LA FISIOPATOLOGIA DEL DIFETTO EMOPOIETICO
NELL’ANEMIA DI FANCONI
CARLO DUFOUR
XXIII CONGRESSO AIEOP
ABANO, 22-24 ottobre 2006
ANEMIA DI FANCONI

AUTOSOMICA-RECESSIVA e X-LINKED
Grande eterogeneità clinico-biologica

Ca 1200 casi descritti in letteratura. M/F ratio = 1.3/1
 Prevalenza 1- 5 / milione

Frequenza Eterozigote
1:300 (USA - Europa)
1:100 (Sud Africa)
13 Geni Identificati (A, B, C, D1, D2/BRCA1,E,F,G,J,L, M, PALB2,)
FENOTIPO CLINICO

Aumentata fragilità cromosomica spontanea e
indotta da alchilanti bifunzionali (DEB, MMC).

Anomalie Somatiche
 Suscettibilità ai Tumori
 Insufficienza Midollare Progressiva
ANOMALIE SOMATICHE
1207 PAZIENTI
Cute
Bassa Statura
Anomalie arti superiori
Ipogonadismo
Ipogonadismo
Testa
Occhio
Reni
Ritardo di sviluppo
Peso nascita 2500
Orecchio
60%
57%
48%
37%
3%
27%
26%
23%
13%
12%
10%
Anomalie arti inferiori
Ipereflessia
Altre anomalie scheletro
Anomalie cardio-polmonari
Anomalie gastro-intestinali
Altre
8%
7%
6%
6%
4%
5%
Anomalie assenti o non riferite 25%
Solo bassa statura
1%
Solo cute
3%
Cute + bassa statura
4%
Bassa statura e/o cute
8%
----------Normali/ quasi normali
25-41%
SUSCETTIBILITA‘ ai TUMORI
 Incidenza globale > 15%. (leucemia, K cell squamose
testa, collo, esofago, MDS, encefalo, Wilms, ginecolocici).
 25% of casi SENZA aplasia precedente.
 Il tumore può essere la sola manifestazione della AF
 Femmine più colpite dei maschi per tumori solidi
(anche se NON si considerano i tumori ginecologici).
Gene FANCB ?
SUSCETTIBILITA‘ ai TUMORI
 Pazienti FANCD1/BRCA2 hanno altissima incidenza di cancro.
Più di un tumore/paziente sotto i 5 anni di vita
 Problema emergente dato l‘attuale miglioramento
dei risultati del TMO sull‘aplasia.
INSUFFICIENZA MIDOLLARE PROGRESSIVA
Principale causa di morbilità e mortalità
Trombocitopenia
Anemia
APLASIA
Neutropenia
5 anni
10 anni
AUMENTO MCV
HbF e
Ag i
Possono anticipare la citopenia
eritrocitario
Clone citogenetico in circa 30% dei pazienti
Anomalie radio rischio 5.5 volte maggiore di insuff midollare
Rischio  anche per malformazioni cuore, rene testa, udito
EVOLUZIONE A MDS/LA
 Non è „automatica“ l‘evoluzione di MDS a LA
Le anomalie citogentiche possono fluttuare
 Più spesso associata a monosomia cr 7 e iso cromosoma
1q
 Gain di 3q indica maggior rischio che MDS morfologica
progredisca a LMA (Tonnies, Blood 2003)
 La morfologia rimane un importante marcatore di
evoluzione verso MDS/AL
ANEMIA DI FANCONI. PERCHE‘
1. Malattia precancerosa
Il pathway FA è inattivato (FANCF) in varie neoplasie (ovaio,
polmone, testicolo, utero)
e in LMA (FANCA).
Se il pathway FA è integro (non è FA) linee cellulari di K
ovarico acquisiscono resistenza al Cisplatino.
Taniguchi et al Nat med, 2003;9:568-574 .
2. Modello per evoluzione leucemica
3. Modello per insufficienza midollare
EVOLUZIONE A MDS/LEUCEMIA
1. TNF- e infiammazione hanno azione pro-leucemogenica.
2. Questa azione avviene tramite la produzione di ossidanti che
causano instabiità genomica.
3. Anti infiammatori, anti-TNF- ed anti ossidanti possono avere
un ruolo anti leucemogenico.
INSUFFICIENZA MIDOLLARE
Dove è il problema?
La cellula staminale ematopoietica
presenta una esagerata
risposta apoptotica a stimoli esogeni
Rio. P & Bueren J. Blood 2002 Sep 15;100(6):2032-9.
Aube M & Careau M; Stem Cells; 2002;20 (5):438-47.
Habi O, & Carreau M, Stem Cells 2005, Jul 14; ahead of print)
Quali stimoli esogeni?
Come agiscono?
STIMOLI ESOGENI 1
Citochine Mielosoppressive
1. TNF- è aumentato nel siero dei patienti FA
Shultz JC, Am J Hematol, 1993;42:196-201. Rosselli F, 1994; 83:-1225.
2.IFN- and TNF- sono „over-expressi“ nelle MNCs midollari
stimolate dei pazienti FA
Dufour C et al, Blood 2003;102:2053-2059 .
INTRACYTOPLASMIC EXPRESSION OF
TNF-, IFN-, MIP-1 , FASL IN MARROW
MNCs OF FA PATIENTS
FA Patients
Mean (SD) Median
Min-Max
Controls
Mean (SD) Median Min- Mix
P
TNF -  +
CD3+% TNF -  +
CD3+ MRFI TNF -  +
CD3- % TNF -  +
CD3- MRFI TNF -  +
9.57(8.68)
3.71(3.09)
6.29(6.57)
1.86(0.90)
7
2
4
2
0-21
1-8
0-19
1-3
0.00(0.00)
1.00(0.00)
0.50(0.53)
1.06(0.18)
0
1
0.5
1
0-0
1-1
0-1
1-1.5
0.006
0.006
0.016
0.045
CD3+%  - IFN
CD3+MRFI  - IFN
CD3-%  - IFN
CD3-MRFI  - IFN
8.57(7.91)
2.29(1.25)
5.57(7.07)
2.00(2.65)
9
2
3
1
0-20
1- 4
0-20
1-8
0.25(0.71)
1.12(0.35)
0.37(0.7)
1.00(0.00)
0
1
0
1
0-2
1-2
0-2
1-1
0.013
0.021
0.014
CD3+% FASL
CD3-%FASL
CD3+ MIPA1- 
CD3-%MIPA1- 
0.00(0.00)
0.00(0.00)
0.00(0.00)
0.00(0.00)
0
0
0
0
0-0
0-0
0-0
0-0
0.00(0.00)
0.00(0.00)
0.00(0.00)
0.00(0.00)
0
0
0
0
0-0
0-0
0-0
0-0
IFN -
Dufour C et al, Blood 2003
STIMOLI ESOGENI 2
Citochine Mielosopressive
3. IFN-, TNF-, MIP 1- , FAS L nei topi FANCC fanno
morire i progenitori ematopoietici per eccesso di apoptosi.
Rathbun RK, Blood 1997,90:974-985, Whitney MA, Blood 1996;88:49-58, Haneline L, Blood,1998;91:4092-4098, Otsuki T, J Cell Physiol,
1999;179:79-86
4. TNF- è dannoso per le cellule eritropoietiche primarie
in vitro
Dufour C et al, Blood 2003;102:2053-2059
BLOCCO DI TNF- IN VITRO. EFFETTO
SULLA CRESCITA ERITROIDE di PAZIENTI FA
A
Controls
Patients
P 0.043
CFU-e
B
Patients
CFU-e
Controls
P 0.043
BFU-e
BFU-e
Dufour et al , Blood 03
STIMOLI ESOGENI 3
Citochine Mielosopressive
3. IFN-, TNF-, MIP 1-  nei topi FANCC fanno morire i
progenitori ematopoietici per eccesso di apoptosi.
Rathbun RK, Blood 1997,90:974-985, Whitney MA, Blood 1996;88:49-58, Haneline L, Blood,1998;91:4092-4098, Otsuki T, J
Cell Physiol, 1999;179:79-86
4. TNF- è dannoso per le cellule eritropoietiche in vitro
Dufour C et al, Blood 2003;102:2053-2059
5. TRAIL induce apoptosi in line cellulari linfobastoidi FANCA
APOPTOSI (Tunel)
Apoptosis was evaluated at single cell level by TUNEL in situ technique. The TUNEL reaction preferentially
labels DNA strand breaks generated during apoptosis. This allows discrimination of apoptosis from necrosis.
FANCA
CORRETTA
HSC072
medium
+ Trail
HSC072FAA
medium
+ Trail
Microscopic images of TUNEL positive nuclei: apoptotic cells with fragmented DNA are stained bright green,
non-apoptotic cells are stained blue with DAPI (magnification 20X).
APOPTOSI indotta da TRAIL
% increment AnnexinV+ cells
240
FANCA
CORRETTA
HSC072
HSC072FAA
FANCA
CORRETTA
HSC072
HSC072FAA
240
* p 0.023
+ p 0.023
200
200
*
160
160
+
120
120
80
80
40
40
4h
16h
Cell lines were cultured in the presence or absence of 100 ng/ml Superkiller TRAIL and apoptosis was measured at 4, 16hours in culture by staining cells with
fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated annexin V.
Flow cytometric results are expressed as median, maximum and minimum levels of percent increment Annexin V+ cells from seven experiments.
STIMOLI ESOGENI 4
Agenti Ossidanti
6. L‘alternanza di IPOSSIA-RIOSSIGENAZIONE dà morte
prematura nelle cellule ematopoietiche midollari FANCC (-/-)„
segnalando“ via p53 e up-regulando p 21 (Zhang X, Blood Jul 1;106 (1):75-85) 2005).
7.H2O2 induce morte nelle cellule FANCC-/- (Bagby and Alter, Semin
Hematol,2006, 4,5 147-156).
COME
AGISCE
TNF-
1. Nei progenitori ematopoietici dei topi FANCC e
FANCA, TNF- induce apoptosi via ROS
L’antiossidante Se Met corregge l’apoptosi nei progenitori
ematopoietici dei topi FANCA (-/-) esposti a TNF-.
Vishehsaraei KM et al Blood on line Aug 18, 2005
COME AGISCE TNF-
1. Nei progenitori ematopoietici dei topi FANCC e
FANCA, TNF- induce apoptosis via ROS
2. Questo effetto è ASK1 e p38 dipendente
ASK-1(Apoptosis Signal Regulating Kinase 1)
E’una kinasi ad azione pro-apoptotica.
NO ASK = NO APOPTOSI
WT
FANCC(-/-); ASK1(-/-)
Dopo esposizione a TNF- i
progenitori ematopoietici di topi
FANCC(-/-); ASK1(-/-) crescono a livello WT
p38 è una protein kinasi
“downstreamed” rispetto
ad ASK-1 nella cascata
apoptotica attivata dai ROS.
WT FANCA
Inibizione di p38 corregge l’apoptosi dei progenitori
ematopoietici FANCA(-/-) a livello WT.
Vishehsaraei KM et al Blood on line Aug 18, 2005
COME AGISCONO TNF- e IFN -
4.L‘ effetto negativo di TNF- e IFN- sui progenitori
ematopoietici del topo FANCC è mediato da NO
WT
WT
FANCC
FANCC
L’esposizione a dosi crescenti
di IFN- riduce il numero medio di
colonie maggiormente
in FANCC(-/-) che in WT
Il Blocco della produzione di NO
riporta la crescta dei progenitori FANCC
(-/-) a livello di WT dopo esposizione
a IFN-
Hadjur S., Blood 2003 May 15;101 (10):3877-84
SOMMARIO
Le citochine mielosoppressive (TNF-,IFN-) e gli agenti
ossidanti (H2O2) agiscono attraverso differenti mediatori
intracellulari (ROS, NO, ASK-1, p38,STATs, PKR/Hsp70).
Tutti comunque conducono la cellula ematopoietica
all’apoptosi.
SOMMARIO
TNF-
IFN-
H2O2
ASK 1
P38
NO
PKR
Hsp70
STATs
APOPTOSI
CELLULA EMOPOIETICA
FANCONI
INSUFFICIENZA
MIDOLLARE
IMPLICAZIONI CLINICHE
STUDIO PILOTA MULTICENTRICO CON
ANTI-TNF-α
TNF-
IN PAZIENTI CON:
1. FANCONI ANEMIA con INSUFFICIENZA MIDOLLARE SENZA
DONATORE COMPATIBILE DI MIDOLLO OSSEO
2. ANEMIA APLASTICA ACQUISITA RESISTENTE
importante
nell’apoptosi
delle cellule
emopoietiche FA
ALL’IMMUNOSOPPRSSIONE E
SENZA DONATORE COMPATIBILE DI MIDOLLO OSSEO
Coordinatore
Carlo Dufour
Unità di Ematologia. ISTITUTO G.GASLINI,
Largo G.Gaslini 5. 16147 Genova.
tel ++ 39 010 5636694
Fax ++39 010 5636714; e-mail:
carlodufour@ospedale-
gaslini.ge.it
Approvazione Comitato di Etica, Ist. Gaslini. 2 dic 2004