years 2008 and 2009 in 16 nursery
vineyards in Verona and the Venezia provinces.
S. titanus was mainly identified in creeping RMP (96% of captured
individuals), and occasionally (4% of captured individuals) in net-grown RMP or
MP; no individuals were captured in field nurseries. Insect individuals were mainly
captured by sticky traps (88%) or by sweep nets (12%). S. titanus was prevalent in
vineyard borders (82% of captured insects), suggesting possible re-infestation from
external inoculum sources. Molecular analyses revealed that no S. titanus individuals
were positive to amplifications by 16SrV-C/-D phytoplasma specific primers. The
data obtained suggest the application of a correct insect management and the use of a
735
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
RMP growing system that allows effective insecticide treatments to be used, to ensure
the absence of the FD insect vector. On the other hand, H. obsoletus was identified in
RMP, MP and RP, and its frequency was strictly associated with the presence of U.
dioica. The prevalence of the insect individuals (90%) was captured using a sweep net
in the vineyard, where the insects were more frequently found at the borders (95% of
captured individuals). Molecular analyses identified stolbur phytoplasma in 9.2% and
8.1% of the vector individuals captured in 2008 and 2009, respectively. These data
confirm that specific elimination of nettle and bindweed plants is the sole efficient
control strategies for BN epidemic management.
Key words: Bois noir, Flavescence doreé, Grapevine, Hyalesthes obsoletus,
Scaphoideus titanus.
Ringraziamenti/Acknowledgements
Lavoro svolto nell’ambito del Progetto “Prevenzione e contenimento del
Legno nero della vite nella filiera vivaistica” finanziato dalla Regione Veneto.
Lavoro citati/References
Barba M., L. Ferretti, G. Pasquini, 2006. I giallumi della vite: un problema
fitosanitario di rilevanza nazionale. Informatore fitopatologico, 4, 4-8.
Belli G., A. Fortusini, R. Osler, A. Amici, 1973. Presenza di una malattia del tipo
“Flavescence dorée” in vigneti dell’Oltrepò pavese. Rivista di Patologia
Vegetale, IV(9), 50-56.
Credi R., F. Terlizzi, L. Milanesi, R. Bondavalli, F. Rizzoli, V. Vicchi, 2007. Il Legno
nero della vite si trasmette poco con l’innesto. L’informatore Agrario, 40,
53-57.
Osler R., C. Zucchetto, L. Carraro, C. Frausin, F. Pavan, G. Vettorello, V.
Girolami, 2002. Trasmissione di Flavescenza dorata e Legno nero e
comportamento delle viti infette. L’informatore Agrario, 19, 61-65.
736
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
Presenza e distribuzione di cixiidi in vigneti di
lambrusco affetti da legno nero
N. Mori1, N. Reggiani2, M. Bacchiavini3, F. Pavan4, S. Paltrinieri5, A. Bertaccini5
Dipartimento di Agronomia ambientale e Produzioni Vegetali - Entomologia,
Università di Padova, Agripolis
Viale dell’Università, 16, I-35020 Legnaro (PD)
2
Consorzio Fitosanitario Provinciale di Modena
Via Santi, 14, I-4123 Modena
3
Consorzio Fitosanitario Provinciale di Reggio Emilia
Via Gualerzi, 32, I-42124 Reggio Emilia
4
Dipartimento di Biologia e Protezione delle Piante, Università di Udine
Via delle Scienze, 208, I-33100 Udine
5
Alma Mater Studiorum, Università di Bologna – DiSTA, Patologia Vegetale
Viale Fanin, 42, I-40127 Bologna
1
E-mail: [email protected]
In questi ultimi anni nelle regioni nord-est italiane, il Legno nero della vite
(LN) è in forte e continua espansione ed in molte regioni italiane è la fitoplasmosi
della vite maggiormente presente (Bondavalli et al., 2005; Borgo et al., 2005). Oltre
che nel suo vettore naturale Hyalesthes obsoletus Signoret, il fitoplasma agente
della malattia è stato rinvenuto in altre cicaline appartenenti alla famiglia dei cixiidi,
Reptalus quinquecostatus (Dufour) e R. panzeri (Löw) (Trivellone et al., 2006; Jovic
et al., 2007), che per la loro potenziale capacità di trasmissione potrebbero essere
coinvolte nella epidemiologia di questo giallume (Maixner, 2006). Al fine di rilevare
ed identificare la presenza di altri potenziali vettori della fitoplasmosi nell’areale
di coltivazione del Lambrusco sono stati condotti monitoraggi in 25 vigneti affetti
da LN siti nelle provincie di Modena e Reggio Emilia. Nel triennio 2007-2009,
settimanalmente da giugno a settembre, è stata verificata sulle viti e sulle aree
circostanti i vigneti la presenza dei cixiidi con strumenti di cattura diretta (retino da
sfalcio e ombrello entomologico) e indiretta (trappole cromotropiche). Gli insetti
catturati sono stati identificati ed analizzati con indagini molecolari per verificare la
presenza del fitoplasma con analisi nested-PCR/RFLP sui geni ribosomici 16S e Tuf.
Sono stati catturati ed identificati individui appartenenti ai generi Hyalesthes, Cixius
e Reptalus; le specie più abbondanti sono risultate H. obsoletus (99,4% dei 1.234
individui del genere Hyalesthes catturati), Cixius cunicularis L. (94,9% dei 275 Cixius
sp. catturati) e R. panzeri (65% dei 177 Reptalus sp. catturati). Inoltre, in quantità
molto limitate, sono stati identificati individui di H. luteipes Fieber, C. nervosus L.
e R. quinquecostatus. Lo sfalcio della vegetazione erbacea è risultato il metodo più
efficace per il monitoraggio di H. obsoletus e Reptalus spp. (rispettivamente il 97,7%
e il 78,0% di tutti gli esemplari catturati), mentre il “frappage” delle viti è risultato
un valido strumento per studiare la presenza e l’ecologia del genere Cixius (62,9%
737
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
di tutti gli individui catturati). La maggior parte degli insetti (88,7% Hyalesthes
sp., 70,8% Reptalus sp. e 66,1% Cixius sp.) sono stati catturati sulla vegetazione
spontanea presente sui bordi dei vigneti. Alle analisi molecolari sono risultati positivi
al fitoplasma stolbur associato a LN H. obsoletus (52% su 58 campioni analizzati),
Cixius spp. (13,6% su 66 campioni analizzati), Reptalus spp. (15,6% su 51 campioni
analizzati); entrambi i tipi tuf individuati in vite sono stati riscontrati. Interessante
notare che il 12,1% dei campioni di Cixius spp. analizzati è risultato positivi a
fitoplasmi del gruppo 16SrI-B (aster yellows), individuati in percentuali crescenti in
alcuni dei vigneti studiati.
Parole chiave: Cixiidi, Hyalesthes obsoletus, Legno nero, Vite.
Cixiid presence and distribution in Lambrusco vineyards affected by Bois noir
Recently, in vineyards in the north-east of Italy, Bois noir (BN) has been
spreading, and in many Italian regions it is the prevalent vine phytoplasma-associated
disease (Bondavalli et al., 2005; Borgo et al., 2005). In addition to its natural vector
Hyalesthes obsoletus Signoret, the phytoplasma was found in other insects belonging
to the family Cixiidae Reptalus quinquecostatus (Dufour) and R. panzeri (Löw)
(Trivellone et al., 2006; Jovic et al., 2007). With their potential transmission capacity,
these insects might be involved in the epidemiology of grapevine yellows (Maixner,
2006). During 2007 to 2009, and from June to September, surveys were carried out
in 25 vineyards of cultivar Lambrusco to detect and identify the presence of possible
insect vectors of the BN phytoplasmas (stolbur group). The planthopper population
was monitored weekly, both inside and outside the vineyards, using sticky traps and
sweep nets on the herbaceous vegetation, and by “frappage” on the grapevines. The
captured insects were identified and analyzed with nested-PCR/RFLP analyses of the
16S ribosomal and tuf genes, to detect the presence of stolbur phytoplasmas. The
captured Cixiidae belonged to the genera Hyalesthes, Cixius and Reptalus. The most
abundant species were H. obsoletus (98% of 761 Hyalesthes sp. captured), Cixius
cunicularis L. (over 93% of 273 Cixius sp. captured) and R. panzeri (65% of 177
Reptalus sp. captured). Scattered specimens of H. luteipes Fieber, C. nervosus L., C.
caledonicus China and R. quinquecostatus were also identified. The sweep net was
the best tool to catch H. obsoletus and Reptalus spp. (over 97% and 78% of captured
individuals, respectively), whereas “frappage” was the best method for Cixius spp.
(64% of captured individuals). Most of the insects were captured at the vineyard
borders (95% Hyalesthes sp., 72% Reptalus sp. and 60% Cixius sp.). Molecular
analyses allowed us to verify the presence of the BN phytoplasma in H. obsoletus
(52%, on 58 sample tested), Cixius spp. (13.6%, on 66 sample tested), and Reptalus
spp. (15.6%, on 51 samples tested; both tuf-types I and II were identified. Of note,
12.1% of Cixius sp. tested was positive to 16SrI-B phytoplasmas (Aster yellows), that
was detected with increasing frequency in some of the surveyed vineyards.
Key words: Bois noir, Cixiids, Grapevine, Hyalesthes obsoletus.
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Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
Lavori citati/References
Bagnoli B., F. Pinzauti, V. Trivellone, 2005. Indagine preliminare sugli auchenorrinchi
potenziali vettori di Stolbur in un’area viticola del Lazio. Petria, 15(1/2), 5558.
Bondavalli R., L. Milanesi, G. Cavallini, A. Montermini, P. Mazio, P. Bortolotti, R.
Credi, V. Vicchi, A. Bertaccini, 2005. Osservazioni sul vettore del fitoplasma
del legno nero della vite, Hyalesthes obsoletus, in Emilia-Romagna. Petria,
15(1/2), 59-61.
Borgo M., E. Angelini, L. Filippin, S. Botti, C. Marzachì, P. Casati, F. Quaglino, A.
Zorloni, G. Albanese, R. La Rosa, M. Tessitori, G. Pasquini, A. Bertaccini,
2005. Monitoraggio dei giallumi della vite e caratterizzazione dei fitoplasmi
nell’ambito del progetto finalizzato “Gia.Vi” nel 2004. Petria, 15(1/2), 161164.
Jovic J., T. Cvrkovic, M. Mitrovic, S. Krnjajic, M.G Redinbaugh, C. Pratt, R.E.
Gingery, S.A. Hogenhout, I. Tosevski, 2007. Roles of stolbur phytoplasma
and Reptalus panzeri in the epidemiology of maize redness in Serbia.
European Journal of Plant Pathology, 118, 85-89.
Maixner M., 2006. Grapevine yellows – Current developments and unsolved
questions. Extended abstracts 15th ICVG Meeting, Stellenbosch, South
Africa, 3-7 April, 86-87.
Trivellone V., F. Pinzauti, B. Bagnoli, 2006. Indagine preliminare sugli auchenorrinchi
potenziali vettori di Stolbur in un’area viticola del Lazio. Redia, 88, 103-108.
739
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
Monitoraggio dei giallumi della vite in
Trentino
C. Cainelli, A. Gelmetti, R. Zasso, V. Gualandri, M. Bottura, G. Angeli
Fondazione Edmund Mach-Istituto Agrario di San Michele all’Adige - Centro
Trasferimento Tecnologico
Via E. Mach,1, I-38010 San Michele all’Adige (TN)
E-mail: [email protected]
Dal 2001 il Centro Trasferimento Tecnologico dell’Istituto Agrario di
San Michele all’Adige, ora Fondazione Edmund Mach, e l’Ufficio Fitosanitario
Provinciale, conducono un monitoraggio per verificare la presenza di Legno nero
(BN) e Flavescenza dorata (FD) mediante diagnosi molecolare su materiale vegetale
ed insetti vettori. Dall’inizio dell’indagine a oggi sono stati analizzati 2247 campioni
fogliari provenienti da tutte le aree viticole della provincia.
Le prime segnalazioni di piante sintomatiche risalgono alla metà degli
anni ottanta (Mescalchin et al., 1986). I controlli effettuati negli anni successivi
identificarono la fitoplasmosi BN pressoché in tutte le zone viticole della provincia,
soprattutto su Chardonnay, con incidenza molto variabile.
Nel 1988 è iniziata la ricerca del vettore di FD, lo Scaphoideus titanus Ball. È
stato trovato solo in Valsugana, dove si ipotizza siano state introdotte le uova mediante
materiale vivaistico proveniente dalla Francia (Dal Rì et al., 1991; Vindimian et al.,
1993). La diffusione della cicalina anche in altre zone della provincia è stata in seguito
confermata dalle segnalazioni dell’insetto in Vallagarina e nell’Alto Garda nel 2001
(Bisognin et al., 2002), anno in cui nelle stesse zone si verificarono i primi casi di FD.
Nel 2005, dopo diciassette anni di presenza del vettore, sono comparsi i primi casi di
FD anche in Bassa Valsugana, ai confini con il Veneto. Nello stesso anno è iniziato
il monitoraggio a livello provinciale di Hyalesthes obsoletus Signoret, vettore di BN,
tramite apposito retino entomologico, sulle principali piante ospiti che si trovavano
sia all’interno del vigneto sia su eventuali bordi presenti all’esterno (fossi, scoline,
capezzagne, ecc.). Le specie erbacee considerate sono state Urtica dioica, Artemisia
vulgaris, Convolvolus arvensis ed in qualche caso anche Rumex acetosa (Cainelli et
al., 2010).
Attualmente i giallumi della vite e i rispettivi insetti vettori sono presenti in
tutte le principali aree viticole del Trentino con distribuzione e incidenza altamente
differenziate tra le due fitoplasmosi. BN continua a confermarsi come la fitoplasmosi
più importante e diffusa, mentre FD rimane confinata da oltre cinque anni sempre negli
stessi comuni, anche se la presenza di S. titanus è stata rilevata su tutto il territorio
provinciale. Generalmente si controllano annualmente più di 400 vigneti.
La diffusione e l’evoluzione di BN, nei comuni indenni da FD, è monitorata
anche tramite la mappatura di vigneti. Le indagini sono effettuate mediante controlli
visivi in campo, eseguiti nel periodo di fine estate-inizio autunno, durante i quali
740
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
vengono segnate le posizioni delle piante sintomatiche e di quelle morte, delle
fallanze e delle piante sostituite. In questo modo le mappe redatte consentono di avere
una fotografia della situazione nel vigneto controllato per quanto riguarda il numero
e distribuzione delle piante sintomatiche, la percentuale delle piante malate rispetto
al totale e l’evoluzione della malattia negli anni. I vigneti mappati sono un centinaio,
comprendenti 55 vigneti storici (nei quali l’evoluzione della malattia è seguita da
molti anni) e 37 casuali (impianti scelti in maniera casuale ma rappresentativi del
territorio), per un totale di oltre 110.000 piante controllate. Nel corso del 2008 inoltre
sono stati elaborati dati ricavati da un lavoro di mappatura durato quasi vent’anni,
che hanno consentito di seguire l’evoluzione dell’incidenza dei giallumi della vite in
alcuni vigneti della Valsugana, dall’anno d’impianto ad oggi. Le indagini sono state
eseguite in due località, in sette impianti di Chardonnay allevati a pergola semplice
trentina, messi a dimora tra il 1989 e il 1991, nei quali la presenza di BN è accertata
dal 1990 (Gelmetti et al., 2002).
Parole chiave: Flavescenza dorata, Legno nero, Mappatura, Territorio, Vettori.
Monitoring of grapevine yellows in Trentino
Since 2001, the Technological Transfer Centre of Istituto Agrario di San Michele
all’Adige, now the Edmund Mach Foundation, and the Province Phytosanitary Office
have been carrying out monitoring to determine the presence of Bois noir (BN) and
Flavescence dorée (FD). This has followed by molecular analyses of plant materials
and insect vectors. From the start of this study to the present day, 2247 leaf samples
coming from all grapevine areas of the province have been analysed.
The first report of grapevine yellows symptomatic plants dates back to the
middle of the 1980s (Mescalchin et al., 1986). The inspections made in the following
years identified the BN disease in almost all grapevine areas of the province, with a
variable impact. The main cultivar affected by BN was Chardonnay.
In 1988 the search for the insect vector of FD, Scaphoideus titanus Ball,
started. It was only found in Valsugana, where its eggs were probably brought in with
French nursery material (Dal Rì et al., 1991; Vindimian et al., 1993). The diffusion of
the insect also in other areas of the province was afterwards confirmed by its presence
in Vallagarina and in Alto Garda in 2001 (Bisognin et al., 2002). In the same year,
the first plants affected by FD were found in these areas. In 2005, after seventeen
years of the presence of the insect vectors, the first cases of FD disease appeared also
in Bassa Valsugana, close to the border with Veneto. In the same year, a province
monitoring of Hyalesthes obsoletus Signoret, the insect vector of BN, was started with
insect sweep nets, on the main host plants placed both inside of vineyards and on their
outside edges. The herbaceous species taken into consideration were Urtica dioica,
Artemisia vulgaris, and Convolvolus arvensis, and in a few instances, also Rumex
acetosa (Cainelli et al., 2010).
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Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
Currently, the grapevine yellows and their insect vectors are present in all of
the main grapevine areas of Trentino, with different distributions and impacts of these
two phytoplasmoses. BN is still the most important and widespread, while FD has
been present for more than five years, always in the same municipal districts, even if
S. titanus has been detected on all of the provincial territory. Generally, more than 400
vineyards are being checked annually.
The diffusion and evolution of BN in the municipal districts undamaged by
FD has also been monitored by mapping of the vineyards. The detection was carried
out through visual inspections in the fields from late summer to early autumn, where
the location of symptomatic and dead plants, and the loss of replaced material in the
vineyards, were marked. In this way, the worded maps show a picture of the situation
in the controlled vineyard for the number and distribution of the symptomatic plants,
the percentage of diseased plants, and the evolution of the disease. The vineyards were
about 100, which included 55 historical ones (in this case the evolution of the disease
was supervised for many years) and 37 random ones (vineyards selected accidentally
but representative of the territory), for a total of over 110,000 plants controlled.
Furthermore, in 2008, the data from a 20-year mapping study were processed. These
allowed the evolution of the grapevine yellows impact in some vineyards of Valsugana
to be followed, from the year of plantation, to today. The detection was carried out in
two places, in seven plantations of Chardonnay that were trained on the pergola trellis
system and planted between 1989 and 1991. In these places, the presence of BN was
established from 1990 (Gelmetti et al., 2002).
Key words: Bois noir, Flavescence dorée, Mapping, Territory, Vector.
Lavori citati/References
Bisognin C., E. Mescalchin, M.S. Grando, 2002. Monitoraggio della diffusione dei
giallumi della vite in Trentino. In: Giornate Fitopatologiche. Baselga di Pinè,
TN, Italia, Aprile 7-11, 583-564.
Cainelli C., V. Gualandri, R. Zasso, P. Bragagna, D. Prodorutti, 2010. I giallumi
della vite: la diagnosi al servizio del territorio. Centro Trasferimento
Tecnologico – Rapporto 2009, 30-31.
Dal Ri M., E. Mescalchin, M.E. Vindimian, 1991. Il punto sulla Flavescenza dorata.
Terra Trentina, 6, 32-38.
Gelmetti A., E. Mescalchin, R. Zasso, M. Bottura, 2009. Giallumi nel vigneto
trentino, il Legno nero la fa da padrone. Informatore Agrario, 32, 56-60.
Mescalchin E., F. Michelotti, M.E. Vindimian, 1986. Riscontrata in alcuni vigneti del
Basso Sarca “Flavescenza dorata della vite”. Terra Trentina, 9, 36-38.
Vindimian M.E., E. Mescalchin, M. Dal Ri, M. Filippi, L. Delaiti, L. Capra, R. Lucin,
1993. Ulteriori conoscenze sulla Flavescenza dorata. Terra Trentina, 8, 22-27.
742
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
Distribuzione spaziale di viti affette da
flavescenza dorata
F. Pavan1, N. Mori2, W. Biasi3, C. Peratoner3
Dipartimento di Biologia e Protezione delle Piante, Università di Udine
Via delle Scienze, 208, I-33100 Udine
2
Dipartimento di Agronomia ambientale e Produzioni vegetali - Entomologia,
Università di Padova, Agripolis
Viale dell’Università, 16, I-35020 Legnaro (PD)
3
Progettonatura Studio Associato
Via Dante Alighieri, 8, I-31025 Santa Lucia di Piave (TV)
1
E-mail: [email protected]
La Flavescenza dorata della vite (FD) è una malattia causata da “Candidatus
Phytoplasma vitis” che viene trasmesso dalla cicalina Scaphoideus titanus Ball.
Nel caso di malattie associate a vettori alati la distribuzione spaziale delle piante
ammalate costituisce un indizio sulla sorgente dei vettori infetti (Gregory, 1968;
Weintraub e Beanland, 2006). Se i vettori acquisiscono l’agente causale da piante
presenti all’esterno degli appezzamenti coltivati ci si deve attendere una maggior
presenza della malattia sui bordi, mentre se lo acquisiscono all’interno degli stessi è
più probabile una distribuzione casuale. Nel caso del Legno nero della vite le piante
infette sono spesso distribuite casualmente all’interno degli appezzamenti quando la
pianta sorgente di inoculo è il convolvolo, mentre sono maggiormente concentrate sui
bordi se la pianta sorgente del fitoplasma è l’ortica (Maixner, 2006; Mori et al., 2008).
Ciò si verifica in quanto il convolvolo è frequente anche all’interno dei vigneti, mentre
l’ortica è spesso più diffusa all’esterno degli stessi.
Nel presente lavoro è stata studiata la distribuzione spaziale delle piante
infette da FD in otto vigneti, regolarmente trattati con insetticidi per il controllo di S.
titanus, utilizzando due diversi approcci: i) lo studio della distribuzione di frequenza
delle piante che hanno presentato sintomi almeno una volta nel corso del periodo
di indagine, considerando come unità di campionamento gruppi di 5 o 10 piante
rispettivamente per vigneti con meno o con più di 500 piante totali; le distribuzioni di
frequenza osservate sono state confrontate utilizzando il test del chi quadro con quelle
attese sulla base delle distribuzioni poissoniana e binomiale negativa; ii) la verifica
dell’esistenza di gradienti di FD nei vigneti; a tal fine è stata calcolata la percentuale di
piante infette nei diversi filari e in altrettante parcelle trasversali agli stessi e, quando i
dati suggerivano l’esistenza di gradienti decrescenti da un bordo, i gradienti osservati
sono stati confrontati con quelli previsti dalla legge di potenza.
I risultati ottenuti si possono così riassumere: i) la distribuzione della frequenza
poissoniana è stata accettata in tre casi su 8, mentre quella binomiale negativa in 6 casi;
ii) in tre vigneti sono stati osservati significativi gradienti decrescenti della malattia
a partire da un bordo; nel primo caso il gradiente decrescente partiva dal filare che
743
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
confinava con una siepe con viti inselvatichite infestate da S. titanus; nel secondo caso
il gradiente decrescente partiva da un filare che distava circa 30 m da un vigneto non
trattato con insetticidi e con oltre il 50% di piante infette; nel terzo caso il gradiente
decrescente partiva da un filare separato attraverso un fosso da un altro vigneto di
cui non si hanno informazione né relativamente alla conduzione fitosanitaria né per
quanto concerne la presenza di FD. La ricerca suggerisce che le fonti esterne di S.
titanus infetti possono avere un ruolo importante nella diffusione di FD.
Parole chiave: Effetto bordo, Fitoplasmosi, Giallumi della vite, Scaphoideus titanus.
Spatial distribution of grapevine affected by Flavescence dorée
Flavescence dorée (FD) is a grapevine disease that is caused by “Candidatus
Phytoplasma vitis”, which is transmitted by the leafhopper Scaphoideus titanus Ball.
With reference to diseases associated with winged vectors, the spatial distribution
of diseased plants can provide cues relating to the vector source (Gregory, 1968;
Weintraub and Beanland, 2006). If the vectors acquired the causal agent of the disease
from plants present outside of the cultivated plots, a higher aggregation of diseased
plants at the borders of the cultivated plots would be more likely to be expected,
whereas if the source plants are inside the cultivated plots, a randomized distribution
of diseased plants is more probable. In the case of the phytoplasmosis Bois noir of
the grapevine, infected grapevines are often scattered over the whole vineyard if
Convolvulus arvensis is the source of inoculum, whereas they are often concentrated
at the borders if the source of inoculum is Urtica dioica (Maixner, 2006; Mori et al.,
2008). This occurs because C. arvensis is common also within vineyards, whereas U.
dioica more frequently grows outside the vineyards.
In this study, the spatial distribution of the grapevines affected by FD was
studied in eight vineyards treated with insecticides against S. titanus, using two different
approaches: i) the frequency distribution of the plants showing symptoms at least once
during the sampling years, considering groups of five or ten plants as the sampling
unit, for vineyards with less than and more than 500 grapevines, respectively. The
observed frequency distributions were compared using the chi square test, with the
expected ones carried out on the basis of Poisson and negative binomial distributions;
ii) the occurrence of an FD gradient across the vineyards. To this end, the percentages
of diseased plants in the different rows and in an equal number of plots across the rows
were calculated, and when the data suggested a decreasing gradient from a border,
the observed disease gradients were compared with those predicted by a power-law
model.
The results can be summarized as follows: i) in three and six vineyards out of
eight, the Poisson and negative binomial distributions were respectively accepted; ii)
in three vineyards, a significant decreasing gradient from a border row was observed.
In the first case, the border row was close to a hedgerow with grapevines growing
744
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
wild and it was infested by S. titanus; in the second case, the border row was 30
m away from a vineyard that was not treated with insecticides and that showed a
percentage of infected grapevines greater than 50%. In the third case, the border row
was separated by a ditch from a vineyard on which information was not available. The
study suggested that external sources of infected S. titanus can have an important role
in the epidemiology of FD.
Key words: Border effect, Grapevine yellows, Phytoplasmoses, Scaphoideus titanus.
Ringraziamenti/Acknowledgements
Lavoro in parte svolto nell’ambito del P.F. Gia.Vi “I giallumi della vite: un
fattore limitante le produzioni vitivinicole” finanziato dal Ministero delle Politiche
Agricole Alimentari e Forestali.
Lavori citati/References
Gregory P.H., 1968. Interpreting plant disease dispersal gradients. Annual Review of
Phytopathology, 6, 189-212.
Maixner M., 2006. Grapevine yellows – Current developments and unsolved
questions. Extended abstracts of the 15th meeting of the International Council
for the Study of Virus and Virus-like Diseases of the Grapevine (ICVG),
Stellenbosch, South Africa, April 3-7, 86-87.
Mori N., F. Pavan, R. Bondavalli, N. Reggiani, S. Paltrinieri, A. Bertaccini, 2008.
Factors affecting the spread of “Bois noir” disease in north Italy vineyards.
Vitis, 47(1), 65-72.
Weintraub P.G., L. Beanland, 2006. Insect vectors of phytoplasmas. Annual Review
of Entomology, 51, 91-111.
745
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
RISPOSTE OLFATTIVE DI ADULTI DI HYALESTHES
OBSOLETUS AI COMPOSTI VOLATILI DI ALCUNE PIANTE
OSPITI
P. Riolo1, R.L. Minuz1, G. Anfora2, M.V. Rossi Stacconi3, N. Isidoro1, R. Romani3
Dipartimento di Scienze Ambientali e delle Produzioni Vegetali, Università
Politecnica delle Marche
Via Brecce Bianche, I-60131 Ancona
2
Fondazione E. Mach (FEM)
Via E. Mach, 1, I-38010 S. Michele all’Adige (TN)
3
Dipartimento di Scienze Agrarie e Ambientali - Entomologia, Università degli Studi
di Perugia
Borgo XX Giugno, 74, I-06121 Perugia
1
E-mail: [email protected]
Hyalesthes obsoletus Signoret (Hemiptera: Fulgoromorpha: Cixiidae) è
il vettore naturale del fitoplasma dello stolbur (sottogruppo 16SrXII-A) agente
causale del Legno nero (LN) della vite. Il LN è il giallume della vite più diffuso in
Europa e nel bacino del Mediterraneo, e può causare gravi perdite economiche per
questa coltura. Le caratteristiche genetiche, fisiche, metaboliche, comportamentali e
sensoriali dell’insetto sono i vincoli per la scelta delle piante ospiti (Visser, 1986). Nel
caso di H. obsoletus questa scelta avviene allo stadio adulto, mentre gli stadi larvali si
sviluppano sugli apparati radicali delle piante ospiti.
La vite (Vitis vinifera L.) rappresenta solo un ospite accidentale per l’insetto,
mentre l’intero ciclo vitale viene svolto su diverse specie di piante a seconda dell’area
geografica. Gli ospiti primari sono: convolvolo (Convolvulus arvensis L.), vilucchione
(Calystegia sepium L.) e ranuncolo (Ranunculus spp.) in Nord Europa, ortica (Urtica
dioica L.) in Italia e agnocasto (Vitex agnus-castus L.) in Israele (Alma et al., 1987;
Maixner et al., 1995; Sforza et al., 1998, 1999; Sharon et al., 2005).
In questo lavoro sono stati eseguiti studi comportamentali, morfologici ed
elettrofisiologici per approfondire le conoscenze sul ruolo svolto dai composti volatili
nel processo di localizzazione delle piante ospiti da parte di H. obsoletus.
I test comportamentali sono stati condotti in un olfattometro a due vie. Le
piante ospiti analizzate sono state: U. dioica, C. arvensis, C. sepium, V. agnus-castus
e V. vinifera. Per ogni sorgente odorosa (stimolo vs bianco) sono stati osservati
singolarmente 60 maschi e 60 femmine. Le femmine sono state significativamente
attratte dall’ortica, mentre i maschi dall’agnocasto. Indagini ultrastrutturali delle
antenne hanno evidenziato la presenza di almeno due tipologie di sensilli olfattivi
posizionati a livello del pedicello. Il primo tipo è rappresentato da strutture complesse
conosciute in letteratura come “plaque organs”, innervate da diverse decine di neuroni
sensoriali. Il secondo tipo è costituito da sensilli tricoidei innervati ciascuno da 2
neuroni sensoriali. Sono state effettuate estrazioni in flusso d’aria delle sostanze
746
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
volatili emesse da ortica e agnocasto, e gli estratti sono stati analizzati mediante gascromatografia abbinata sia ad elettroantennografia (GC-EAD) che a spettrometria
di massa (GC-MS). Sono stati identificati composti volatili in grado di indurre
significative risposte elettrofisiologiche sulle antenne di entrambe i sessi del ciixide.
La conoscenza di tali molecole e dei meccanismi comportamentali coinvolti nel
riconoscimento dell’ospite vegetale costituiscono un punto cruciale per la messa a
punto di nuove strategie di monitoraggio e di controllo di H. obsoletus.
Parole chiave: GC-EAD, Olfattometro, Percezione olfattiva, Sostanze volatili,
Vettore Legno nero.
Olfactory responses of Hyalesthes obsoletus adults to host plant
volatile compounds
Hyalesthes obsoletus Signoret (Hemiptera: Auchenorrhyncha: Cixiidae) is a
palearctic planthopper, and it is responsible for transmission of stolbur phytoplasma
(16SrXII-A subgroup), the causal agent of the grapevine (Vitis vinifera L.) yellows
(GY) known as Bois noir (BN). BN is the most widespread GY in Europe and the
Mediterranean basin, and it can cause severe loss of production in viticulture. The
genetic, physical, metabolic and sensory capacities of the insect are the constraints of
its host plant choice (Visser, 1986). In the case of H. obsoletus, this choice is made
at the adult stage, while the larvae feed and develop on the root systems of the host
plants.
Grapevine represents only an accidental host for this planthopper, and its
whole life-cycle can occur on different plants, depending on the geographic region.
The primary plant hosts on which H. obsoletus completes its whole life cycle are:
Convolvulus arvensis L. (field bindweed), Calystegia sepium L. (hedge bindweed),
Ranunculus spp. (crowfoot) in northern Europe, while in Italy they include Urtica
dioica L. (nettle) and in Israel, Vitex agnus-castus (chaste tree) (Alma et al., 1987;
Maixner et al., 1995; Sforza et al., 1998, 1999; Sharon et al., 2005). In the present
study, behavioural, morphological and electrophysiological analysis were carried out
to deepen our knowledge of the role of volatile organic compounds in H. obsoletus
host-plant recognition.
Bioassays were performed using a Y-olfactometer, with test on the following
plants: nettle, bindweed, hedge bindweed, chaste tree and grapevine. For each
trial (stimulus vs blank), 60 males and 60 females were observed individually. The
results show a significant attraction of females to nettle and of males to chaste tree.
Ultrastructural observations of the antennae revealed at least two olfactory sensilla
typologies at the level of the pedicel. The first is composed of complex structures
that are known as “plaque organs”, which are innervated by several tens of sensory
neurons. The second typology is represented by the trichoid sensilla, each of which
is innervated by two sensory neurons. Headspace collections were made from
747
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
nettle and chaste tree fresh shoots, and the extracts were analyzed by coupling gaschromatography with both electroantennography (GC-EAD) and mass spectrometry
(GC-MS). Volatile organic compounds (VOCs) were identified, and some of them
were shown to elicit significant electrophysiological responses on male and female
antennae. The identification of these biologically active compounds and the study
of the behavioural mechanisms involved in host recognition are of fundamental
importance for the development of new potential strategies for the monitoring and
control of H. obsoletus.
Key words: Bois noir vector, GC-EAD, Olfactometer, Olfactory perception, VOCs.
Ringraziamenti/Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dal MIUR, PRIN 2007 “Ruolo dei composti
volatili organici emessi dalle piante nel comportamento di ricerca dell’ospite del
vettore del “Bois noir”, Hyalesthes obsoletus Signoret (Hemiptera: Cixiidae)”.
Lavori citati/References
Alma A., C. Arnò, A. Arzone, C. Vivano, 1987. New biological reports on
Auchenorrhyncha in vineyards. In: Proceedings of 6th Auchenorrhyncha
Meeting. Turin, Italy, September 7-11, 509-516.
Maixner M., U. Ahrens, E. Seemüller, 1995. Detection of the German grapevine
yellows MLO in grapevine, alternative hosts and a vector by a specific PCR
procedure. European Journal of Plant Pathology, 101, 241-250.
Sforza R., D. Clair, X. Daire, J. Larrue, E. Boudon-Padieu, 1998. The role of
Hyalesthes obsoletus (Hemiptera: Cixiidae) in the occurrence of Bois noir of
grapevines in France. Journal of Phytopathology, 146, 549-556.
Sforza R., T. Bourgoin, S.W. Wilson, E. Boudon-Padieu, 1999. Field observations,
laboratory rearing and descriptions of immatures of the planthopper Hyalesthes
obsoletus (Hemiptera: Cixiidae). European Journal of Entomology, 96, 409418.
Sharon R., V. Soroker, S.D. Wesley, T. Zahavi, A. Harari, P.G. Weintraub, 2005.
Vitex agnus-castus is a preferred host plant for Hyalesthes obsoletus. Journal
of Chemical Ecology, 31, 1051-1063.
Visser J.H., 1986. Host odour perception in phytophagous insects. Annual Review of
Entomology, 31, 121-144.
748
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
Ruolo dei portinnesti nella trasmissione di
Legno nero: risultati preliminari
A. Zorloni1, F. Quaglino1, N. Mori2, G. Zanini3, P.A. Bianco1
Dipartimento di Produzione Vegetale, Sezione Patologia Vegetale,
Università degli Studi di Milano
Via Celoria, 2, I-20133 Milano
2
Agrea Centro Studi
Via Garibaldi, 5, I-37057 San Giovanni Lupatoto (VR)
3
Unità Periferica per i Servizi Fitosanitari, Regione Veneto
Viale dell’Agricoltura, 1/a, I-37060 Buttapietra (VR)
1
E-mail: [email protected]
Il Legno nero della vite (LN) è stato segnalato in Veneto per la prima volta
nel 1983 (Egger e Borgo, 1983), e da allora è in continua espansione in tutte le aree
del nord-est Italia (Bondavalli et al., 2005; Borgo et al., 2005; Barba et al., 2006;
Sancassani et al., 2007) interessando sia i vigneti per la produzione di uve da vino sia
i campi di piante madri per marza e portainnesto.
A tale riguardo, nell’ambito di un progetto di ricerca triennale promosso
dalla Regione Veneto, “Prevenzione e contenimento del Legno nero della vite
nella Regione Veneto”, sono state svolte indagini sul possibile ruolo del materiale
di propagazione nella diffusione di questa fitoplasmosi. Per determinare quale
ruolo abbiano i differenti portainnesti nella trasmisione di LN, sono state allestite
alcune prove in cui una marza, costituita da materiale prelevato da viti Chardonnay
infette dal fitoplasma dello Stolbur veniva sovrainnestata con una marza prelevata
da un portainnesto precedentemente innestato a gemma utilizzando, in questo caso,
viti di Chardonnay sane. In particolare, sono state effettuate analisi molecolari per
determinare l’eventuale presenza dei fitoplasmi del gruppo dello Stolbur sia nelle viti
di Chardonnay sintomatiche, prelevate in vigneti situati nella provincia di Verona, sia
in quelle asintomatiche oltre che nei portainnesti. Sono stati utilizzati nella prova tre
differenti portainnesti, Kober 5BB, SO4 e 420A, tra i più diffusi nell’area di studio. In
tutto sono state innestate 1175 piante: 385 nel 2009 (189 con K5BB, 105 con SO4 e 91
con 420A) e 790 nel 2010 (205 con K5BB, 300 con SO4 e 285 con 420A). Il doppio
innesto è stato eseguito da vivaisti viticoli specializzati, con innestatrice da banco a
omega. Le viti innestate, di seguito chiamate “trionti”, sono state quindi sottoposte a
forzatura, invasate e messe in ambiente controllato (screen-house) a prova di insetto.
La percentuale di germogliamento dei trionti ottenuti è stata molto bassa:
nel primo anno, le barbatelle attecchite e germogliate sono state 59 su 385 (pari al
15,3%); nel secondo anno, 125 su 790 (15,8%). I risultati ottenuti dai rilevamenti
sintomatologici, effettuati a settembre 2009 su 59 trionti, evidenziano una sola pianta,
in cui è stato impiegato il portainnesto SO4, in cui sono presenti accartocciamenti
749
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
fogliari e ingiallimenti sul germoglio sviluppatosi dalla gemma di Chardonnay sano.
Tale risultato indica che i fitoplasmi si sono diffusi dalla marza di Chardonnay infetta,
utilizzata in questo caso come portainnesto, attraverso l’ibrido SO4, fino a raggiungere
il germoglio sano. Il lavoro fin qui condotto verrà concluso con le osservazioni dei
nuovi trionti ottenuti nel 2010 e con le analisi molecolari condotte su campioni fogliari
prelevati da tutte le 184 barbatelle, conservate in screen-house, al fine di verificare i
risultati delle osservazioni sintomatologiche.
Parole chiave: Fitoplasmi, Trionte, Vivaismo viticolo.
The role of rootstocks in Bois noir transmission: preliminary results
Grapevine Bois noir (BN) was first reported in the Veneto region in 1983 (Egger
and Borgo, 1983), and is has expanding across the vineyards of all of north-eastern
Italy (Bondavalli et al., 2005; Borgo et al., 2005; Barba et al., 2006; Sancassani et al,
2007), including the mother-plant vineyards.
A three-year research project entitled “Prevention and control of grapevine
Bois noir in the Veneto Region”, and supported by the Regione Veneto, promotes
the study of the role of rootstock in transmission of phytoplasma to the scion. To
understand the role of different rootstock in BN transmission, a double grafted cutting
was created, known as “trionti”, which comprises a BN-infected Chardonnay cane
as the inoculum source at the bottom, and a healthy Chardonnay bud grafted on to
a healthy rootstock at the top. Molecular analyses were performed on symptomatic
Chardonnay plants identified in vineyards near Verona, on symptomless Chardonnay
plants, and on rootstock used in the experiments. Three different rootstocks were used:
Kober 5BB, SO4 and 420A. In total, 1,175 trionti have been grafted: 385 in 2009 (189
with K5BB, 105 with SO4, and 91 with 420A), and 790 in 2010 (205 with K5BB, 300
with SO4, and 285 with 420A). These double grafts have been carried out at nurseries
in the Veneto region with a bench omega-type grafting machine. The grafted cuttings
have been forced and potted, and they are maintained in a screen-house protected
from phytoplasma vectors.
The sprouting percentages recorded have been very low: in the first year, 59
out of 385 rooted cuttings sprouted (15.3%); and in the second year, 125 out of 790
(15.8%). Leaf yellowing and rolling was seen in September 2009, on the originally
healthy Chardonnay sprout of one out of the first 59 vines, which was grafted onto
SO4, suggesting the translocation of the phytoplasma from the infected cane to the
healthy bud, through the rootstock. Visual analysis will be repeated in September
2010, including on the 125 trionti from 2010. Moreover, molecular analyses will be
performed on leaf samples collected from all of the 184 trionti maintained under the
750
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
screen-house, to validate the visual analyses and reveal if there are phytoplasmas in
the apical sprouts, even in absence of symptoms.
Key words: Grapevine nursery, Phytoplasma, Trionte.
Lavori citati/References
Barba M., L. Ferretti, G. Pasquini, 2006. I giallumi della vite: un problema
fitosanitario di rilevanza nazionale. Informatore fitopatologico, 4, 4-8.
Bondavalli R., L. Milanesi, G. Cavallini, A. Montermini, P. Mazio, P. Bortolotti, R.
Credi, V. Vicchi, A. Bertaccini, 2005. Osservazioni sul vettore del fitoplasma
del Legno nero della vite, Hyalesthes obsoletus, in Emilia-Romagna. Petria,
15(1/2), 73-75.
Borgo M., Angelini E., Filippin L., Botti S., Marzachì C., Casati P., Quaglino F.,
Zorloni A., Albanese G., La Rosa R., Tessitori M., Pasquini G., Bertaccini
A., 2005. Monitoraggio dei giallumi della vite e caratterizzazione dei
fitoplasmi nell’ambito del progetto finalizzato “Gia.Vi” nel 2004. Petria,
15(1/2), 161-164.
Egger E., M. Borgo, 1983. Diffusione di una malattia virus-simile su Chardonnay ed
altre cultivar nel Veneto. L’Informatore Agrario, 16, 25547-25556.
Sancassani G.P., F. Dal Molin, N. Mori, A. Bertaccini, 2007. Flavescenza dorata
stabile e Legno nero in crescita. L’Informatore Agrario, 63(14), 78-80.
751
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
SUSCETTIBILITA’ AL LEGNO NERO DI ALCUNE VARIETA’
DI VITE ALLEVATE NELLE MARCHE
S. Murolo, M. Piergiacomi, G. Romanazzi
Dipartimento di Scienze Ambientali e delle Produzioni Vegetali,
Università Politecnica delle Marche
Via Brecce Bianche, I-60131 Ancona
E-mail: [email protected]
La vite (Vitis vinifera L.) è la coltura arborea principale delle Marche, con
circa 20.000 ha di superficie investita, per la metà iscritta negli albi dei vigneti per la
produzione dei vini a Denominazione di Origine (DOC e DOCG). Esiste un’ampia
variabilità genetica, con almeno 206 varietà censite, tra varietà di interesse nazionale,
internazionale e locale, e per queste ultime è in atto un’opera di continuo recupero
e di valorizzazione (Romanazzi et al., 2006). Accanto alle varietà locali, è sempre
più diffuso il ricorso a vitigni tipici di altri areali, al fine di testarne l’adattabilità
all’ambiente pedoclimatico marchigiano. Negli ultimi decenni, si è assistito ad una
rapida diffusione del Legno nero in Italia, giallume della vite indotto da fitoplasmi
appartenenti al sottogruppo 16Sr XII-A, che, insieme alla Flavescenza dorata,
costituisce un problema di rilevanza nazionale (Barba et al., 2006). Tali malattie
non sono di facile gestione in campo (Romanazzi et al., 2009), pertanto una delle
possibilità, a parità di caratteristiche agronomiche, potrebbe consistere nel puntare
su varietà che appaiono più resistenti alla malattia, in quanto in condizioni di campo
mostrano un livello di infezione più limitato. E’ noto che alcune varietà si sono
dimostrate maggiormente suscettibili fin dalla prima comparsa dei giallumi in Italia, a
differenza di altre che hanno mostrato una certa resistenza (Angelini e Borgo, 2002).
Risulta comunque difficile stilare una graduatoria di suscettibilità varietale perché la
gravità dei sintomi può essere diversamente influenzata dalle tecniche agronomiche,
dalle condizioni pedoclimatiche e dallo stato sanitario iniziale del materiale di
propagazione.
Scopo del presente lavoro è stato quello di valutare la diversa suscettibilità
varietale nelle condizioni pedoclimatiche della regione Marche di una serie di varietà
di vite tipiche di altri areali allevate in un vigneto sperimentale. Inoltre sono state
condotte indagini a campione per verificare l’agente eziologico della malattia.
Le osservazioni sono state condotte da luglio a settembre 2008 nel campo
sperimentale dell’Azienda Santa Casa di Loreto, ubicata in contrada Chiarino, a
Recanati (MC). La collezione è costituita da sei varietà (Chardonnay, Pinot bianco,
Sauvignon, Falanghina, Aglianico e Primitivo) costituite ognuna da circa 700 viti,
innestate sul portainnesto SO4. Inoltre, il suolo viene gestito con inerbimento
naturalmente permanente.
Dalle valutazioni visive le piante che mostravano tipici sintomi ascrivibili
752
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
ad infezioni da fitoplasmi sono state individuate in campo e riportate su una mappa
bidimensionale, mentre i casi dubbi sono stati sottoposti ad analisi molecolare. Nella
piattaforma ampelografica esaminata è stata osservata, anche se in presenza di una
incidenza di piante sintomatiche relativamente bassa, una diversa suscettibilità
varietale. Il vitigno in cui sono state riscontrate più piante sintomatiche è risultato
Chardonnay (6%), seguito da Falanghina e Sauvignon (circa 1,5%). Le varietà
Primitivo, Aglianico e Pinot bianco hanno mostrato solo sporadiche piante con sintomi
di giallumi. Le analisi molecolari hanno confermato la presenza del fitoplasma dello
stolbur (sottogruppo 16SrXII-A), agente di Legno nero, in tutti i campioni saggiati.
Parole chiave: Chardonnay, Stolbur, Vitis vinifera.
Sensitivity to Bois noir of some grapevine cultivars grown in the Marche region
Grapevine (Vitis vinifera L.) is the main crop in Marche region, with about
20,000 ha of cultivated area, half of which is included in the list of vineyards for the
production of wine with the protected Denomination of Origin (DOC and DOCG). The
wide genetic variability is seen by the 206 assessed varieties among the cultivars of
national, international and local interest. For the last ones, collection and valorisation
are in progress (Romanazzi et al., 2006). However, the use of grapevine cultivars
typical of other environments is also increasing, to determine their adaptability to the
Marche pedoclimatic conditions. Over the last decade, Italy has seen the fast spread of
Bois noir (BN), a grapevine yellows that is induced by phytoplasma belonging to the
16Sr XII-A subgroup, which along with Flavescence dorée, represents a phytosanitary
problem of national relevance (Barba et al., 2006). These diseases are not easily
managed in the field (Romanazzi et al., 2009), hence one opportunity under these
agronomic conditions might be realised by using more resistant BN cultivars that
under field conditions show limited infection levels. It is known that some cultivars
have appeared to be more sensitive since the first outbreak of grapevine yellows
in Italy, as opposed to others that have shown to be more resistant (Angelini and
Borgo, 2002). However, creating a list of varietal susceptibilities is difficult, because
symptom severity can be affected by agronomic techniques, pedoclimatic conditions
and the initial sanitary status of the propagating materials.
The aim of this study was to evaluate in a experimental vineyard under the
pedoclimatic conditions of Marche region the different varietal susceptibilities of
some cultivars that are typical of other environmental growth conditions. Moreover,
molecular detection and characterization was carried out to determine the causal
agents of the disease.
The visual inspections were carried out from July to September, 2008, in
the experimental fields of Santa Casa di Loreto, located in Chiarino, Recanati (MC).
The collection is constituted of six cultivars (Chardonnay, Pinot bianco, Sauvignon,
Falanghina, Aglianico and Primitivo), with about 700 vines for each variety grafted
753
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
onto SO4 rootstock. The soil has been managed with natural permanent grass.
From the visual evaluation, the vines that showed typical symptoms induced
by phytoplasma were labelled and recorded on a bidimensional map. Samples from
the plants with non-specific symptoms were collected and analyzed by molecular tools
for the detection of phytoplasma. In the ampelographic platform, the different varietal
susceptibilities were recorded, even though there were a relatively low number of
symptomatic plants. Chardonnay is the cultivar in which the highest number of
symptomatic plants was recorded (6%), followed by Falanghina and Sauvignon (about
1.5%). Primitivo, Aglianico and Pinot bianco showed only sporadic symptomatic
plants. Molecular analyses have confirmed the infection of phytoplasma associated to
stolbur (16Sr XII-A), the agent of BN, in all of the leaf samples.
Key words: Chardonnay, Stolbur, Vitis vinifera.
Ringraziamenti/Acknowledgements
Si ringraziano il Dott. P. Biondini e l’Azienda Santa Casa di Loreto per la
disponibilità mostrata nella conduzione delle indagini.
Lavori citati/References
Angelini E., M. Borgo, 2002. Diffusione della Flavescenza dorata della vite in Italia e
relazioni con vitigni, pratiche agronomiche e materiali di propagazione. Atti
Giornate Fitopatologiche, 1, 35-49.
Barba M., L. Ferretti, G. Pasquini, 2006. I giallumi della vite: un problema
fitosanitario di rilevanza nazionale. Informatore Fitopatologico, 4, 4-8.
Romanazzi G., S. Murolo, P. La Notte, S. Virgili, O. Silvestroni, V. Savino, 2006.
Miglioramento sanitario di vitigni autoctoni minori nelle Marche. Atti
Convegno Nazionale “I vitigni autoctoni minori: aspetti tecnici, normativi e
commerciali” - Torino, pp. 4.
Romanazzi G., R. Musetti, C. Marzachì, P. Casati, 2009. Induction of resistance in
the control of phytoplasma diseases. Petria, 19, 113-119.
754
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
FOTOSINTESI E TRASPIRAZIONE: DUE PROCESSI
METABOLICI PROFONDAMENTE MODIFICATI IN VITI
INFETTE DA LEGNO NERO
S.T. Endeshaw, S. Murolo, G. Romanazzi, D. Neri
Dipartimento di Scienze Ambientali e delle Produzioni Vegetali,
Università Politecnica delle Marche
Via Brecce Bianche, I-60131 Ancona
E-mail: [email protected]
Il fitoplasma associato al Legno nero della vite (stolbur, sottogruppo 16SrXII-A)
è causa di importanti perdite economiche per i viticoltori in quanto induce riduzione
della crescita, alterazione cromatica delle foglie accompagnata da arrotolamento dei
lembi fogliari e disseccamento parziale o totale dei grappoli (Maixner, 2006). Tali
sintomi riflettono profonde modificazioni dei processi fisiologici e biochimici, in
particolare dell’efficienza fotosintetica e del metabolismo degli zuccheri (Bertamini
e Nedumchezhian, 2001). Dal momento che la fotosintesi insieme alla traspirazione
rappresentano processi chiave del ciclo vitale delle piante, monitorando questi è
possibile acquisire utili informazioni sullo stato fisiopatologico e sulla risposta della
pianta a stress biotici e abiotici nel corso della stagione (Bertamini e Nedumchezhian,
2001; Silvestroni et al., 2004; Christen et al., 2007; Murolo et al., 2009).
Scopo del presente lavoro è stato quello di indagare l’effetto che il fitoplasma
associato a LN determina sui principali pathway metabolici della vite nel corso della
stagione vegetativa.
La prova è stata condotta nel 2009 presso un vigneto commerciale cv
Chardonnay, ubicato in agro di Osimo (AN), in cui sono state individuate, 4 viti
asintomatiche ed altrettante piante che, nel 2008, erano risultate infette da LN in
base alla diagnosi molecolare. Su tali piante sono stati misurati, da luglio a settembre
2009, la fotosintesi netta, la conduttanza stomatica e la traspirazione, utilizzando un
misuratore portatile di scambi gassosi, dalle 7 alle 10 e dalle 13 alle 16, in modo da
evitare la foto-inibizione dell’apparato fotosintetico. La fluorescenza della clorofilla
a è stata quantificata sulle foglie cartellinate usando un fluorimetro portatile. Nelle
foglie sintomatiche, è stata registrata una progressiva riduzione della fotosintesi netta
(dal 64 all’84%) passando da luglio a settembre. Lo stesso trend è stato verificato
per la conduttanza stomatica (-73%) e, conseguentemente, per la traspirazione
(-80%) nelle piante sintomatiche rispetto alle viti testimone. Il generale turbamento
dei principali processi metabolici indotti da infezioni di LN su Chardonnay, varietà
altamente suscettibile alla malattia, ha determinato una riduzione di circa il 70% della
produzione. I parametri qualitativi, in particolare contenuto zuccherino e grado Brix
del mosto, sono risultati essere influenzati negativamente dalle infezioni di LN.
Parole chiave: Fitoplasmi, Fluorescenza della clorofilla, Fotosintesi netta, Vitis
vinifera.
755
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
Photosynthesis and transpiration: two metabolic pathways profoundly changed in
grapevine affected by Bois noir
Phytoplasma associated to grapevine Bois noir (BN, caused by stolbur, subgroup
16SrXII-A) is responsible for severe economical losses for grape growers, because it
induces growth reduction, leaf discoloration, downward leaf rolling, and shriveling of
the bunches of grapes (Maixner, 2006). These symptoms generally reflect profound
modifications of physiological and biochemical processes, with particular regard to
photosynthesis efficiency and sugar metabolism (Bertamini and Nedumchezhian,
2001). As photosynthesis and transpiration represent key processes in the biological
cycle of plants, by monitoring these it is possible to acquire useful information on the
grapevine physio-pathological status and on its reactions to biotic and abiotic stress
through the season (Bertamini and Nedumchezhian, 2001; Silvestroni et al., 2004;
Christen et al., 2007; Murolo et al., 2009).
The aim of the present study was to investigate the effects on the main
physiological pathways through the season of BN infection in grapevine.
This trial was carried out during 2009 in a Chardonnay vineyard located
near Osimo (AN), where four healthy and symptomatic grapevines were selected
based on the results of molecular analyses performed in 2008. For each plant, net
photosynthesis, stomatal conductance and transpiration were monitored from July to
September, 2009, using a portable infrared gas analysis system. The readings were
taken between 7:00 am and 10:00 am and between 1:00 pm and 4:00 pm, before and
after the estimated ‘midday depression’, to limit photoinhibition of the photosynthetic
apparatus. Chlorophyll a fluorescence was quantified on selected leaves using a
chlorophyll fluorometer. In the symptomatic leaves, as compared to healthy leaves,
an increasing reduction of net photosynthesis was recorded from July to September
(from 64% to 84% reduction). A similar trend was seen for stomatal conductance (up
to a 73% reduction), and consequently for transpiration (up to an 80% reduction). The
general perturbation of the main metabolic processes induced by BN infection on the
highly susceptible cultivar Chardonnay caused a reduction in the yield of about 70%.
As well as the qualitative parameters, in particular the sugar content and the °Brix of
the grape juice were also negatively affected by BN infection.
Key words: Chlorophyll fluorescence, Net photosynthesis, Phytoplasma, Vitis
vinifera.
Ringraziamenti/Acknowledgements
Lavoro svolto nell’ambito del Progetto “Valutazione dell’efficacia di trattamenti
con elicitori nell’induzione del recovery in viti infette da fitoplasmi e monitoraggio
dell’attività enzimatica nelle piante (acronimo Varenne)” svolto nell’ambito del bando
2007 nel campo dell’Ambiente promosso dalla Fondazione Cariverona.
756
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
Lavori citati/References
Bertamini M., N. Nedunchezhian, 2001. Effect of phytoplasma [stolbur-subgroup
(Bios noir-BN)] on photosynthesis pigments, saccharides, ribulose-1,5bisphosphat carboxylase, nitrate and nitrite reductase, and photosynthetic
activities in the field-grown grapevine (Vitis vinifera L.cv. Chardonnay)
leaves. Photosynthetica, 39, 119-122.
Christen D., S. Schonmann, M. Jermini, R.J. Strasser, G. Defago, 2007.
Characterization and early detection of grapevine (Vitis vinifera) stress
responses to esca disease by in situ chlorophyll fluorescence and comparison
with drought stress. Environmental and Experimental Botany, 60, 504-514.
Maixner M., 2006. Grapevine yellows – Current developments and unsolved
questions. In: Extended Abstracts 15th Meeting of the International Council
for the Study of Virus and Virus-like Diseases of the Grapevine (ICVG).
Stellenbosch, South Africa, April 3-7, 2006, pp. 86-88.
Murolo S., G. Romanazzi, D. Neri, 2009. Photosynthesis and transpiration in
grapevines affected by Bois noir and recovered. In: Extended abstracts 16th
Meeting of the International Council for the Study of Virus and Virus-like
Diseases of the Grapevine (ICVG). Dijon, France, 31 August - 4 September,
pp. 193-194.
Silvestroni O., S. Mattioli, E. Manni, D. Neri, P. Sabbatini, A. Palliotti, 2004.
Seasonal dry matter production in field-grown Sangiovese and Montepulciano
grapevines (Vitis vinifera L.). Acta Horticulturae, 640, 127-133.
757
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
Induzione genica ed enzimatica di proteine
associate a meccanismi di difesa in vitI CON
SINTOMI DI Legno nero e recovered
L. Landi, G. Romanazzi
Dipartimento di Scienze Ambientali e delle Produzioni Vegetali, Sezione Protezione
delle Piante
Università Politecnica delle Marche
Via Brecce Bianche, I-60131 Ancona
E-mail: [email protected]
Il legno nero (LN), causato da fitoplasmi del gruppo stolbur, è un giallume della
vite tra i più diffusi nei paesi Europei ed in particolare nelle aree viticole mediterranee
(Boudon-Padieu, 2003; Maixner, 2006). E’ noto che le piante infette da fitoplasmosi
possono spontaneamente o per induzione manifestare una remissione dei sintomi
della malattia dando vita ad un fenomeno noto come recovery (Caudwell, 1961; Osler
et al., 1999; Romanazzi et al., 2009).
L’obiettivo di questo studio è stato quello di analizzare in piante infette
e recovered da LN della cultivar Sangiovese (moderatamente suscettibile) e di
Chardonnay (altamente suscettibile), la variazione dell’espressione genica e l’attività
enzimatica di alcune proteine coinvolte nell’interazione vite-stolbur in relazione alle
fasi fenologiche della pianta e alla presenza o assenza dei sintomi sulla vegetazione.
Con tale finalità, da 5 piante sintomatiche, 5 recovered da LN e 5 piante controllo
coltivate presso l’azienda sperimentale ASSAM di Petritoli (AP) nella regione
Marche, sono state campionate foglie sintomatiche e asintomatiche nel settembre
2006-2007 e asintomatiche nel giugno 2007. Utilizzando la PCR quantitativa realtime è stata analizzata l’espressione di una selezione di geni associati ai meccanismi di
difesa: superossido dismutasi (SOD), catalasi (CAT), perossidasi di classe III (Px III),
chitinasi di classe III (CHI III) e β-1,3-glucanasi; associati alla via dei fenilpropanoidi:
fenilalanina ammonia liasi (PAL), calcone sintetasi (CHS), e flavanone 3-idrossilasi
(F3H); ed al trasporto degli elettroni, (NADPH deidrogenasi). In aggiunta, utilizzando
le foglie campionate nel settembre 2007 è stata valutata l’attività enzimatica di alcuni
enzimi chiave: β-1,3-glucanasi, chitinasi, PAL e SOD.
Lo studio di espressione genica ha mostrato un generale incremento dei geni
β-1,3-glucanasi, CHI III, PAL, CHS e F3H nelle piante sintomatiche e recovered.
In particolare l’attivazione dei geni β-1,3-glucanasi, CHI III, PAL e F3H riguarda le
foglie sintomatiche mentre CHS e CHI III caratterizza più costantemente le piante
recovered.
Interessanti differenze tra cultivar sono state osservate nelle piante
sintomatiche, in relazione alle fasi fenologiche e alla presenza o assenza del sintomo
su foglia. Infatti in Sangiovese i geni relativi a β-1,3-glucanasi, F3H, PAL e CHI III,
incrementano l’espressione in tutte le fasi testate ed indipendentemente dalla presenza
758
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
o meno del sintomo su foglia, mentre in Chardonnay sono attivati solo in presenza
del sintomo da LN. Altri geni sono sotto-espressi: NADPH deidrogenasi nelle foglie
con sintomi di entrambe le cultivars, i geni SOD e CAT nella porzione asintomatica
fogliare delle piante sintomatiche della sola cultivar Chardonnay.
Lo studio dell’attività enzimatica conferma il coinvolgimento delle chitinasi,
della β-1,3­-glucanasi, e degli enzimi SOD e PAL nella sintomatologia da LN ed
in particolare della PAL nel fenomeno del recovery. Nelle piante sintomatiche di
Sangiovese l’attività degli enzimi incrementa sia nelle foglie con sintomi che in
quelle senza sintomi mentre in Chardonnay un aumento si è osservato solo nelle foglie
con sintomatologia evidente. Questo studio amplia le conoscenze relativo alle vie
metaboliche attivate nell’interazione vite-fitoplasma e mostra che il coinvolgimento
di alcune specifiche proteine nella sintomatologia da LN dipendono dal metabolismo
della cultivar, dalle variazioni stagionali e dalla suscettibilità alla malattia.
Parole chiave: Attività enzimatica, Espressione genica, Recovery, Stolbur, Vitis
vinifera L.
Defence-related gene expression and enzyme activity in Bois noir symptomatic
and recovered grapevines
Bois noir (BN) is caused by the stolbur phytoplasma, one of the most
widespread yellows diseases of grapevine in European and Mediterranean vineyards
(Boudon-Padieu, 2003; Maixner, 2006). Infected plants can occasionally undergo
symptom remission, better known as recovery, that can be spontaneous or induced
(Caudwell, 1961; Osler et al., 1999; Romanazzi et al., 2009).
The aims of this study were to analyzed the expression patterns and enzyme
activities of a number of proteins involved in the grapevine–stolbur interaction in
symptomatic and recovered grapevine cvs. of Sangiovese (moderately susceptible)
and Chardonnay (highly susceptible), according to the plant phenology and the
presence/ absence of BN symptoms. Leaves from 5 BN-symptomatic plants, 5 BNrecovered plants and 5 control plants were selected from the ASSAM Experimental
Farm of Petritoli (AP), in the Marche region, in September 2006 and 2007 and June
2007. Using quantitative real-time PCR, the relative expression levels of a selection
of genes related to plant defence mechanisms were analyzed: superoxide dismutase
(SOD), catalase (CAT), class III peroxidase (PX III), class III chitinases (CHI III),
β-1,3-glucanase; the phenylpropanoid pathway: phenylalanine ammonia-lyase (PAL),
chalcone synthase (CHS), flavanone 3-hydroxylase(F3H); and electron transport
(NADPH dehydogenase). Furthermore, the β-1,3-glucanase, CHI III, PAL and SOD
activities have been examined on samples harvested in September 2007.
In leaves from both symptomatic and recovered plants, there was increased
expression of the genes for β-1,3-glucanase, CHI III, PAL, CHS and F3H. This was
seen as a sharp increase in symptomatic leaf tissue, with up-regulation of CHI III and
759
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
CHS characterizing the recovered plants of both cultivars. Significant differences in
gene expression were seen in the symptomatic plants between the cultivars according
to plant phenology and leaf symptoms presence. In Sangiovese, β-1,3-glucanase,
F3H, PAL and CHI III showed enhanced expression levels in all of the phenological
phases and in both asymptomatic and symptomatic leaves, while Chardonnay
increased this gene expression only in the BN-symptomatic leaves. Others genes were
down-regulated: NADPH dehydrogenase in symptomatic leaves of both cultivars,
and SOD and CAT in symptomless leaves from Chardonnay symptomatic plants.
Assays for the enzymatic activities confirmed the involvement of β-1,3-glucanase,
chitinase, PAL and SOD in BN symptomatology, and PAL on BN-recovered plants.
In particular, the enzymatic activities confirmed the differences between cultivars: in
Chardonnay the chitinase, β-1,3-glucanase and SOD activities increased only on the
BN-symptom leaves, while in Sangiovese this was apparent in both BN-symptomatic
and asymptomatic leaves.
The present study demonstrates that the involvement of specific defence
molecules in BN symptomatic and recovered plants depends on cultivar metabolism,
seasonal variations and susceptibility to the disease. This study improves our
knowledge of the metabolic pathways that are activated in grapevine–phytoplasma
interactions and in BN-recovered grapevines.
Key words: Enzymatic activity, Gene expression, Recovery, Stolbur, Vitis vinifera L.
Ringraziamenti/Acknowledgements
Si ringrazia il Dott. S. Virgili dell’ASSAM per la collaborazione alle indagini.
Lavoro svolto nell’ambito dei Progetti “Valutazione dell’efficacia di trattamenti
con elicitori nell’induzione del recovery in viti infette da fitoplasmi e monitoraggio
dell’attività enzimatica nelle piante (acronimo Varenne)” svolto nell’ambito del bando
2007 nel campo dell’Ambiente promosso dalla Fondazione Cariverona e del MIUR
PRIN 2005074429_002 “Indagini sul recovery in viti affette da Legno nero e ricerca
di mezzi innovativi per incrementare il fenomeno”.
760
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
Lavori citati/References
Boudon-Padieu E., 2003. The situation of Grapevine Yellows and current research
directions: distribution, diversity, vectors, diffusion and control. In: Extended
Abstracts 14th Meeting of the International Council for the Study of Virus and
Virus-like Diseases of the Grapevine. Locorotondo (BA), Italy, September
12-17, 47-53.
Caudwell A., 1961. Les phenomenes de retablissement ches la Flavescence dorée de
la vigne. Annales des Epiphyties, 12, 347-354.
Maixner M., 2006. Grapevine yellows – Current developments and unsolved
questions. In: Extended Abstracts 15th Meeting of the International Council
for the Study of Virus and Virus-like Diseases of the Grapevine. Stellenbosch,
South Africa, April 3-7, 2006, 86-88.
Osler R., N. Loi, L. Carraro, P. Ermacora, E. Refatti, 1999. Recovery in plants
affected by phytoplasmas. In: Proceedings of the 5th Congress of the European
Foundation for Plant Pathology. Taormina, Italy, September 19-22, 589-592.
Romanazzi G., R. Musetti, C. Marzachì, P. Casati, 2009. Induction of resistance in
the control of phytoplasma diseases. Petria, 19(3), 113-129.
761
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
CLASSI DI GENE ONTOLOGY DIFFERENZIALMENTE
ESPRESSE IN VITI INFETTE DAL FITOPLASMA STOLBUR
F. Punelli1, P. Uva2, A. Ferrarini3, F. Faggioli1, M. Barba1, G. Pasquini1
CRA-PAV Centro di Ricerca per la Patologia Vegetale
Via C.G. Bertero, 22, I-00156 Roma
2
CRS4 Bioinformatics Laboratory
Parco Scientifico e Tecnologico POLARIS, Edificio 1, I-09010 Pula (CA)
3
Unità LATEMAR di Verona Dipartimento di Biotecnologie,
Università degli Studi di Verona
Strada le Grazie, 15, I-37134 Verona
1
E-mail: [email protected]
Le malattie infettive provocate da agenti virali e di fitoplasmi alterano
in modo importante la qualità e quantità delle produzioni viticole. Non essendo
possibile alcun tipo di controllo diretto nei confronti di tali malattie è necessario
sviluppare metodologie di controllo preventive e, a tal fine, lo studio dei meccanismi
fisiopatologici acquista rilevanza per meglio conoscere le risposte indotte nella pianta
dalla presenza dei patogeni.
Per approfondire, quindi, le conoscenze sulle interazioni ospite/patogeno che
avvengono nel binomio fitoplasma/vite è stato avviato uno studio di espressione
genica in repliche biologiche di viti appartenenti a diverse varietà affette da Legno
nero (LN, causato dal fitoplasma stolbur, sottogruppo 16SrXII-A), confrontate con
piante delle stesse varietà prive di infezione da fitoplasma e piante manifestanti il
fenomeno del ‘recovery’.
Per ottenere un profilo di espressione altamente dettagliato, che consente
di approfondire le conoscenze sui geni attivi nei campioni vegetali indagati e delle
relative pathways coinvolte, è stata utilizzata la tecnologia microarray mediante uso
del chip Roche NimbleGen, contenente 29.550 sonde in quadruplo, rappresentative
dell’intero genoma di Vitis. L’analisi dei risultati mostra l’alterazione dei livelli di
espressione di centinaia di geni nelle piante infette dal fitoplasma, che coinvolgono
varie vie metaboliche come riportato in letteratura (Albertazzi et al., 2009). Un cut-off
di induzione (± log2 per i geni sovra- e sotto-espressi) è stato utilizzato per analizzare
la modulazione dei geni differenzialmente espressi consentendo il raggruppamento
dei campioni analizzati in clusters ben definiti. Inoltre, sono state analizzate le 105
classi di Gene Ontology (GO) rappresentate da almeno dieci sonde per evidenziare
quelle manifestanti una significatività statistica nella perturbazione. Il confronto tra
le replicate biologiche dei campioni infetti e quelle dei campioni sani e ‘recovered’
ha mostrato che le classi di GO maggiormente alterate appartengono alle categorie
‘Spazio Extracellulare’ e ‘Comunicazione Cellulare’.
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Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
Questa analisi preliminare evidenzia importanti modifiche nei processi
trascrizionali nelle piante di vite infette da stolbur e, inoltre, la presenza di ‘cicatrici
metaboliche’ nei campioni di vite manifestanti il fenomeno del ‘recovery’.
Parole chiave: Gene-ontology, Interazione, Legno nero, Microarrays.
Differential gene ontology class expression in grapevine affected by the stolbur
phytoplasma
Infectious diseases caused by viruses and phytoplasma induce quality and
quantity alterations to the grapevine production. Studies on the physiological
mechanisms involved in these diseases are relevant to better understand the plant
responses and the development of preventive control measures.
To understand the phytoplasma/ grapevine physiological interactions, a study
was carried out on the gene expression in biological replicates of vine plants belonging
to different varieties affected by Bois noir (BN, caused by stolbur phytoplasma,
16SrXII-A subgroup), in comparison to plants of the same cultivars without any
infection and to plants showing the ‘recovery’ phenomenon.
To obtain the highly detailed expression profiles needed to increase our
knowledge of the differentially expressed genes in the plant samples investigated and
the relevant pathways involved, microarray technology was applied using the Roche
NimbleGen chip, which contains 29,550 probes in quadruplicates, which represent
the entire Vitis genome.
Alterations in the expression levels of hundreds genes were seen in the plants
infected by phytoplasma, which involved different metabolic pathways, as reported in
literature (Albertazzi et al., 2009). A cut-off of gene induction (± log2 for genes upand down-regulated) was used to analyze the modulation of differentially expressed
genes, which allowed the grouping of tested samples into well-defined clusters. Also,
105 gene ontology (GO) classes that were represented by at least ten probes were
analyzed to highlight those that showed statistically significant perturbations. The
comparisons between biological replicates of infected samples compared with healthy
and ‘recovered’ samples showed that the most affected GO classes belonged to the
categories of ‘Extracellular Space’ and ‘Cell Communication’.
This preliminary analysis shows important changes in transcriptional processes
in grapevine cvs infected by stolbur, and moreover, it shows the presence of ‘metabolic
scars’ in the ‘recovered’ plants.
Key words: Bois noir, Gene-ontology, Interaction, Microarrays.
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Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
Ringraziamenti/Acknowledgements
Lavoro svolto nell’ambito del progetto finanziato dal MiPAAF ‘Uso della
tecnologia dei DNA microarrays nell’individuazione dei geni coinvolti nei meccanismi
di interazione delle piante all’infezione di patogeni sistemici’ (VIRARRAYGENE).
Lavori citati/References
Albertazzi G., J. Milc, A. Caffagni, E. Francia, E. Roncaglia, F. Ferrari, E.
Tagliafico, E. Stefani, N. Pecchioni. 2009. Gene espression in grapevine
cultivars in response to Bois noir phytoplasma infection. Plant Science, 176,
792-804.
764
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
ANALISI PROTEOMICA DI DUE CULTIVAR DI VITIS
VINIFERA (CV ‘NEBBIOLO’ E ‘BARBERA’) AFFETTE DA
FLAVESCENZA DORATA
P. Margaria, S. Palmano
Istituto di Virologia Vegetale, CNR
Strada delle Cacce, 73, I-10135 Torino
E-mail: [email protected]
La Flavescenza dorata è una malattia della vite oggetto di quarantena in
Europa. Nonostante la grande rilevanza economica della malattia, la fisiologia e le
basi molecolari dell’interazione pianta (vite)/patogeno (FDp) sono ancora poco
conosciute. Abbiamo utilizzato l’elettroforesi bidimensionale in gel di poliacrilamide
(2D-PAGE) per studiare i cambiamenti globali del profilo di espressione proteica tra
viti sane ed infette di ‘Nebbiolo’ e ‘Barbera’. Le due cv sono state scelte in quanto
ampiamente coltivate in Piemonte, e costituiscono la base per la produzione di vini
di alta qualità. Inoltre, mostrano una diversa sensibilità alla malattia, che potrebbe
essere associata ad una diversa risposta all’infezione. Il paragone è stato effettuato tra
piante sane e piante singolarmente infette da FDp, escludendo piante infette da altri
fitoplasmi e virus. Le proteine totali sono state estratte con un protocollo a base di
acido tricloroacetico/acetone e separate mediante 2D-PAGE (Giribaldi et al., 2007). I
gel sono stati analizzati utilizzando il software PDQuest e le proteine differenzialmente
espresse sono state identificate mediante spettrometria di massa e successiva analisi
bio-informatica (programmi BLAST e database SWISS-PROT). I dati ottenuti hanno
fornito una visione globale delle alterazioni qualitative e quantitative che si verificano
in vite durante l’infezione di FDp.
Parole chiave: Elettroforesi bidimensionale, Fitoplasma, Vite.
Proteome profile changes in two grapevine cultivars (Vitis vinifera L. cv.
“Nebbiolo” and “Barbera”) infected by Flavescence dorée phytoplasma
Flavescence dorée (FD) is a quarantine disease of Vitis vinifera in Europe, and
it is caused by a phytoplasma (the FD phytoplasma; FDp), which is a plant pathogenic
prokaryote of the Mollicutes class. Despite the great economic relevance of the
disease, its physiology and molecular basis are still poorly understood. We describe
here the use of two-dimensional-polyacrylamide gel electrophoresis (2D-PAGE) to
study changes in protein expression between infected and healthy samples from cvs.
‘Nebbiolo’ and ‘Barbera’. These cultivars are widely grown in north-western Italy and
produce economically-important wines of high quality. They differ in susceptibility
to the disease, but the nature of this difference is not known. Vineyards were widely
765
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
surveyed to collect samples showing FD symptoms, and vines which were singlyFDp infected were identified. Total proteins were extracted with trichloroacetic acid/
acetone and separated by 2D-PAGE (Giribaldi et al., 2007). Gel images were analyzed
using PDQuest software (BioRad) and differentially expressed proteins were identified
using matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectroscopy.
Protein function was identified using BLAST and SWISS-PROT databases, and
they were grouped according to the metabolic pathways involved. The data obtained
provide information on qualitative and quantitative changes in grapevine provoked
by FDp infection, and on the differential responses of varieties with different disease
susceptibilities.
Key words: Grapevine, Phytoplasma, Two-dimensional electrophoresis.
Lavori citati/References
Giribaldi M., L. Perugini, X. Sauvage, A. Schubert, 2007. Analysis of protein
changes during grape berry ripening by 2-DE and MALDI-TOF. Proteomics,
7, 3154-3170.
766
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
INCIDENZA DEI GIALLUMI IN BARBATELLAI E
VIGNETI GIOVANI
M. Borgo, I. Bazzo, D. Bellotto, N. Bertazzon, L. Filippin, V. Forte, L. Stringher,
E. Angelini
CRA-VIT Centro di Ricerca per la Viticoltura
Viale XXVIII Aprile, 26, I-31015 Conegliano (TV)
E-mail: [email protected]
Le epidemie causate dai fitoplasmi della vite (giallumi della vite, GY)
continuano a diffondersi nelle aree viticole di molti Paesi Europei. Spesso i viticoltori
lamentano la presenza della malattia fin dai primi anni di impianto, chiamando in
causa i vivaisti. In questo lavoro è stata studiata l’incidenza della Flavescenza dorata
(FD) e del Legno nero (LN) in barbatellai e vigneti di 1 e 2 anni di Veneto, Friuli
Venezia Giulia e Piemonte, dal 2005 al 2009.
Sono stati ispezionati circa 15 barbatellai e 200 giovani vigneti, di cui 150 al
primo anno e 50 al secondo anno di impianto. In tutto sono stati monitorati visivamente
più di 1.500.000 piante e sono stati raccolti campioni fogliari per l’analisi molecolare
di laboratorio da circa 300 viti, la maggior parte con sintomi sospetti di GY.
I risultati hanno evidenziato la presenza di FD e LN, sebbene con un’incidenza
molto bassa, sia in barbatellaio sia negli impianti di 1 e 2 anni. In particolare, 8 barbatelle
sono risultate infette da FD ed 2 da LN su un totale di 1.000.000. L’incidenza delle
viti infette da giallumi sale velocemente negli impianti del primo e secondo anno:
infatti l’infezione è presente in media sullo 0,005% dei ceppi di 1 anno e raggiunge
valori circa 20 volte maggiori nei vigneti di 2 anni (0,1%). In questi vigneti si osserva
sempre una netta prevalenza di LN su FD.
Sono state riscontrate chiare differenze di incidenza della malattia fra impianti
costituiti con materiali provenienti da vivaisti diversi. In particolare, si è notato che
gli impianti del primo anno messi a dimora e costituiti con materiali provenienti dal
Piemonte, osservati nel 2006 e 2007, avevano un’incidenza di incidenza di GY 10
volte superiore agli altri. Fra questi, nel 2007 sono stati monitorati impianti di 1 anno
sia costituiti con materiali sottoposti a termoterapia, sia con materiali non trattati; si
è osservato che l’incidenza di piante infette da GY non variava, attestandosi appena
sotto lo 0,1% in entrambi i casi.
In conclusione, si è osservato che la percentuale di piante infette da giallumi
della vite cresce con l’età del vigneto, suggerendo che la malattia venga per lo più
acquisita in campo. Inoltre, sembra chiaro che le barbatelle infette da FD, che possono
essere presenti saltuariamente in barbatellaio, per lo più non arrivano in vigneto, dato
che la presenza di viti infette da FD in impianti del primo anno è bassissima. La
tracciabilità dei materiali viticoli, dal vivaista al viticoltore, rimane fondamentale per
capire le cause delle infezioni in vigneto.
Parole chiave: Fitoplasmi, Flavescenza dorata, Legno nero, Vite.
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Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
Occurrence of grapevine yellows in nurseries and young vineyards
Epidemics caused by phytoplasma diseases (Grapevine yellows, GY) continue
to spread throughout grape-producing regions in different European Countries. Often,
the grape growers complain about the occurrence of the disease in the young plants,
and they wonder if the nurseries are involved. The present study has investigated the
presence of Flavescence dorée (FD) and Bois noir (BN) in grapevines in nurseries and
in one- and two-year-old vineyards of Veneto, Friuli Venezia, Giulia and Piedmont,
from 2005 to 2009.
Approximately 15 nurseries and 200 young vineyards (150 one-year-old,
50 two-year-old) were inspected. In all, more than 1,500,000 plants were visually
inspected and about 300 leaf samples were collected for the molecular analyses,
mainly from symptomatic grapevines.
The results show that the presence of FD- and BN-infected grapevines both
in the nurseries and in the one- and two-year-old vineyards is very low. In particular,
8 and 2 rooted grafts out of 1,000,000 plants observed were infected by FD and
BN phytoplasmas, respectively. The occurrence of GY-infected plants increased
drastically in the one- and two-year-old vineyards. Indeed, the infection occurred
on average in 0.005% of plants in one-year-old vineyards, and 0.1% in two-yearold vineyards (20 times higher). In the young vineyards, most of the samples were
infected with BN phytoplasma. The GY infection differed according to the nursery.
In particular, the highest number of infected plants was found in 2006 and 2007 in
one-year-old vineyards planted with rooted grafts coming from Piedmont, which
showed an infection rate 10 times higher than the other young vineyards. One-yearold vineyards planted with rooted grafts and not treated or treated with thermotherapy
were inspected in 2007, and it is worth noting that the occurrence of the disease was
the same, at approximately 0.1% in both kinds of these vine materials.
In conclusion, the percentage of positive samples increased with the age of the
plantation, suggesting that most of the infected grapevines would have acquired the
phytoplasma in the field. Moreover, it appears clear that when present in nurseries,
FD-infected rooted grafts mostly do not reach the grape growers, as in one- and twoyear-old vineyards the presence of FD-infected grapevines was extremely low. The
traceability of grapevine materials, from nursery to grape grower, is fundamental to
our understanding of the causes of these infections.
Key words: Bois noir, Flavescence dorée, Grapevine, Phytoplasmas.
768
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
VARIABILITÀ DEL FITOPLASMA ASSOCIATO AL LEGNO
NERO IN DIVERSI VIGNETI DEL PIEMONTE
D. Pacifico1, V. Pelizzaro1, L. Picciau2, C. Marzachì1
1
CNR - Istituto di Virologia Vegetale
Strada delle Cacce, 73, I-10135 Torino
2
Università di Torino, Facoltà di Agraria, Di.Va.P.R.A.
Settore Entomologia e Zoologia applicate all’Ambiente “Carlo Vidano”
Via L. da Vinci, 44, I-10095 Grugliasco (TO)
E-mail: [email protected]
I fitoplasmi appartenenti al sottogruppo tassonomico 16SrXII-A (stolbur,
“Candidatus Phytoplasma solani”) sono associati a gravi malattie di piante erbacee ed
arboree, come il Legno nero (LN) della vite. In Europa e nel Bacino del Mediterraneo
lo stolbur è trasmesso da insetti vettori appartenenti alla famiglia Cixiidae, e
principalmente dalla specie Hyalesthes obsoletus Signoret. Differenze biologiche e
genomiche di isolati di ”Ca. P. solani” da ospiti diversi e diversa origine geografica,
sono state riportate in letteratura, sebbene tale variabilità non emerga attraverso
l’analisi PCR-RFLP del gene 16SrRNA (Marcone et al., 1999; Cimerman et al., 2009).
Per tale ragione, marcatori genetici non ribosomali (tuf, vmp1, secY) sono attualmente
affiancati all’analisi del 16SrDNA negli studi sulla variabilità genetica di fitoplasmi del
gruppo 16SrXII-A (Fialova et al., 2009; Pacifico et al., 2009; Quaglino et al., 2009).
In questo lavoro, l’analisi PCR-RFLP del gene vmp1 è stata utilizzata per saggiare la
variabilità genetica di isolati di LN provenienti da otto vigneti rappresentativi della
produzione vitivinicola piemontese. Campioni di vite e di piante spontanee sono
stati prelevati in ciascun vigneto in primavera, estate ed autunno, negli anni 2007,
2008 e 2009. I campioni infetti sono stati identificati attraverso Reverse transcription
(RT)-PCR diretta, seguita da PCR nested in real time, con primer stolbur-specifici
(Margaria et al., 2009). In aggiunta, sono stati inclusi nelle analisi alcuni isolati di
stolbur da insetti catturati nei vigneti in studio.
Circa il 66% dei campioni di erbacee infestanti e il 50% dei campioni di vite
raccolti nel corso del triennio sono risultati positivi al saggio diagnostico. Frammenti
di diversa taglia molecolare del gene vmp1 sono stati amplificati da isolati di LN da
vite, spontanee ed insetti. Diversi pattern di restrizione sono stati ottenuti in seguito al
trattamento degli ampliconi di PCR con le endonucleasi RsaI o AluI, confermando la
presenza di differenti varianti geniche del fitoplasma associato a LN nell’Italia nord
occidentale (Pacifico et al., 2009). Nel corso del triennio, in tutti i vigneti in studio,
l’infezione da stolbur è risultata associata ad un alto livello di variabilità genetica del
patogeno, come confermato dal complesso di profili vmp1 amplificati.
Parole chiave: PCR-RFLP, Stolbur, Vitis vinifera, vmp1.
769
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
Variability of Bois noir phytoplasma isolates in several vineyards of Piedmont
Phytoplasmas in the 16SrXII-A taxonomic subgroup (stolbur, “Candidatus
Phytoplasma solani”) are responsible for several diseases of herbaceous and woody
plants, such as grapevine Bois noir (BN). In the Euro-Mediterranean region, stolbur
phytoplasmas are transmitted by insect vectors of the family Cixiidae. Hyalesthes
obsoletus Signoret, which is the principal vector of BN phytoplasma (BNp) to
grapevine. Biological and genomic variability have been reported for ”Ca. P. solani”
isolates from different areas and host plants, although low variability was revealed
following PCR-RFLP analysis of the 16SrRNA gene (Cimerman et al., 2009;
Marcone et al., 1999). Non-ribosomal genes (tuf, vmp1, secY) are currently used as
genetic markers, with 16SrDNA for a finer discrimination of phytoplasmas within
the 16SrXII-A subgroup (Fialova et al., 2009; Pacifico et al., 2009; Quaglino et al.,
2009). In the present study, the genetic diversity of BNp isolates from eight vineyards
of the Piedmont region (north-western Italy) was investigated through PCR-RFLP
analysis of the vmp1 gene. Weed and grapevine samples were collected in spring,
summer and autumn of 2007, 2008 and 2009. BNp infections were identified by
reverse transcription-direct PCR, followed by real-time nested PCR with stolburspecific primers, using crude sap extracts from symptomatic samples as the templates
(Margaria et al., 2009). Stolbur isolates from insects sampled in the same vineyards
were also included in the analysis.
BNp was detected in about 66% and 50% of weed and grapevine samples,
respectively. Vmp1 fragments of different sizes were amplified from the plant and
insect BNp isolates. Several Vmp1 RFLP-types were obtained following the digestion
of PCR products with RsaI or AluI endonucleases, confirming the presence of BNp
variants in north-western Italian vineyards (Pacifico et al., 2009). In each vineyard,
the BNp population was represented by a complex of different vmp1 types, indicating
the presence of high genetic variability of the pathogen during the three year survey.
Key words: PCR-RFLP, Stolbur, Vitis vinifera, vmp1.
770
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
Lavori citati/References
Cimerman A., D. Pacifico, P. Salar, C. Marzachì, X. Foissac, 2009. Striking
diversity of vmp1, a variable gene encoding a putative membrane protein
of the Stolbur phytoplasma. Applied and Environmental Microbiology, 75,
2951-2957.
Fialová R., P. Válová, G. Balakishiyeva, J.-L. Danet, D. Šafářová, X. Foissac, M.
Navrátil, 2009. Genetic variability of stolbur phytoplasma in annual crop
and wild plant species in the South Moravia (Czech Republic). Journal of
Plant Pathology, 91, 411-416.
Marcone C., H. Neimark, A. Ragozzino, U. Lauer, E. Seemüller, 1999. Chromosome
sizes of phytoplasmas composing major phylogenetic groups and subgroups.
Phytopathology, 89, 805-810.
Margaria P., M. Turina, S. Palmano, 2009. Detection of Flavescence dorée and
Bois noir phytoplasmas, Grapevine Leafroll associated Virus-1 and -3 and
Grapevine Virus A from the same crude extract by reverse transcription-Real
Time Taqman assays. Plant Pathology, 58, 838-845.
Pacifico D., A. Alma, B. Bagnoli, X. Foissac, G. Pasquini, M. Tessitori , C. Marzachì,
2009. Characterization of Bois noir isolates by RFLP of a Stolbur-specific
putative membrane protein gene. Phytopathology, 99, 711-715.
Quaglino F., Y. Zhao, P.A. Bianco, W. Wei, P. Casati, G. Durante, R.E. Davis, 2009.
New 16Sr subgroups and distinct SNP lineages among grapevine Bois noir
phytoplasma populations. Annals of Applied Biology, 154, 279-289.
771
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
Caratterizzazione MOLECOLARE del fitoplasma
dello stolbur in vite ed ospiti erbacei
S. Murolo1, C. Marcone2, X. Foissac3,4, V. Prota5, R. Garau5, G. Romanazzi1
Dipartimento di Scienze Ambientali e delle Produzioni Vegetali, Università
Politecnica delle Marche
Via Brecce Bianche, I-60131 Ancona
2
Dipartimento di Scienze Farmaceutiche, Università degli Studi di Salerno
Via Ponte Don Melillo, I-84084 Fisciano (SA)
3
UMR1090 Génomique Diversité Pouvoir Pathogène, INRA
71 avenue Edouard Bourlaux, BP81, F-33883 Villenave d’Ornon, France
4
UMR1090 Génomique Diversité Pouvoir Pathogène, Université Bordeaux 2
71 Avenue Edouard Bourlaux, BP81, F-33883 Villenave d’Ornon, France
5
Dipartimento di Protezione delle Piante, Università degli Studi di Sassari
Via De Nicola, 1, I-07100 Sassari
1
E-mail: [email protected]
I fitoplasmi appartenenti al sottogruppo 16SrXII-A ed associati allo stolbur
possono determinare ingenti perdite del raccolto su vite e numerose colture orticole.
In vite, lo stolbur è l’agente del Legno nero (LN), una malattia considerata meno
epidemica della Flavescenza dorata (FD), ma che sta mostrando una crescente
diffusione in diversi Paesi del Bacino del Mediterraneo (Maixner, 2006). Le
Solanaceae (pomodoro, patata e peperone), come anche le Apiaceae (sedano), possono
essere danneggiate irreversibilmente dallo stolbur (Carraro et al., 2008; Navratil et
al., 2009). Le complesse interazioni dello stolbur con le piante ospiti spontanee e
coltivate annuali e perenni e con gli insetti vettori possono aver determinato nel tempo
una diversità genetica del fitoplasma e una diversa risposta fenotipica dell’ospite
(Marcone et al., 1999). Diversi ricercatori hanno condotto indagini sulla variabilità
genetica considerando una serie di geni. Una considerevole variabilità genetica è
stata verificata quando è stato analizzato, mediante la PCR-RFLP, il gene vmp1, che
codifica per una proteina di membrana (Cimerman et al., 2009; Fialova et al., 2009;
Pacifico et al., 2009; Murolo et al., in stampa).
Scopo del presente lavoro è stato quello di verificare la variabilità genetica di
isolati di stolbur rinvenuti in diversi ospiti provenienti da regioni dell’Italia centrale
(Marche e Abruzzo), meridionale (Campania e Basilicata) ed insulare (Sardegna).
Da duecentotrenta campioni è stato estratto il DNA totale, utilizzando
il kit commerciale DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germania) e quello
fitoplasmatico è stato amplificato in nested PCR usando la coppia di primer StolH10F1/
R1, seguita da TYPH10F/R, specifica per la regione codificante il gene vmp1. Il
prodotto PCR, digerito con l’enzima RsaI a 37°C, è stato separato su un gel di agarosio
al 2,5%. La PCR-RFLP ha permesso di verificare una più ampia diversità genetica nei
campioni di vite (9 profili) rispetto alle erbacee (6 profili). Sia per la vite che per le
772
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
erbacee sporadicamente sono state rinvenute infezioni miste di ceppi di stolbur, come
anche riportato da Pacifico et al. (2009). I dati ottenuti dalla digestione reale sono
stati supportati dal sequenziamento e dalla digestione virtuale applicati a 20 isolati
di stolbur rappresentativi dei profili PCR-RFLP. Le sequenze nucleotidiche insieme
a 12 disponibili in banca dati (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) sono state analizzate
mediante il software MEGA 3. Nell’albero filogenetico, le sequenze generalmente si
raggruppano a seconda del profilo PCR-RFLP, dimostrando l’accuratezza di questa
tecnica che può essere un’utile procedura preliminare per stimare la diversità genetica.
Parole chiave: Digestione virtuale, PCR-RFLP, Sequenziamento, Vitis vinifera, vmp1.
Molecular characterization of stolbur phytoplasma in grapevine
and herbaceous hosts
Phytoplasmas classified in the 16SrXII-A subgroup and associated with stolbur
disease can cause severe production loss for grapevine and for several vegetables. In
grapevine, stolbur is the agent of Bois noir (BN), a disease that is considered less
epidemic than Flavescence dorée (FD), but which is showing increasing spread in
several countries in the Mediterranean areas. Solanaceae (e.g. tomato, potato and
pepper) and Apiaceae (e.g. celery) can be seriously damaged by stolbur (Carraro et
al., 2008; Navratil et al., 2009). The complex interactions of stolbur phytoplasma with
wild and cultivated annual and perennial host plants and insect vectors in different
ecosystems might be responsible for generating genetic and phenotypic diversity
(Marcone et al., 1999). Genetic variability has been investigated in several genes.
However, the evidence for genetic diversity of stolbur increased considerably when
the vmp1 gene, encoding a putative membrane protein, was analysed by PCR/RFLP
(Cimerman et al., 2009; Fialova et al., Pacifico et al., 2009; Murolo et al., in press).
The aim of the present study was to investigate the vmp1 genetic variability
of stolbur phytoplasma isolates infecting several host plants in the central eastern
(Marche, Abruzzi), southern (Campania, Basilicata) and insular regions (Sardegna)
of Italy.
The total DNA was extracted from 230 samples using DNeasy Plant Mini Kit
(Qiagen, Hilden, Germany), and phytoplasmal DNA was amplified in nested PCR
by the primer pair StolH10F1/R1, followed by TYPH10F/R, a specific for the region
encoding the vmp1 gene. The PCR products digested by RsaI at 37 °C were resolved
on 2.5% agarose gels. The PCR/RFLP revealed higher genetic diversity in grapevine
samples (nine profiles) than herbaceous ones (six profiles). In both the grapevine and
herbaceous samples, mixed infections of BN strains were sporadically detected, as
previously reported by Pacifico et al. (2009). The data from “wet digestion” were
supported by sequencing analysis and “virtual digestion”, which was applied to 20
stolbur isolates that showed representative PCR-RFLP profiles. With 12 available in
Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), the nucleotide sequences were analyzed by
773
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
the MEGA 3 software. In the phylogenetic tree, the sequences generally clustered
according to the typology of the RFLP patterns, demonstrating the accuracy of this
technique, which proves to be a useful preliminary procedure for the estimation of
genetic diversity.
Key words: PCR-RFLP, Sequencing, Virtual digestion, Vitis vinifera, vmp1.
Ringraziamenti/Acknowledgements
Lavoro svolto nell’ambito del progetto “Diagnosi e caratterizzazione di agenti
di malattie delle piante” promosso dall’Università Politecnica delle Marche.
Lavori citati/References
Carraro L., F. Ferrini, M. Martini, P. Ermacora, N. Loi, 2008. A serious epidemic of
Stolbur on celery. Journal of Plant Pathology, 90, 131-135.
Cimerman A., D. Pacifico, P. Salar, C. Marzachì, X. Foissac, 2009. Striking diversity
of vmp1, a variable gene encoding a putative membrane protein of the stolbur
phytoplasma. Applied and Environmental Microbiology, 75, 2951-2957.
Deng S., C. Hiruki, 1991. Amplification of 16S rRNA genes from culturable and nonculturable mollicutes. Journal of Microbiological Methods, 14, 53-61.
Fialovà R., P. Vàlovà, G. Balakishiyeva, J.-L. Danet, D. Šafàřovà, X. Foissac,
M. Navràtil, 2009. Genetic variability of stolbur phytoplasma in annual crop
and wild plant species in South Moravia (Czech Republic). Journal of Plant
Pathology, 91, 411-416.
Marcone C., H. Nneimark, A. Ragozzino, U. Lauer, E. Seemüller, 1999. Chromosome
sizes of phytoplasmas composing major phylogenetic groups and subgroups.
Phytopathology, 89, 805-810.
Maixner M., 2006. Grapevine yellows – Current developments and unsolved
questions. Extended abstracts of the 15th meeting of the International Council
for the Study of Virus and Virus-like Diseases of the Grapevine (ICVG),
Stellenbosch, South Africa, April 3-7, 86-87.
Murolo S., C. Marcone, V. Prota, R. Garau, X. Foissac, G. Romanazzi. Molecular
characterization of stolbur phytoplasma infecting weeds, vegetables and
grapevine, based on vmp1 gene variability. Journal of Applied Microbiology
(in stampa, doi 10.1111/j.1365-2672.2010.04835.x).
774
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
Navratil M., P. Valova, R. Fialova, P. Lauterer, D. Safarova, M. Star, 2009. The
incidence of stolbur disease and associated yield losses in vegetable crops in
South Moravia (Czech Republic). Crop Science, 28, 898-904.
Pacifico D., A. Alma, B. Bagnoli, X. Foissac, G. Pasquini, M. Tessitori, C.
Marzachì, 2009. Characterization of Bois noir isolates by restriction fragment
length polymorphism of a stolbur-specific putative membrane protein gene.
Phytopathology, 99, 711-715.
775
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
COMUNITA’ BATTERICHE ASSOCIATE A VITI SANE,
INFETTE DA FITOPLASMI E RISANATE
D. Bulgari1, P. Casati1, F. Quaglino1, P. Crepaldi2, A. Zorloni1, P. A. Bianco1
1
Dipartimento di Produzione Vegetale-sezione Patologia Vegetale, Università degli
Studi, via Celoria 2, I-20133 Milano,
2
Dipartimento di Scienza Animali-sezione Zootecnica Agraria, via Celoria 2,
I-20133 Milano
E-mail: [email protected]
Flavescenza dorata (FD) e Legno nero (LN) sono due gravi malattie del
complesso dei giallumi della vite (GY) causate da fitoplasmi. Tali ampelopatie
provocano danni ingenti alla produzione viti-vinicola in Europa. Attualmente, le
misure di lotta più efficaci per il controllo di FD sono i trattamenti insetticidi contro
l’insetto vettore, Scaphoideus titanus Ball.; tali strategie sono inefficaci, invece, per
il contenimento di LN, il quale presenta un’ecologia più complessa. Inoltre, non sono
ancora state identificate varietà di vite resistenti all’infezione (Laimer et al., 2009).
Recentemente, lo studio del risanamento spontaneo (recovery) e dell’impiego di
batteri endofiti come agenti di biocontrollo ha acquisito un notevole interesse al fine di
sviluppare nuove strategie di lotta. Con il termine endofiti sono definiti tutti i batteri,
inclusi quelli fitopatogeni, in grado di colonizzare la pianta senza indurre sintomi
(Wilson, 1995; Hallman et al., 1997). In natura, infatti, i batteri endofiti sono in grado
di ridurre i sintomi della malattia mediante: l’induzione dei meccanismi di difesa
della pianta ospite, la produzione di sostanze allelochimiche e la competizione con
il patogeno per la colonizzazione di una nicchia ecologica (Lugtemberg et al., 2009).
In questo lavoro, lo studio della comunità batterica endofita è stato effettuato
mediante saggi LH-PCR (Length Heterogenity-PCR) combinati ad analisi statistiche
al fine di valutare il ruolo dei batteri endofiti nel fenomeno del recovery. In dettaglio,
la struttura della comunità batterica associata a vite è stata analizzata in 60 viti (20
sane, 20 infette da fitoplasmi e 20 risanate). Il DNA estratto dalle viti campionate ed
analizzato mediante LH-PCR ha generato una serie di profili LH-PCR che sono stati
analizzati mediante indici statistici. Tali analisi hanno mostrato che esistono delle
differenze nella composizione della comunità microbica associata alle viti sane, infette
da fitoplasmi e risanate. Al fine di identificare le specie batteriche che possiedono il
frammento del 16S rDNA corrispondente ai picchi identificati nei profili LH-PCR, i
batteri endofiti sono stati isolati su terreno agarizzato (Bulgari et al., 2009). L’analisi
LH-PCR ha evidenziato, inoltre, la presenza di un numero maggiore di picchi (specie
batteriche) nelle viti sane rispetto a quelle infette e risanate, il cui numero di picchi
è confrontabile. Tale diminuzione nel numero di specie associate alle viti infette e
risanate potrebbe essere dovuto: (i) all’induzione diretta da parte del fitoplasma di
una variazione nella composizione microbica presente nella pianta ospite; oppure (ii)
776
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
all’induzione indiretta da parte del fitoplasma di tale variazione, mediante l’induzione
della risposta di difesa della pianta ospite. La comunità microbica così rimodellata
potrebbe essere alla base del processo di risanamento.
Parole chiave: Biocontrollo, Diversità microbica, Giallumi della vite, LengthHeterogeneity PCR, Recovery.
Comparison of endophytic bacterial community associated with healthy,
GY-diseased and recovered grapevine plants
Flavescence dorée (FD) and Bois noir (BN) are grapevine yellows (GY)
associated with phytoplasmas, and they can induce severe crop losses. Therefore, their
containment is a priority in European wine-producing areas. To date, no grapevine
varieties have been found to be resistant to phytoplasma infections (Laimer et al.,
2009). The control of FD is based on chemical treatments against the insect vector,
Scaphoideus titanus Ball; however, this strategy is not effective for BN containment
because of the biological complexity of this disease. In recent years, there has been
increasing interest in the recovery from GY diseases and in the role of endophytic
bacteria as biocontrol agents. The term “endophytic bacteria” includes all of the
bacteria that colonise the interior of plants without inducing diseases, which includes
those that become pathogenic under certain conditions (Wilson, 1995; Hallman et al.,
1997). Although their relationships with their host plants are not well understood, these
endophytic bacteria can reduce disease severity by activating systemic resistance, by
production of allelochemicals (biocidal volatiles, antibiotics, and lytic enzymes) and
by competition for nutrients and niches (Lugtemberg et al., 2009).
To investigate the possible role of endophytic bacteria in recovery from
GY, the microbial community diversity and structure associated with healthy, GYdiseased, and recovered grapevines were analysed through length heterogeneity-PCR
(LH-PCR) combined with statistical analyses. The endophytic bacterial communities
were examined in 20 plants each of healthy, GY-diseased, and recovered grapevines.
LH-PCR of total DNA from the leaves was used to generate the bacterial amplicon
profiles that were analysed with statistical methods. These analyses showed that that
the microbial communities are different across healthy, GY-diseased, and recovered
grapevines. Furthermore, the LH-PCR electrophoretic peaks that were assigned to
isolated cultivatable grapevine-associated single bacterial strains were used to identify
these peaks and to monitor the bacterial species distributions in the total DNAs from
the plants analysed. The bacterial communities associated with healthy plants were
characterised by greater diversity (more LH-PCR peaks) than those of GY-diseased
and recovered plants. This decrease in bacterial richness and the different microbial
compositions in GY-infected and recovered plants suggest that: (i) phytoplasma
infections can restructure these bacterial communities; and/or (ii) the variations in
these microbial compositions might be a starting point for recovery.
777
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
Key words: Biocontrol, Grapevine yellows, Length-heterogeneity PCR, Microbial
diversity, Recovery.
Lavoro citati/References
Bulgari D., P. Casati, L. Brusetti, F. Quaglino, D. Daffonchio, P.A. Bianco, 2009.
Endophytic bacterial diversity in grapevine (Vitis vinifera L.) leaves described
by 16S rRNA gene sequence analysis and length heterogeneity-PCR. The
Journal of Microbiology, 47, 393-401.
Hallmann J., A. Quadt-Hallmann, W.G. Miller, R.A. Sikora, S.E. Lindow, 2001.
Endophytic colonization of plants by biocontrol agent Rhizobium etli G12 in
relation to meloidogyne incognita infection. Phytopathology, 91, 415-422.
Laimer M., O. Lemaire, E. Herrbach, V. Goldschmidt, A. Minafra, P.A. Bianco, T.
Wetzel, 2009. Resistance to viruses, phytoplasmas and their vectors in the
grapevine in Europe: a review. Journal of Plant Pathology, 91, 7-23.
Lugtemberg B., F. Kamilova, 2009. Plant-Growth-Promoting rhizobacteria. Annual
Review of Microbiology, 63, 541-556.
Wilson D., 1995. Endophyte- the evolution of a term, and clarification of its use and
definition. Oikos, 73, 274-276.
778
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
Prove di termoterapia su materiale di
propagazione viticolo appartenente a varietà
coltivate in Lombardia affette da giallumi
P.A. Bianco1, A. Zorloni1, N. Parisi2, P. Casati1, A. Colombo2, R. Tonesi3
1
Dipartimento di Produzione Vegetale, sez. Patologia Vegetale, Università degli
Studi di Milano
Via Celoria, 2, I-20133 Milano
2
Co.Pro.Vi.
P.zza V. Veneto, 1, I-27045 Casteggio (PV)
3
Regione Lombardia, Direzione Generale Agricoltura
Via Pola, 12/14, I-20124 Milano
E-mail: [email protected]
La termoterapia viene utilizzata come mezzo di risanamento nei confronti dei
fitoplasmi (Caudwell et al., 1990) e, in epoca recente, sempre più impiegata come
misura di contenimento della Flavescenza dorata della vite (Bianco et al., 2000;
Zorloni et al., 2008; Mannini et al., 2009). Il settore vivaistico viticolo sta utilizzando
la termoterapia in modo sempre più diffuso impiegando modalità di trattamento messe
a punto per le varietà che sono ampiamente diffuse sul territorio nazionale, mentre
scarse sono le informazioni che consentano di applicare protocolli adatti a varietà
autoctone o comunque di interesse locale.
Nell’ambito di un progetto di ricerca finanziato dalla Regione Lombardia, sono
state svolte prove con lo scopo di determinare le condizioni migliori di termoterapia
a cui sottoporre ciascun vitigno oggetto del presente studio, al fine di eradicare la
presenza dei fitoplasmi responsabili di FD ed LN. In particolare sono state utilizzate le
varietà Barbera, Chardonnay, Croatina, Pinot nero, Riesling italico, Riesling renano e
Uva rara. Gemme dormienti, prelevate a gennaio 2009 da viti malate e sane in Oltrepò
pavese e Franciacorta, sono state suddivise in quattro tesi e sottoposte a termoterapia
con i seguenti parametri: tesi A 48°C per 45’; tesi B 50°C per 45’; tesi C 52°C per 30’;
tesi NT non trattate. Un pre-trattamento (30°C/20’) è stato applicator per ogni tesi. In
tutto sono state trattate 4268 gemme prelevate da viti malate (1062 tesi NT, 1064 tesi
A, 1071 tesi B, 1071 tesi C) e 4200 da viti sane (1050 tesi NT, 1050 tesi A, 1050 tesi
B, 1050 tesi C). Le gemme trattate sono state innestate, sottoposte a forzatura, messe
in vaso e mantenute sotto tunnel a prova di insetto.
A ottobre, le barbatelle germogliate e sopravvissute ottenute da legno malato
erano 1749 (41%): 687 non trattate (pari al 65%); 499 sottoposte alla tesi A (47%);
355 alla tesi B (33%); 208 alla tesi C (19%). Quelle ottenute da legno sano erano
2450 (58%): 744 non trattate (71%); 581 sottoposte alla tesi A (55%); 492 alla tesi B
(47%); 328 alla tesi C (31%). La percentuale di sopravvivenza del materiale trattato
prelevato da piante malate è risultata più bassa rispetto a quello prelevato da piante
sane e, in entrambi i casi, è diminuita con l’aumentare della temperatura. Questo
conferma che il trattamento con acqua ad alte temperature può provocare danni al
779
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
materiale trattato, con ripercussioni sulla ripresa vegetativa e sulla sopravvivenza
delle barbatelle (Borgo et al., 1999; Bertaccini et al., 2001). Riguardo l’efficacia dei
trattamenti eseguiti nei confronti di FD e LN, nessuna vite ottenuta da legno malato, al
primo anno di vegetazione, presentava sintomi evidenti di giallume. I risultati ottenuti
nel primo anno di sperimentazione confermano l’efficacia della termoterapia anche
se alle analisi sintomatologiche eseguite dovranno seguire analisi di laboratorio in
grado di determinare la presenza o meno di fitoplasmi associati a FD e LN per stabilire
quale delle condizioni adottate siano in grado di eradicare i patogeni dal materiale
vivaistico.
Parole chiave: Flavescenza dorata, Legno nero, Trattamento termico, Vivaismo
viticolo.
Sanitation of Grapevine yellows affected cultivars of Lombardia region by hot
water treatment
Hot-water treatments (HWT) have been indicated as a method to eradicate
phytoplasmas (Caudwell et al., 1990), and more recently as an efficient way to contain
Flavescence dorée (FD) propagation (Bianco et al., 2000; Zorloni et al., 2008; Mannini
et al., 2009). The use of this practice by grapevine nurseries is becoming more and
more frequent, although information about the effects of different HWT protocols on
local cultivars is rare.
A research project financed by Regione Lombardia has been promoting the
study of HWT for sanitation of FD and BN affected wines of cvs Barbera, Chardonnay,
Croatina, Pinot nero, Riesling italico, Riesling renano and Uva rara, which are widely
cultivated in this region. Canes from healthy and infected plants collected on January
2009 in Oltrepò Pavese and Franciacorta vineyards were treated as following: protocol
NT, the untreated controls; protocol A, 45 min at 48 °C; protocol B, 45 min at 50
°C; protocol C, 30 min at 52 °C. A pre-treatment (30 °C/ 20 min) was included in
each protocol. A total of 4,268 one-bud cuttings from infected plants (1,062, 1,064,
1,071, 1,071, respectively) and 4,200 from healthy plants (1,050, 1,050, 1,050, 1,050,
respectively) were treated. The treated buds were then grafted, forced, potted and
maintained under a screen-house.
In October, the infected canes showed 1,749 sprouted rootstocks (41%): 687
(65%); 499 (47%); (33%); 208 (19%), respectively. The healthy canes showed 2,450
(58%): 744 (71%); 581 (55%); 492 (47%); 328 (31%), respectively. The relative
survival of the treated materials from infected plants was lower than from healthy
ones, and in each case, it decreased with the higher temperature treatments. Therefore,
damage caused on the vitality and growth of treated rootstocks by HWT is more
frequent with higher temperatures and in the presence of infection (Borgo et al., 1999;
Bertaccini et al., 2001). During the first year of vegetation, none of the treated vines
showed GY symptoms, confirming the efficacy of this practice in reducing the spread
780
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
of the disease through infected propagation materials. Nevertheless, visual analysis
will need to be supported by molecular analysis of leaf samples collected from each
treated plant. Following the results of this latter analysis, we will be able to draw
definitive conclusions.
Key words: Bois noir, Flavescence dorée, Hot-water treatment, Viticultural nursery.
Ringraziamenti/Acknowledgements
Lavoro svolto nell’ambito del progetto regionale “Prove di termoterapia su
materiale di propagazione viticolo appartenente a varietà significative per l’Oltrepò
pavese” (progetto TERMOVIT).
Lavori citati/References
Bertaccini A., M. Borgo, L. Bertotto, A. Bonetti, S. Botti, S. Sartori, M. Pondrelli,
E. Murari, 2001. Termoterapia e chemioterapia per eliminare i fitoplasmi da
materiali di moltiplicazione della vite. L’Informatore Agrario, 42, 137-144.
Bianco P.A., A. Fortusini, G. Scattini, P. Casati, S. Carraro, G.C. Torresin, 2000.
Prove di risanamento di materiale viticolo affetto da Flavescenza dorata
mediante termoterapia. Informatore Fitopatologico, 4, 43-49.
Borgo M., E. Murari, S. Sartori, A. Zanzotto, P. Sancassani, A. Bertaccini, 1999.
Termoterapia per eliminare i fitoplasmi da vite. L’Informatore Agrario, 24,
47-51.
Caudwell A., J. Larrue, C. Valat, S. Grenan, 1990. Les traitements à l’eau chaude
des bois de vigne atteints de Flavescence dorée. Progrès Agricole et Viticole 107,
281-286.
Mannini F., N. Argamante, G. Gambino, A. Mollo, 2009. Phytoplasma diffusion
through grapevine propagation material and hot water treatment. Progrès
Agricole et Viticole, Hors Sèrie - Extended abstracts 16th Meeting of ICVG,
Dijon, France, 31 August - 4 September, 182-183.
Zorloni A., P. Casati, G. Durante, P.A. Bianco, G. Belli, 2008. Prove di risanamento,
tramite termoterapia, di talee di viti affette da giallumi: risultati preliminari.
Petria, 18(2), 319-321.
781
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
E’ POSSIBILE CONTROLLARE IL LEGNO NERO DELLA
VITE MEDIANTE L’APPLICAZIONE DI INDUTTORI DI
RESISTENZA? RISULTATI DI 4 ANNI DI TRATTAMENTI
IN CAMPO
G. Romanazzi1, S. Murolo1, E. Feliziani1, A. Masciulli1, F. Patrizio1,
M. Piergiacomi1, D. D’Ascenzo2
1
Dipartimento di Scienze Ambientali e delle Produzioni Vegetali
Università Politecnica delle Marche
Via Brecce Bianche, I-60131 Ancona
2
ARSSA Servizio Fitosanitario Regionale, Regione Abruzzo
Via Nazionale, 38, I-65012 Villanova (PE)
E-mail: [email protected]
Il Legno nero (LN) rappresenta la principale fitoplasmosi della vite nell’Italia
Centrale (Bianco et al., 2002; Barba et al., 2006). La malattia può causare gravi
perdite di produzione, soprattutto su varietà suscettibili come Chardonnay, ove la
maggior parte dei grappoli delle piante infette può andare incontro ad un precoce
disseccamento (Garau et al., 2007). Attualmente non sono disponibili validate
strategie per il controllo delle malattie da fitoplasmi. Tuttavia, è possibile adottare
un approccio integrato che si basa sull’uso di materiale di propagazione libero dal
patogeno e sulla riduzione delle sorgenti di inoculo nel vigneto (Borgo e Angelini,
2002; Maixner, 2006; Mori et al., 2008). Una strategia sperimentata di recente si
basa sulla stimolazione delle difese della pianta grazie al trattamento alla chioma con
induttori di resistenza (Prati et al., 2004; D’Amelio et al., 2007; Romanazzi et al.,
2009a). Tali applicazioni sono state sperimentate in vigneti commerciali della varietà
Chardonnay che presentavano un’elevata incidenza di piante con sintomi di LN in
Abruzzo e nelle Marche e hanno determinato un significativo incremento delle piante
recovered, nelle quali i sintomi sono scomparsi (Romanazzi et al., 2009).
Il vigneto è stato suddiviso secondo un disegno sperimentale di blocco
randomizzato ed i trattamenti sono stati applicati a singole piante che l’anno precedente
avevano mostrato sintomi di LN. Tra gli induttori di resistenza sono stati testati formulati
commerciali a base di chitosano (Chito Plant, ChiPro GmbH, Germania), FosetylAl (Aliette, Bayer Crop Science, Germania), due differenti miscele di glutatione e
oligosaccarine (Kendal, Valagro, Italia e Olivis, Agrisystem, Italia, rispettivamente),
e benzotiadiazolo (Bion, Syngenta Crop Protection, Svizzera). I prodotti sono stati
irrorati sulla vegetazione dall’inizio di maggio a fine luglio, distribuendo un volume
equivalente di 1000 litri/ha di ogni soluzione con una irroratrice a spalla a motore. Dal
rilievo visivo effettuato a metà agosto, tutti i trattamenti hanno incrementato il numero
di piante “recovered” nell’anno del trattamento rispetto al testimone non trattato.
Nei quattro anni di sperimentazione, nel complesso, i migliori risultati sono
782
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
stati ottenuti somministrando alle piante infette Kendal, Bion ed Olivis, mentre Aliette
e Chito Plant hanno fornito i risultati meno costanti nel tempo. L’analisi molecolare
effettuata su campioni fogliari di piante recovered non ha permesso il rilevamento di
fitoplasmi. Sebbene dati sperimentali non siano disponibili, un’induzione delle difese
dell’ospite sembra essere responsabile dell’efficacia di questi induttori di resistenza
nel controllo del LN della vite. Dopo quattro anni possiamo concludere che una
strategia integrata nel contenimento del Legno nero in vigneti fortemente infetti può
includere l’uso di induttori di resistenza. Ad ogni modo, ulteriori approfondimenti sono
indispensabili per determinare il numero ed il momento ottimale per le applicazioni.
Parole chiave: Recovery, Resistenza indotta, Vitis vinifera.
Is it possible to contain grapevine Bois noir by application of resistance
inducers?
Results of four years of field trials
Bois noir (BN) is the main phytoplasma disease of grapevine in central Italy
(Bianco et al., 2002; Barba et al., 2006). It can induce severe losses of production,
which mainly occur in sensitive cultivars like Chardonnay, where most of the clusters
of the infected plants can dry out before the harvest (Garau et al., 2007). To date, there
are no validated strategies to control phytoplasma diseases. However, it is possible to
adopt an integrated approach that involves use of pathogen-free propagating materials
and reduction in inoculum sources in the vineyard (Borgo and Angelini, 2002; Maixner,
2006; Mori et al., 2008). A novel approach to control phytoplasma diseases consists
of the exploitation of plant defences by the application of resistance inducers (Prati
et al., 2004; D’Amelio et al., 2007; Romanazzi et al., 2009a). These treatments have
been tested in commercial vineyards on cv Chardonnay with an initial high number
of plants with BN symptoms in the Abruzzi and Marche regions, central-eastern Italy.
Under these conditions, the application of resistance inducers promoted significant
increases in symptom remission, also known as recovery, in BN symptomatic plants
(Romanazzi et al., 2009).
The experimental vineyard was arranged in a randomised block design, and
treatments were applied to single plants showing disease symptoms in the previous
year. The tested resistance inducers included commercial products based on chitosan
(Chito Plant, ChiPro GmbH, Germany), Phosetyl-Al (Aliette, Bayer Crop Science,
Germany), two different mixtures of glutathione and oligosaccharines (Kendal,
Valagro, Italy, and Olivis, Agrisystem, Italy, respectively), and benzothiadiazole
(Bion, Syngenta Crop Protection, Switzerland). The compounds were sprayed on the
canopy of the plants weekly, from the beginning of May to the end of July. This
delivering the equivalent volume of the solution of 1,000 l/ha, using a motorized
backpack sprayer. All of the treatments increased the number of plants that did not
show disease symptoms in the year of the treatments, and which were thus termed
“recovered”, as compared to the untreated control.
783
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
Over the four-year experiment, the best results were obtained with Kendal,
Olivis and Bion, while Aliette and Chito Plant provided less constant results over the
years. Molecular analyses of leaf-vein extracts from the recovered plants failed to
detect the phytoplasma agent of BN. Although experimental data are not available,
an induction of the host defences is likely to be responsible for the effectiveness of
these resistance inducers in the control of grapevine BN. After four years of trials,
we can conclude that an integrated strategy for the containment of BN in vineyards
that are heavily infected can include the use of resistance inducers. However, further
investigations are needed to determine the optimal number and timing of these
resistance inducers applications.
Key words: Induced resistance, Recovery, Vitis vinifera.
Ringraziamenti/Acknowledgements
Si ringraziano il Dott. P. Biondini dell’Azienda Santa Casa di Loreto, Danilo
Coppa della Cooperativa Terre Cortesi Moncaro, Marco Pennacchioni e Giampaolo
D’Ercole per la disponibilità mostrata nelle indagini. Lavoro svolto nell’ambito dei
Progetti “Lotta alla Flavescenza dorata della Vite” promosso dalla Regione Abruzzo,
del PRIN 2005074429_002 “Indagini sul recovery in viti affette da Legno nero e
ricerca di mezzi innovativi per incrementare il fenomeno” e del progetto “Valutazione
dell’efficacia di trattamenti con elicitori nell’induzione del recovery in viti infette da
fitoplasmi e monitoraggio dell’attività enzimatica nelle piante (acronimo Varenne)”
svolto nell’ambito del bando 2007 nel campo dell’Ambiente promosso dalla
Fondazione Cariverona.
Lavori citati/References
Barba M., L. Ferretti, G. Pasquini, 2006. I giallumi della vite: un problema
fitosanitario di rilevanza nazionale. Informatore fitopatologico, 4, 4-8.
Bianco P.A., R. Osler, M. Barba, 2002. Grapevine yellows: evolution of the disease
since its appearance in Italy. Petria, 13, 399-404.
Borgo M., E. Angelini, 2002. Diffusion of grapevine Flavescence dorée in Italy and
influence of varieties, agronomic techniques and propagation material. Atti
Giornate Fitopatologiche, 1, 35-49.
D’amelio R., N. Massa, E. Gamalero, G. D’Agostino, S. Sampò, G. Berta, F. Faoro,
M. Iriti, D. Bosco, C. Marzachì, 2007. Preliminary results on the evaluation
of the effects of elicitors of plant resistance on Chrysanthemum yellows
phytoplasma infection. Bulletin of Insectology, 60(2), 317-318.
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Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
Garau R., V.A. Prota, A. Sechi, G. Moro, 2007. Applicazioni di biostimolanti su
Chardonnay e Vermentino affetti da “Legno nero” e loro influenza sul
recovery. In: Atti Convegno Nazionale “Nuove possibilità di lotta contro le
fitoplasmosi della vite e dei fruttiferi basate su recovery, resistenze indotte e
antagonisti”. Ancona, Italy, Settembre 17-18, 12-13.
Maixner, M., 2006. Temporal behaviour of grapevines infected by type II of
Vergilbungskrankheit (Bois noir). In: Extended Abstracts 15th Meeting of the
International Council for the Study of Virus and Virus-like Diseases of the
Grapevine. Stellenbosch, South Africa, April 3-7, 223-224.
Mori N., F Pavan, M. Bacchiavini, N. Reggiani, F. Bonomi, A. Bertaccini, 2008.
Fenologia di Hyalesthes obsoletus Signoret su convolvolo ed ortica. Petria,
18(2), 229-231.
Prati S., D. Maffi, C. Longoni, S. Chiesa, P.A. Bianco, S. Quaroni, 2004. Preliminary
study on the effects of two SAR inducers and prohexadione calcium on the
development of phytoplasmas in vinca. Journal of Plant Pathology, 87, 303.
Romanazzi G., D. D’Ascenzo, S. Murolo, 2009. Field treatment with resistance
inducers for the control of grapevine Bois noir. Journal of Plant Pathology,
91(3), 677-682.
Romanazzi G., R. Musetti, C. Marzachì, P. Casati, 2009a. Induction of resistance in
the control of phytoplasma diseases. Petria, 19, 113-119.
785
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
Indice per autori/Conference Author Index
Abdul-Nour H.
694
Abou-Jawdah Y
.694
Ács Z.
728
Alma A.
650-681-694-728-731
Anfora G.
746
Angeli G.
740
Angelini E.
767
Babini A.R.
667
Bacchiavini M.
737
Barba M.
664-762
Barcia M.
715
Battocletti I.
685
Bazzo I.
767
Bellardi M. G.
708
Bellotto D.
767
Bertazzon N.
767
Bertaccini A.
697-702-705-708-737
Bertin S.
728
Bianco P.A.
694-734-749-776-779
Biasi W.
743
Bisognin C.
675-678-685
Borgo M.
767
Borgogno Mondini E.
731
Boscaini L. D.
702
Bosco D.
722-728
Bottura M.
740
Bragagna P.
685
Bulgari D.
776
Cainelli C.
740
Capretti P.
715
Casati P.
694-776-779
Choueiri E.
694
Ciccotti A.M.
685
Colombo A.
779
Contaldo N.
697-702-705-708
Credi R.
699
Crepaldi P.
776
D’Ascenzo D.
782
Davino M.
697
Davino S.
697
De Feo V.
718
De Martino L.
718
Delvago C.
699
Deromedi M.
685
Dradi D.
667
El Amil R.
694
El Khoury R.
694
El Zammar S.
694
Endeshaw S.T.
755
Ermacora P.
670
Faggioli F.
762
Fakhr R.
694
Faraglia B.C.
725
Feliziani E.
782
Ferrarini A.
762
Ferretti L.
664
Ferrini F.
670
Filippi M.
685
Filippin L.
767
Foisac X.
772
Forte V.
767
Fuchs A.
673
Galetto L.
722
Garau R.
772
Geagea L.
694
Gelmetti A.
740
Geze N.
694
Grando M.S.
675-685
Gualandri V.
740
Haidar A.
694
Harzer U.
673
Isidoro N.
746
Jarausch B.
673
Jarausch W.
673-675-678
Jeffries C.
691
Lampe I.
673
Landi L.
758
Lanzoni C.
667
Lessio F.
731
Loi N.
670
786
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
Maacaroun R.
694
Mahfoud C.
694
Mancini E.
718
Mancini V.
715
Marcone C.
711-718-772
Margaria P.
765
Marini L.
705
Martini M.
670
Marzachì C.
722-769
Masciulli A.
782
Medoro C.
667
Minuz R. L.
746
Molino Lova M.
694
Mori N.
705-734-737-743-749
Mortada C.
694-702
Mosca G.
705
Moser M.
678
Mouannes E.
694
Mulholland V.
691
Murolo S.
687-752-755-772-782
Murri G.
687
Nardi S.
725
Nehme M.
694
Neri D.
755
Osler R.
670
Pacifico D.
722-769
Palmano S.
691-765
Paltrinieri S.
697-702-708-737
Paolini S.
667
Parisi N.
779
Pasini M.
702
Pasquini G.
664-762
Patrizio F.
782
Pavan F.
737-743
Pelizzaro V.
769
Peratoner C.
743
Perini M.
694
Picciau L.
694-728-769
Piergiacomi M.
752-782
Pizzinat A.
681
Poggi Pollini C.
667
Prota V.
772
Punelli F.
762
Quaglino F.
734-749-776
Rampin E.
705
Ratti C.
667
Reggiani N.
737
Riolo P.
746
Romanazzi G.687-752-755-758-772-782
Romani R.
746
Rossi Stacconi M. V.
746
Rossini E.
725
Saccò S.
699
Saddler G.S.
691
Sakr W.
694
Santini A.
715
Schneider B.
675
Seemüller E.
675
Sobh H.
694
Stringher L.
767
Tedeschi R.
650-681-694
Terlizzi F.
699
Tessari F.
734
Testi V.
699
Tonesi R.
779
Uva P.
762
Velasco R.
675-678
Vercesi A.
694
Zambini R.
699
Zanetti F.
705
Zanini G.
734-749
Zasso R.
740
Zorloni A.
734-749-776-779
787
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
Elenco dei partecipanti al Convegno/Meeting participants
Abou jawdah Youssef
Faculty of Agricultural
and Food Sciences (FAFS),
American University of Beirut
P.O. Box 11-0236, Beirut,
Lebanon
e-mail: [email protected]
Alma Alberto
Di.Va.P.R.A. Entomologia
e Zoologia applicate
all’Ambiente “Carlo Vidano”,
Università degli Studi di
Torino, Via L. da Vinci, 44,
I-10095 Grugliasco (TO)
Tel: 011-6708534
Fax: 011-6708535
e-mail: [email protected]
Angelini Elisa
CRA – Centro di Ricerca per
la Viticoltura
Viale Aprile XXVIII, 26,
I-31015 Conegliano (TV)
Tel: 0438-456716
Fax: 043864779
e-mail: [email protected]
Ballarini Stefano
Università Politecnica delle
Marche, Facoltà di Agraria,
Via Brecce Bianche, I-60131
Ancona
e-mail: ballarini­_stefano@
tiscali.it
Barba Marina
CRA – Centro di Ricerca per
la Patologia Vegetale, Via
C.G. Bertero, 22, I-00156
(RM)
Tel: 06-82070244
Fax: 06-82070243
e-mail: marina.barba@entecra.
it
Bertaccini Assunta
Dipartimento di Scienze e
Tecnologie Agroambientali
(DiSTA), Patologia Vegetale,
Alma Mater Studiorum,
Università di Bologna, Viale
Fanin, 42, I-40127 Bologna
Tel: 051-2096723
Fax: 051-2096723
e-mail: bertaccini_a@biblio.
cib.unibo.it
Bertin Sabrina
Di.Va.P.R.A. Entomologia
e Zoologia applicate
all’Ambiente “Carlo Vidano”,
Università degli Studi di
Torino, Via L. da Vinci, 44,
I-10095 Grugliasco (TO)
Tel: 011-6708529
Fax: 011-6708535
e-mail: [email protected]
Bianco Piero Attilio
Dipartimento di Produzione
Vegetale-sezione Patologia
Vegetale, Università di
Milano, Via Celoria , 2,
I-20100 Milano
Tel: 0250316784
e-mail: [email protected]
Bisognin Claudia
Istituto Agrario San Michele
all’Adige, Fondazione E.
Mach Centro Sperimentale
788
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
Via Mach, 1, I-38010 San
Michele all’Adige (TN)
Tel: 0461-615399372
Fax: 0461-650956
e-mail: claudia.bisognin@
iasma.it
Casati Paola
Dipartimento di Produzione
Vegetale-sezione Patologia
Vegetale, Università di
Milano, Via Celoria , 2,
I-20100 Milano
Tel: 0250316793
Fax: 0250316781
e-mail: [email protected]
Bissani Rita
CAV – Centro Attività
Vivaistiche, Via Tebano, 145,
I-48018 Faenza (RA)
Tel: 0546-47098
Fax: 0546-47189
e-mail: [email protected]
Ciccotti Anna Maria
Fondazione Edmund Mach, Via
Mach, 1, I-38010 San Michele
All’Adige (TN)
Fax: 0461-615500
e-mail: annamaria.ciccotti@
iasma.it
Braccini Piero
Arsia Regione Toscana, Via
Pietrapiana, 30, I-50121,
Firenze
Tel: 0552755212
e-mail: piero.braccini@arsia.
toscana.it
Choueiri Elia
Lebanese Agricultural
Research Institute, Tal
Amara, Rayak, PO Box 287,
Zahlé, Lebanon
e-mail: [email protected]
Bulgari Daniela
Dipartimento di Produzione
Vegetale-sezione Patologia
Vegetale, Università di
Milano, Via Celoria, 2,
I-20133 Milano
Tel: 0250316789
Fax: 0250316781
e-mail: daniela.bulgari@unimi.
it
Coppa Danilo
Terre Cortesi Moncaro,
I-60036 Montecarotto (AN)
Tel: 0731-81245
Fax: 0731-89237
e-mail: [email protected]
Cainelli Christian
Fondazione Edmund Mach, Via
Mach, 1, I-38010 San Michele
All’Adige (TN)
Tel: 0461-615513
Fax: 0461-615500
e-mail: christian.cainelli@
iasma.it
Conti Maurizio
Istituto di Virologia Vegetale,
CNR, Strada delle Cacce, 73,
I-10135 Torino
Tel: 011 3977937
Fax: 011 343809
e-mail: [email protected]
Credi Rino
DiSTA, Dipartimento di Scienze
e Tecnologie Agroambientali,
789
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
Università di Bologna
Viale Fanin, 40, I-40127
Bologna
Tel: 051-2096739
Fax: 051-2096237
e-mail: [email protected]
3929097852 Fax: 0039 03714662523
e-mail: [email protected]
D’Ascenzo Domenico
ARSSA, Servizio Fitosanitario
Regionale, Regione Abruzzo,
Via Nazionale, 38, I-65010
Villanova di Cepagatti (PE)
e-mail: d.dascenzo@arssa-mail.
it
D’Ercole Giampaolo
Università Politecnica delle
Marche, Facoltà di Agraria,
Via Brecce Bianche, I-60131
Ancona
e-mail: giampy­[email protected]
D’Anniballe Assunta
Servizio Fitosanitario
Regionale, Regione Emilia
Romagna
e-mail:adanniballe@regione.
emilia-romagna.it
Endeshaw Solomon Tadesse
Dipartimento di Scienze
Ambientali e delle Produzioni
Vegetali, Università
Politecnica delle Marche,
Via Brecce Bianche, I-60131
Ancona
Tel: 3273591681
e-mail: [email protected]
Ermacora Paolo
Dipartimento di Biologia
e Protezione delle Piante,
Università di Udine,
Via delle Scienze, 208, I-33100
Udine
Tel: 0432-558540
Fax: 0432-558501
e-mail: paolo.ermacora@uniud.
it
Feliziani Erica
Dipartimento di Scienze
Ambientali e delle Produzioni
Vegetali, Università
Politecnica delle Marche,
Via Brecce Bianche, I-60131
Ancona
e-mail: [email protected]
Di Nella Nicola
Dipartimento di Scienze
Ambientali e delle Produzioni
Vegetali, Università
Politecnica delle Marche, Via
Brecce Bianche, I-60131 (AN)
e-mail: nicola.dinella@gmail.
com
Durante Giuseppe
International Plant Analysis
and Diagnostics srl
Via Einstein, Località Cascina
Codazza, I-26900 Lodi
Tel: 0039 037146621/0039
Ferretti Luca
CRA– Centro di Ricerca per
la Patologia Vegetale, Via C.
G. Bertero, 22, I-00156 Roma
Tel: 06-82070223
Fax: 06-82070246
e-mail: [email protected]
790
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
Filippin Luisa
CRA – Centro di Ricerca per
la Viticoltura
Viale Aprile XXVIII, 26,
I-31015 Conegliano (TV)
Tel: 0438-456710
Fax: 0438-450773
e-mail: [email protected]
Fini Paolo
Regione Emilia Romagna,
Servizio Fitosanitario, Via
di Corticella, 133, I-40138
Bologna
Tel: 051-5278226
Fax: 051-370285
e-mail: [email protected]
Gelmetti alberto
Fondazione Edmund Mach, Via
Frumento, 5, I-38062 Trento
Tel: 3356519375
Fax: 0464-518709
e-mail: [email protected]
Gentili Andrea
CRA– Centro di Ricerca per
la Patologia Vegetale, Via C.
G. Bertero, 22, I-00156 Roma
Tel: 06-82070221
Fax: 06-82070246
e-mail: [email protected]
Gianinazzi Camilo
International Plant Analysis
and Diagnostics srl
Via Einstein, Località Cascina
Codazza, I-26900 Lodi
Tel: 0039 037146621/0039
3929097852 Fax: 0039 03714662523
e-mail: [email protected]
Grillini Patrizia
Servizio Fitosanitario Regione
Emilia-Romagna, Sede tecnica
Via di Corticella, 133, I-40129
Bologna
Tel: 328-3804545
Fax: 051-4159277
e-mail:pgrillini@regione.
emilia-romagna.it
Isidoro Nunzio
Dipartimento di Scienze
Ambientali e delle Produzioni
Vegetali, Università
Politecnica delle Marche,
Via Brecce Bianche , I-60131
Ancona
Tel: 071-2204639
Fax: 071-2204856
e-mail: [email protected]
Jarausch Barbara
AlPlanta-IPR, RLP
Agroscience, Breitenweg, 71,
Neustadt, Germany
Tel/Fax: 0049 6321/6711308
e-mail: barbara.jarausch@
agroscience.rlp.de
Jarausch Wolfgang
AlPlanta-IPR, RLP
Agroscience, Breitenweg, 71,
Neustadt, Germany
Tel/Fax: 0049 6321/6711307
e-mail: wolfgang.jarausch@
agroscience.rlp.de
Landi Lucia
Dipartimento di Scienze
Ambientali e delle Produzioni
Vegetali, Università
Politecnica delle Marche,
Via Brecce Bianche, I-60131
791
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
Ancona
Tel: 071-2204871
Fax: 071-2204856
e-mail: [email protected]
Mezzetti Bruno
Dipartimento di Scienze
Ambientali e delle Produzioni
Vegetali, Università
Politecnica delle Marche,
Via Brecce Bianche, I-60131
Ancona
Tel: 071-2204933 e-mail: [email protected]
Lessio Federico
Di.Va.P.R.A. Entomologia
e Zoologia applicate
all’Ambiente “Carlo Vidano”,
Università degli Studi di
Torino, Via L. da Vinci, 44,
I-10095 Grugliasco (TO)
Tel: 011-6708677
Fax: 011-6708535
e-mail: [email protected]
Mancini Valeria
Dipartimento di Biotecnologie
Agrarie, Università di Firenze,
Piazzale Cascine, 28, I-50144
Firenze
Tel/Fax: 0553288275
e-mail: [email protected]
Marcone Carmine
Dipartimento di Scienze
Farmaceutiche, Università
degli Studi di Salerno,
Via Ponte Don Melillo,
I-84084 Fisciano (SA)
Tel: 089-962813
Fax: 089-969602
e-mail: [email protected]
Masciulli Alessio
Dipartimento di Scienze
Ambientali e delle Produzioni
Vegetali, Università
Politecnica delle Marche,
Via Brecce Bianche, I-60131
Ancona
e-mail: alessio.masciulli@
libero.it
Minuz Roxana Luisa
Dipartimento di Scienze
Ambientali e delle Produzioni
Vegetali, Università
Politecnica delle Marche,
Via Brecce Bianche, I-60131
Ancona
e-mail: [email protected]
Mori Nicola
Dipartimento di Agronomia
ambientale e Produzioni
vegetali – Sezione
Entomologia, Università di
Padova
Viale dell’Università, 16,
I-35020 Legnaro (PD)
e-mail: [email protected]
Moser Mirko
AlPlanta Agroscience GmbH,
Breitenweg, 71, Neustadt,
Germany
Tel/Fax: 0049 6321/6711309
e-mail: mirko.moser@
agroscience.rlp.de
Murolo Sergio
Dipartimento di Scienze
Ambientali e delle Produzioni
Vegetali, Università
Politecnica delle Marche,
Via Brecce Bianche, I-60131
792
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
Ancona
Tel: 071-2204697
Fax: 071-2204856
e-mail: [email protected]
Pacifico Davide
CNR- Istituto di Virologia
Vegetale, Strada delle Cacce,
73, I-10135 Torino
Tel: 011-3977929
Fax: 011 - 343809
e-mail: [email protected]
Murri Giorgio
Dipartimento di Scienze
Ambientali e delle Produzioni
Vegetali, Università
Politecnica delle Marche,
Via Brecce Bianche, I-60131
Ancona
e-mail: [email protected]
Palmano Sabrina
Istituto di Virologia Vegetale,
CNR, Strada delle Cacce, 73,
I-10135 Torino
Tel: 011-3977929
Fax: 011-343809
e-mail: [email protected]
Nardi Sandro
ASSAM, Servizio
Fitosanitario, Regione
Marche, Via Alpi, 21, I-60131
Ancona
Tel: 071-808334
Fax: 071-85979
e-mail: nardi_sandro@assam.
marche.it
Patrizio Federico
Dipartimento di Scienze
Ambientali e delle Produzioni
Vegetali, Università
Politecnica delle Marche,
Via Brecce Bianche, I-60131
Ancona
e-mail: [email protected]
Neri Davide
Dipartimento di Scienze
Ambientali e delle Produzioni
Vegetali, Università
Politecnica delle Marche,
Via Brecce Bianche, I-60131
Ancona
Tel: 071-2204431
Fax: 071-2204856
e-mail: [email protected]
Pasquini Graziella
CRA - Centro di Ricerca per
la Patologia Vegetale, Via C.
G. Bertero, 22, I-00156 Roma
Tel: 06-82070221
Fax: 06-82070246
e-mail: graziella.pasquini@
entecra.it
Osler Ruggero
Dip. Biologia e Protezione
delle Piante, Università degli
Studi di Udine
Via Palladio, 8, I-33100 Udine
Tel: 0432-558500
Fax: 0432-558501
e-mail: [email protected]
Pastore Maria
CRA - Unità di ricerca per la
Fruticoltura
di Caserta - CRA, Via Torrino,
3, I- 81100 (CS)
Tel: 0832-256240
Fax: 0823-493381
e-mail: [email protected]
793
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
Pavan Francesco
Dipartimento di Biologia
e Protezione delle Piante,
Università di Udine
Via delle Scienze, 208,
I-33100 Udine
Tel: 0432-558503
Fax: 0432-558501
e-mail: francesco.pavan@
uniud.it
Piergiacomi Mauro
Dipartimento di Scienze
Ambientali e delle Produzioni
Vegetali, Università
Politecnica delle Marche,
Via Brecce Bianche, I-60131
Ancona
e-mail: [email protected]
Piunti Alfredo
PBE SRL Via Bore TEsino, 4,
I-63013 Grottammare (AP)
Tel: 0735-631227
Fax: 0735-632150
e-mail: [email protected]
Pizzichini Laura
Assam, Servizio Fitosanitario,
Regione Marche, Via Alpi, 21,
I-60131 Ancona
Tel: 071-808231
Fax: 071-85979
e-mail: pizzichini_laura@
assam.marche.it
Pizzinat Alan
Di.Va.P.R.A. Entomologia
e Zoologia applicate
all’Ambiente “Carlo Vidano”,
Università degli Studi di
Torino, Via L. da Vinci, 44,
I-10095 Grugliasco (TO)
Tel/Fax: 011-6708535
e-mail: [email protected]
Poggi Pollini Carlo
Dipartimento di Scienze e
Tecnologie Agroambientali
(DISTA), Università di
Bologna
Viale Fanin, 44, I-40127
Bologna
Tel: 051-2096725
Fax: 051-2096237
e-mail: carlo.poggipollini@
unibo.it
Prota Vanda
Dipartimento di Protezione
delle piante, Università degli
Studi di Sassari
Via E. de Nicola, 1, I-07100
Sassari
Tel: 079-229297
Fax: 079-229316
e-mail: [email protected]
Punelli Federico
CRA - Centro di Ricerca per
la Patologia Vegetale, Via C.
G. Bertero, 22, I-00156 Roma
Tel: 06-82070221
Fax: 06-82070246
e-mail: graziella.pasquini@
entecra.it
Quaglino Fabio
Dipartimento di Produzione
Vegetale - Sezione Patologia
Vegetale, Università di
Milano, Via Celoria , 2,
I-20100 Milano
Tel: 02-50316789
e-mail: fabio.quaglino@unimi.
it
Reggiani Nazareno
794
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Italian National Metting on Phytoplasma Diseases ”
Università degli Studi di
Modena e Reggio Emilia, Via
Santi, 14, I-41123 Modena
Tel: 333-6700472
Fax: 059-221877
e-mail: nreggiani@regione.
emilia-romagna.it
Vegetali, Facoltà di Agraria,
Università Politecnica delle
Marche, Via Brecce Bianche,
I-60131 (AN)
e-mail: [email protected]
Silvestroni Oriana
Dipartimento di Scienze
Ambientali e delle Produzioni
Vegetali, Università
Politecnica delle Marche,
Via Brecce Bianche, I-60131
Ancona
e-mail: [email protected]
Riolo Paola
Dipartimento di Scienze
Ambientali e delle Produzioni
Vegetali, Università
Politecnica delle Marche,
Via Brecce Bianche , I-60131
Ancona
Tel: 071-2204954
Fax: 071-2204856
e-mail: [email protected]
Romanazzi Gianfranco
Dipartimento di Scienze
Ambientali e delle Produzioni
Vegetali, Università
Politecnica delle Marche,
Via Brecce Bianche, I-60131
Ancona
Tel: 071-2204336
Fax: 071-2204856
e-mail: [email protected]
Rossini Elena
ASSAM, Servizio
Fitosanitario, Regione
Marche, Via Alpi, 21, I-60131
Ancona
Tel: 071-808231
Fax: 071-85979
e-mail: rossini_elena@assam.
marche.it
Santilocchi Rodolfo
Dipartimento di Scienze
Ambientali e delle Produzioni
Tedeschi Rosmarie
Di.Va.P.R.A. Entomologia
e Zoologia applicate
all’Ambiente “Carlo Vidano”,
Università di Torino, Via L. da
Vinci, 44, I-10095 Grugliasco
(TO)
Tel: 011-6708675
Fax: 011-2368675
e-mail: rosemarie.tedeschi@
unito.it
Vicchi Valerio
Servizio Fitosanitario Regione
Emilia-Romagna
Via di Corticella, 133, I-40129
Bologna
Tel: 328-3804545
Fax: 051-4159277
e-mail: vvicchi@regione.
emilia-romagna.it
Zorloni Anna
Dipartimento di Produzione
Vegetale - Sezione Patologia
Vegetale,Università di
Milano, Via Celoria 2, I-20133
Milano
795
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
Tel: 02-50316787
e-mail: [email protected]
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
NOTE
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”
Petria 20 (3), 635-802 (2010) –“V Incontro Nazionale sulle Malattie da Fitoplasmi”