BEIA MUMPS IgM Mab
Capture
20943
Edizione
20-04-2013
Solo per uso professionale
TECHNOGENETICS SRL
N° 00519
Pag. 1 - 24 BEIA Mumps IgM Mab Capture Ed. 20-04-2013
INTRODUZIONE
Il kit BEIA Mumps IgM Mab Capture è un test immunoenzimatico
qualitativo (ELISA) per il dosaggio nel siero o nel plasma degli anticorpi di
classe IgM specifici verso l’antigene Mumps (Parotite) virus.
SIGNIFICATO CLINICO
Il Virus della Parotite appartiene alla famiglia Paramyxoviridae e
rappresenta l'agente eziologico che provoca nell’uomo infezioni
virali caratterizzate da: mal di testa, anoressia, malessere
generalizzato e da febbre. Questi sintomi precedono l’infezione delle
ghiandole salivari (parotidi) e del loro relativo ingrossamento.
Il virus della Parotite è inoltre coinvolto in complicazioni quali:
infiammazione
testicolare,
infiammazione
delle
ovaie,
meningoencefalite, pancreatite.
La rilevazione degli anticorpi IgM anti-Parotite consente di
diagnosticare la fase attiva dell'infezione.
PRINCIPIO DEL METODO
Il test BEIA Mumps IgM Mab Capture è un dosaggio ELISA basato
sulla tecnica “a cattura”. I campioni da esaminare vengono incubati
nei micropozzetti sensibilizzati con anticorpi anti-IgM umane. Le
IgM del campione vengono catturate dagli anticorpi presenti sulla
fase solida.
Dopo eliminazione mediante lavaggio dei componenti del siero non
legati alla fase solida, la presenza di IgM anti-Mumps viene rilevata
attraverso il legame con un complesso costituito da antigene
Mumps-anticorpo monoclonale anti-Mumps-anticorpo anti-IgG di
topo coniugato con perossidasi.
Dopo allontanamento del complesso non legato viene aggiunto il
Substrato-TMB che, per azione dell’enzima presente sulla fase
solida, sviluppa una colorazione azzurra.
L’aggiunta di una soluzione di acido solforico 1N blocca la reazione
e provoca il viraggio del colore dall’azzurro al giallo.
Pag. 2 - 24 BEIA Mumps IgM Mab Capture Ed. 20-04-2013
La densità ottica letta a 450/620 è direttamente proporzionale alla
quantità di IgM specifiche presenti nel campione in esame.
CONTENUTO DELLA CONFEZIONE
La confezione è sufficiente per 96 determinazioni.
Componente
SORB
A
Strip da 8 micropozzetti frazionabili
12x8x1
CONTROL
-
B
Controllo Negativo
1 x 2 mL
CAL
CO
C
Calibratore Cut-Off
1 x 2 mL
CONTROL
+
D
Controlo Positivo
1 x 2 mL
E
Diluente Campioni BEIA System
1 x 120 mL
F
Complesso
1 x 6 vials
G
Diluente Complesso
1 x 22 mL
H
Coniugato
1 x 0.5 mL
DIL
SPE
COMP
DIL
COMP
CONJ
BUF
WASH 20X
I
Tampone di Lavaggio
1 x 100 mL
SUBS
TMB
J
Substrato-TMB
1 x 13,5 mL
K
Soluzione Stoppante
1 x 25 mL
Istruzioni per l’uso
1
H2SO4
A.
B.
C.
Strip sensibilizzate
Strip sensibilizzate con anticorpi di capra anti-IgM umane, in
busta ermetica richiudibile. Riporre le strip non utilizzate nella
busta e richiudere.
Le strip sono frazionabili in pozzetti
singoli.
Controllo Negativo
Siero umano negativo per anticorpi IgM anti-Mumps.
Contiene 0,09% p/p di sodio azide come conservante. Reagente
pronto all'uso.
Calibratore Cut-off
Siero umano a concentrazione nota di anticorpi IgM antiMumps. Contiene 0,09% p/p di sodio azide come conservante.
Reagente pronto all’uso.
Pag. 3 - 24 BEIA Mumps IgM Mab Capture Ed. 20-04-2013
D.
E.
F.
G.
H.
I.
J.
K.
Controllo Positivo
Siero umano positivo per anticorpi IgM anti-Mumps. Contiene
0,09% p/p di sodio azide come conservante. Reagente pronto
all'uso.
Diluente Campioni BEIA System
Soluzione salina tamponata (PBS) e proteine. Contiene 0,09%
p/p di sodio azide come conservante e Tween 20. Reagente
pronto all'uso.
Complesso Ags Mumps–Mab anti-Mumps
6 flaconi monodose liofilizzati contenenti antigene Mumps–
anticorpo monoclonale anti-Mumps. Ricostituire prima
dell’uso. Vedi preparazione dei reagenti.
Diluente Complesso
Soluzione proteica tamponata. Contiene 0,5 % di Kathon CG e
Tween 20. Reagente pronto all'uso.
Coniugato
IgG di capra anti-mouse coniugato con perossidasi. Reagente
pronto all'uso. (Vedi preparazione dei reagenti).
Tampone di Lavaggio
Soluzione salina tamponata (PBS) concentrata 20 volte. Contiene
0,1 % Kathon CG e Tween 20. Vedi preparazione dei reagenti.
Substrato-TMB
Soluzione contenente H2O2/TMB stabilizzanti e colorante
(rosa). Reagente pronto all'uso.
Soluzione Stoppante
Soluzione 1N di acido solforico. Reagente pronto all'uso.
MODALITÀ DI CONSERVAZIONE
Tutti i reattivi devono essere conservati a 2-8°C al riparo dalla luce.
Non utilizzare i reattivi oltre la data di scadenza del kit riportata
sull’ etichetta.
Pag. 4 - 24 BEIA Mumps IgM Mab Capture Ed. 20-04-2013
REAGENTI INTERCAMBIABILI
Il Diluente Campioni BEIA System, il Tampone di Lavaggio, il SubstratoTMB e la Soluzione Stoppante sono intercambiabili tra i diversi kit
della linea BEIA.
MATERIALE E STRUMENTI RICHIESTI, MA NON FORNITI
 Lettore di colorimetria per micropiastre con filtro a 450/620 nm.
 Apparecchiatura manuale o automatica per il lavaggio di
micropiastre.
 Micropipette con puntali monouso da 10, 100, 1000 µL.
 Provette monouso e normale vetreria da laboratorio.
 Acqua distillata o deionizzata.
AVVERTENZE E PRECAUZIONI









Prima dell'uso portare tutti i reattivi a temperatura ambiente
(18-25°C). Prelevare solo la quantità necessaria per l'analisi.
Evitare l'essiccamento dei pozzetti.
Usare esclusivamente vetreria accuratamente pulita.
Non utilizzare uno stesso puntale per pipettare reagenti
diversi.
Cambiare il puntale tra un campione e l’altro.
Qualora il Substrato-TMB evidenziasse un viraggio da rosa ad
azzurro, il reagente non deve essere utilizzato.
Se il dosaggio viene ripetuto, preparare una nuova diluizione
del campione.
Si raccomanda di inserire in ogni corsa analitica dei campioni
di controllo al fine di validare i risultati ottenuti, secondo
criteri e procedure che ciascun utilizzatore deve definire.
Procedere periodicamente alla manutenzione e taratura delle
pipette e del lettore.
Pag. 5 - 24 BEIA Mumps IgM Mab Capture Ed. 20-04-2013
AUTOMAZIONE
Il test può essere eseguito con sistemi automatici per kit ELISA, nel
qual caso Vi invitiamo a consultare il manuale specifico dello
strumento per una corretta esecuzione della corsa analitica.
PRELIEVO E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI
Il dosaggio può essere eseguito su siero o plasma (Eparina o EDTA).
Se il dosaggio è eseguito entro 5 giorni dal prelievo, i campioni
possono essere conservati a 2-8 °C. In caso contrario aliquotare i
campioni e congelarli a -20°C.
Evitare ripetuti scongelamenti e congelamenti. Si sconsiglia l’uso di
campioni lipemici, torbidi ed emolizzati.
I campioni devono essere diluiti 1:81 con il Diluente Campioni
BEIA System prima del dosaggio
PREPARAZIONE DEI REAGENTI
Tampone di Lavaggio
Diluire il Tampone di Lavaggio(20x) 1:20 con acqua distillata o
deionizzata prima dell'uso. Dopo ricostituzione il tampone è stabile
15 giorni se conservato a 2-8°C e comunque non oltre la data di
scadenza riportata sull'etichetta originaria. Nel Tampone di lavaggio
concentrato si possono formare dei precipitati cristallini che si
solubilizzano portando il reagente a 37°C prima della diluizione. Si
raccomanda di diluire la quantità di tampone necessaria per
eseguire i lavaggi dell'analisi in corso.
Complesso Antigene Mumps - Anticorpo Monoclonale antiMumps-Goat anti-mouse IgG-HRP
Ricostituire ogni flaconcino liofilo di Complesso Antigene Mumps Monoclonale anti-Mumps con 3 mL di Diluente Complesso. Per una
corretta ricostituzione, si consiglia di aggiungere il volume
prescritto di Diluente Complesso, richiudere il flacone, lasciarlo 15
minuti a temperatura ambiente ed agitarlo delicatamente per evitare
formazione di schiuma fino a completa dissoluzione del liofilo.
Pag. 6 - 24 BEIA Mumps IgM Mab Capture Ed. 20-04-2013
Aggiungere nel flaconcino, alla soluzione ottenuta, 50 L di
Coniugato IgG di capra anti-mouse-IgG-HRP avendo cura di agitare
delicatamente al fine di favorire la miscelazione del coniugato.
Qualora si rendesse necessario più di un flaconcino monodose, è
opportuno miscelare tra loro i flaconcini prima dell’uso. Il
complesso di Antigene-Mab-Coniugato deve essere preparato fresca
per ogni seduta analitica 1 ora prima del suo utilizzo.
CICLO DI LAVAGGIO
Si consiglia di procedere come segue sia nel caso in cui si utilizzi un
lavatore automatico di micropiastre sia nel caso in cui si operi
manualmente.
1. Svuotare completamente i pozzetti.
2. Riempirli con 300 µL di tampone di lavaggio.
3. Svuotare i pozzetti.
4. Ripetere i punti 2 e 3 per ulteriori 3 cicli.
5. Asciugare con carta assorbente la superficie esterna dei pozzetti
al termine del lavaggio.
ESECUZIONE DEL TEST
1.
2.
3.
4.
Portare i reagenti a temperatura ambiente (almeno 30-60 minuti
a 18-25°C).
Diluire (1:81) i campioni in esame con il Diluente Campioni
BEIA System (esempio 10 µL di siero e 800 µL di Diluente
Campioni BEIA System). Agitare su Vortex.
Prelevare il numero di strip necessario per l'analisi in funzione
del numero di campioni in esame, dei controlli e del
Calibratore Cut-off (vedi “Schema del dosaggio”). Richiudere
accuratamente la busta.
Dispensare nei rispettivi pozzetti 100 L del Controllo
Negativo, Calibratore Cut-off, Controllo Positivo e di ciascun
siero in esame prediluito.
Incubare la piastra a temperatura ambiente (18-25°C) per 60
minuti.
Pag. 7 - 24 BEIA Mumps IgM Mab Capture Ed. 20-04-2013
5.
Eseguire la procedura di lavaggio dei pozzetti seguendo il
procedimento raccomandato (vedi Ciclo di lavaggio).
6. Dispensare in ciascun pozzetto 100 µL del complesso Ag-MabConiugato (vedi preparazione dei reagenti).
7. Incubare la piastra a temperatura ambiente (18-25°C) per 60
minuti.
8. Eseguire la procedura di lavaggio dei pozzetti seguendo il
procedimento raccomandato (vedi Ciclo di lavaggio).
9. Dispensare in ciascun pozzetto 100 µL di Substrato-TMB.
10. Incubare la piastra a temperatura ambiente (18-25°C) per 30
minuti.
11. Bloccare la reazione cromogenica dispensando in ciascun
pozzetto 100 µL di Soluzione Stoppante.
12. Leggere la densità ottica (DO) in bicromatismo a 450/620 nm.
CALCOLO ED INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
VALIDAZIONE DELLA SEDUTA ANALITICA
Le condizioni che consentono l’accettazione dei risultati sono :
 il rapporto tra la DO del Controllo Positivo e la DO del
Calibratore Cut-off dev’essere > 1.5
 il rapporto tra la DO del Controllo Negativo e la DO del
Calibratore Cut-off dev’essere < 0.6
Qualora la seduta dia risultati non conformi alle condizioni sopra
elencate, essa non è validabile ed i risultati relativi ai campioni non
possono essere refertati senza analisi critica documentata. La non
conformità va qualificata e trattata secondo le procedure di
Assicurazione Qualità proprie del laboratorio. Si consiglia di
instaurare ed attuare procedure di Controllo Qualità interne al
laboratorio, i cui risultati concorrano alla validazione delle sedute ed
alla gestione di eventuali non conformità.
CALCOLO DEI RISULTATI
Al fine di correlare il risultato analitico allo stato immunitario del
campione si suggerisce di determinare i risultati calcolando l’index
anticorpale (I.A.) con la seguente formula:
Pag. 8 - 24 BEIA Mumps IgM Mab Capture Ed. 20-04-2013
DO campione
Index anticorpale (I.A.)
=
______________________________________________
DO Calibratore Cut-off
Per il Calibratore Cut-off calcolare, se eseguito in multiplo, il valore
medio di densità ottica (DO). I seguenti valori devono essere
considerati solo come un esempio e non devono essere usati in
luogo dei dati ottenuti dall'utilizzatore.
Esempio di calcolo:
Controllo Negativo
Calibratore Cut-off
Controllo Positivo
Campione A
Campione B
Campione C
1ª DO
2ª DO
DO
I.A.
0.062
0.334
1.135
0.129
0.498
0.888
0.068
0.337
1.186
0.138
0.515
0.918
0.065
0.335
1.160
0.133
0.506
0.903
0.19
3.46
0.40
1.51
2.69
INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO
Studi effettuati su campioni di popolazione equivalente a quella
europea hanno condotto a stabilire i seguenti criteri interpretativi:
IA
> 1.05
< 0.95
0.95  1.05
INTERPRETAZIONE
Il campione è da considerare POSITIVO per la
presenza di anticorpi di classe IgM anti-Mumps
Il campione è da considerare NEGATIVO per la
presenza di anticorpi di classe IgM anti-Mumps
ZONA GRIGIA: Il campione è da considerare DUBBIO
per la presenza di anticorpi di classe IgM anti-Mumps
Va tenuto presente che:
- il test indica solo la presenza o assenza di anticorpi specifici di
classe IgM. Non è di per sé e univocamente indice di uno stato
infettivo;
Pag. 9 - 24 BEIA Mumps IgM Mab Capture Ed. 20-04-2013
- una decisione medica non può essere basata sul risultato di un solo
test, ma va fondata sull’insieme dei dati clinici disponibili. Dati
clinici discrepanti vanno risolti prima di prendere la decisione,
eventualmente con il conforto di test di conferma o di II livello;
- risultati compresi entro la zona grigia vanno chiariti: con la
ripetizione del test sullo stesso campione; con la ripetizione del test
su un prelievo successivo; con il confronto con un test di
riferimento.
PRESTAZIONI DEL KIT
Avvertenza: i dati presentati sotto questa voce non rappresentano le
specifiche di funzionamento del kit, ma costituiscono evidenza
sperimentale di come il kit funzioni entro tali specifiche nel modo
previsto dal fabbricante.
SENSIBILITÀ E SPECIFICITÀ
Sensibilità e specificità sono state valutate confrontando le
prestazioni del kit BEIA Mumps IgM Mab Capture nei confronti di
un kit già immesso sul mercato con prestazioni accettabili (EIA
Mumps IgM).
BEIA
Mumps IgM Mab
Capture
+
-
EIA Mumps IgM
+
17
2
1
134
Da questi dati si ottiene:
Sensibilità relativa
Specificità relativa
Concordanza
94.4 %
98.5 %
98.0 %
SPECIFICITÀ ANALITICA
Non è stata rilevata alcuna interferenza in sieri contenenti fino a 10
mg/mL di emoglobina, fino a 1 mg/mL di bilirubina e fino a 30
mg/mL di trioleina. L’uso di campioni lipemici, torbidi o emolizzati
viene comunque sconsigliato.
Pag. 10 - 24 BEIA Mumps IgM Mab Capture Ed. 20-04-2013
RIPETIBILITÀ
La variabilità intra-saggio ed inter-saggio è stata determinata
valutando un campione negativo con I.A. 0.5 e due campioni
positivi rispettivamente con I.A. di 1.5 e 3.0. I campioni sono stati
replicati 6 volte per seduta in ciascuna di 12 sedute diverse. Sono
stati ottenuti coefficienti di variazione inferiori al 20% per il
campione negativo ed inferiori al 10% per i due campioni positivi.
LIMITAZIONI
Contaminazione batterica o ripetuti scongelamenti e congelamenti
dei campioni possono alterare i livelli rilevabili di IgM specifiche.
PRINCIPI GENERALI DI SICUREZZA

Tenere in ordine il laboratorio ed effettuare con cura le operazioni
previste per l'esecuzione del test.

Non mangiare, bere, fumare o usare cosmetici nell’area di
laboratorio designata.

Non pipettare soluzioni o campioni con la bocca.

Evitare il contatto diretto con i reattivi ed i campioni indossando
guanti monouso e camici.

Lavare accuratamente le mani al termine del dosaggio.

Pulire immediatamente con opportuni detergenti le superfici di
lavoro eventualmente contaminate.

Raccogliere il materiale solido o liquido utilizzato per il dosaggio in
appositi contenitori ed effettuare lo smaltimento secondo le norme
vigenti.

Controllare periodicamente il grado di contaminazione
dell'ambiente di lavoro e degli operatori.
Reagenti contenenti siero

I derivati da sangue umano inclusi nel kit sono stati analizzati e
trovati negativi per HbsAg, anti-HCV ed anticorpi anti-HIV. Poiché
nessun metodo può garantire che tali derivati non possano
trasmettere epatite, AIDS o altre infezioni, si raccomanda di
manipolare i reagenti con le opportune cautele.
Reagenti pericolosi

Soluzione Stoppante (Council Directive 88/379/EEC)
R36/38
Irritante per gli occhi e per la pelle
S26
In caso di contatto con gli occhi, lavare
immediatamente ed abbondantemente con acqua e consultare un
medico.
Pag. 11 - 24 BEIA Mumps IgM Mab Capture Ed. 20-04-2013
SCHEMA DEL DOSAGGIO



Preparare i reattivi
Diluire i campioni 1:81 con il Diluente Campioni BEIA System
Dispensare
100 L di Controllo Negativo in singolo o doppio
100 L di Calibratore Cut-off in doppio
100 L di Controllo Positivo in singolo o doppio
100 L di campione prediluito in singolo o doppio,
Incubare 60 minuti a T.A. (18-25°C)
Eseguire 4 cicli di lavaggio
Dispensare 100 L di Complesso Ag-Mab-Coniugato
Incubare 60 minuti a T.A. (18-25°C)
Eseguire 4 cicli di lavaggio
Dispensare 100 L di Substrato-TMB
Incubare 30 minuti a T.A. (18-25°C)
Dispensare 100 L di Soluzione Stoppante
Leggere le densità ottiche al fotometro a 450/620 nm









A
B
C
D
E
F
G
H
1
CN
CC
CC
CP
P1
P2
P3
P4
2
P5
…
…
…
..
..
..
3
4
5
6
..
Pag. 12 - 24 BEIA Mumps IgM Mab Capture Ed. 20-04-2013
BEIA Mumps IgM Mab
Capture
20943
Version
20-04-2013
For professional use only
TECHNOGENETICS SRL
Pag. 13 - 24 BEIA Mumps IgM Mab Capture Ed. 20-04-2013
INTENDED USE
The BEIA Mumps IgM Mab Capture kit is a qualitative enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of specific
IgM antibodies to Mumps Virus , in human serum or plasma
samples.
CLINICAL RELEVANCE
Mumps virus is a member of the Paramyxovirus, belonging to the
Paramyxoviridae family; it is the etiological agent causing in human
being infections that show : headache, anorexy, genaral malaise and
fever. These symptoms precede the salivary glands infection
(parotid glands ) and their enlargement. Moreover the Mumps
(parotitis ) virus is responsible for other complications such as :
testicular
inflammation
(orchitis),
ovary
inflammation,
meningoencephalitis, pancreatite. The revelation of IgM to Mumps
virus allows to diagnose the active phase of the infection.
PRINCIPLE OF THE ASSAY
The BEIA Mumps IgM Mab Capture kit is a qualitative enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA) for the detection of IgM antibodies to
Mumps, in human serum or plasma samples. During the first incubation,
any IgM antibodies present in serum or plasma bind to the inner surface
of the wells coated with the anti-human IgM. After the first incubation
the wells are washed to remove non-reactive serum components. During
the second incubation a complex (Mumps antigen-monoclonal antibody
anti-Mumps - goat antibody-anti-mouse IgG labelled with HRP) binds
only to the specific IgM anti-Mumps, bound in the anti-IgM-IgM
complex present on the wells. After a second washing cycle, a
chromogenic substrate solution is dispensed into the wells in order to
detect specific antibodies during a subsequent incubation. The enzymatic
reaction is then stopped by adding a stop solution which changes to
yellow the blue colour developed into the wells. The amount of colour is
directly proportional to the specific IgM anti-Mumps concentration in the
patient samples.
Pag. 14 - 24 BEIA Mumps IgM Mab Capture Ed. 20-04-2013
KIT COMPONENTS
Package size: 96 tests.
Component
SORB
A
Coated Strip
12x8x1
CONTROL
-
B
Negative Control
1 x 2 mL
CAL
CO
C
Cut-off Calibrator
1 x 2 mL
CONTROL
+
D
Positive Control
1 x 2 mL
E
Sample Diluent BEIA System
1 x 120 mL
F
Complex
1 x 6 vials
G
Complex Diluent
1 x 22 mL
H
Conjugate
1 x 0.5 mL
DIL
SPE
COMP
DIL
COMP
CONJ
BUF
WASH 20X
I
Wash Buffer
1 x 100 mL
SUBS
TMB
J
Substrate-TMB
1 x 13,5 mL
K
Stop Solution
1 x 25 mL
Package Insert
1
H2SO4
A.
B.
C.
D.
E.
Coated strips
Breakable strips coated with goat anti-human IgM antibodies
packed in sealed pouch. Place the unused strips in the pouch and
reseal.
Negative Control
Negative human serum for anti-Mumps IgM antibodies. Contains
0.09% w/w of Sodium azide as preservative. Ready to use reagent.
Calibrator Cut-off
Human serum, containing a known amount of positive IgM
antibodies to Mumps. Contains 0.09% w/w of Sodium azide as
preservative. Ready to use reagent.
Positive Control
Positive human serum for anti-Mumps IgM antibodies. Contains
0.09% w/w of Sodium azide as preservative. Ready to use reagent.
Sample Diluent BEIA System
Buffered salt solution (PBS). Contains protein, 0,09 % w/w Sodium
azide and Tween 20. Ready to use reagent.
Pag. 15 - 24 BEIA Mumps IgM Mab Capture Ed. 20-04-2013
F.
G.
H.
I.
J.
K.
Complex Mumps Antigens - Mab anti-Mumps
6 Single-dose lyophilised vials. Reconstitute before use. See
“Preparation of reagents”.
Complex Diluent
Buffered salt solution with proteins. Contains Tween 20 and
preservative. Ready to use reagent.
Conjugate
Goat anti-mouse IgG labelled with HRP.
See “Preparation of reagents”.
Wash Buffer
Buffered salt solution (PBS) 20x concentrated. Contains 0,1 % di
Kathon CG and Tween 20. See “Preparation of reagents”.
Substrate-TMB
Tetramethylbenzidine H2O2/TMB in stabilizing buffered
solution. Contains pink dye. Ready to use reagent.
Stop Solution
1N Sulphuric acid solution. Ready to use reagent.
STORAGE OF REAGENTS
Store all reagents at 2-8°C avoiding exposure to light. Do not use
reagents after the expiry date indicated on the label.
INTERCHANGEABLE REAGENTS
The Sample Diluent BEIA System, Wash Buffer, Substrate-TMB and Stop
Solution are common to all BEIA kits.
MATERIALS/EQUIPMENT REQUIRED BUT NOT PROVIDED





Microplate reader with 450/620 nm filters.
Manual or automated microplate washing device.
Precision pipettes with disposable tips 10,100,1000 L .
Disposable pipettes and normal glassware.
Distilled or deionised water.
Pag. 16 - 24 BEIA Mumps IgM Mab Capture Ed. 20-04-2013
WARNINGS AND PRECAUTIONS









Bring all reagents to room temperature (18-25°C) before use. Only
take the quantity necessary for the assay.
Avoid wells drying.
Use clean glassware.
Use a clean disposable pipette tip for each reagent.
Use a clean disposable pipette tip for each sample.
If the chromogenic substrate shows a change from pink to blue
colour, discard the reagent.
For repeated assays, each time provide for new diluted samples.
Every analytical run should include control samples in order to
validate the results, according to criteria and procedures
established by each laboratory.
Periodical maintenance and calibration of pipettes and microplate
reader are required.
AUTOMATION
The test can be performed on automated ELISA processor. Please
refer to specific instrument manual for proper applications.
SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION
The test can be performed on serum or plasma (heparin – EDTA).
Specimens may be stored refrigerated at 2-8 °C up to 5 days. For
longer storage they should be aliquoted and stored frozen at – 20°C.
Avoid repeated thawing and freezing. Do not use haemolyzed,
lipemic or turbid specimens. All serum and plasma samples must be
pre-diluted with Sample Diluent prior to assay. See assay protocol.
PREPARATION OF REAGENTS
Wash Buffer (20 X)
Dilute 1:20 the content of the Wash Buffer bottle with distilled or
deionised water.
Pag. 17 - 24 BEIA Mumps IgM Mab Capture Ed. 20-04-2013
The diluted Wash Buffer is stable 15 days when stored at 2-8 °C; in any
case, do not use it after expiry date printed on the original label. If
crystallization occurs in the concentrated Wash Buffer, warm the solution
to 37 °C before diluting. Only dilute the quantity necessary for the assay.
Complex Mumps Antigens – Mab anti-Mumps- goat anti-mouse IgG HRP
Reconstitute each lyophilized vial of the complex with 3 mL of Complex
Diluent. It's recommended to add the volume of Complex Diluent into
the vial, close the cap, wait 15 minutes at room temperature and gently
mix in order to avoid foaming. Add 50 L of conjugate to the reconstitute
vial and gently mix. The complex of Ags-Mab-Conjugate must be
prepared at least 1 hour before being dispensed into wells. It's
recommended to dilute only the quantity necessary for the analytical run.
If the analytical run requires the reconstitution of more than one singledose vial, it's recommended to mix contents of the vials before use.
WASHING CYCLES
Both using a microplate washer and washing the plate manually,
perform the following steps.
1.
Empty the wells
2.
Fill them with 300 µL of Wash Buffer.
3.
Empty the wells
4.
Repeat steps 2 and 3 for other 3 cycles
5.
Dry the rim of the wells with blotting paper at the end of the
washing cycles.
ASSAY PROTOCOL
1.
2.
Allow all reagents to reach room temperature leaving them at
least 30-60 minutes at 18-25 °C.
Dilute the samples to be assayed (1 :81) with the Sample
Diluent BEIA System (i.e. 10 µL of serum and 800 µL of
Sample Diluent BEIA System). Shake on Vortex.
Select the number of strips required for the assay according to
the number of samples to be assayed and the Calibrator Cutoff and Controls (see paragraph “Summary of protocol”
below). Reseal the pouch.
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3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
Dispense 100 µL of each Control , Calibrator Cut-off and of the
diluted samples.
Incubate the plate at room temperature (18-25 °C) for 60
minutes.
Perform a washing cycle following the suggested procedure
(see Washing Cycles).
Dispense 100 µL of Complex Ags-Mabs-Conjugate in each
well.
Incubate the plate at room temperature (18-25 °C) for 60
minutes.
Perform a washing cycle following the suggested procedure
(see Washing Cycles).
Dispense 100 µL of Substrate-TMB in each well .
Incubate the plate at room temperature (18-25 °C) for 30
minutes.
Stop the chromogenic reaction dispensing 100 µL of Stop
Solution into each well.
Read the optical density (O.D.) in bi-chromatism at 450/620
nm.
CALCULATION AND INTERPRETATION OF RESULTS
RUN VALIDATION CRITERIA
Criteria used to validate the obtained results are the following:
 The ratio of the OD for Positive Control to the OD for the
Calibrator Cut-off must be > 1.5

The ratio of the OD for Negative Control to the OD for the
Calibrator Cut-off must be < 0.6
If the above criteria are not met, the run is invalid and the results
cannot be reported without a documented critical review of the data.
The non conformity must be addressed and treated according to
each laboratory’s Quality Assurance procedures.
Each lab should establish and follow its own internal Quality
Control procedures and use the QC results to validate runs and
manage non conformities.
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CALCULATION OF RESULTS
In order to correlate the analytical results to the immunity of the
sample results should be determined calculating the antibody index
(A.I.) using the following formula:
O.D. sample
________________________________________
Antibody Index (A I) =
O.D. Calibrator Cut-off
For the Calibrator Cut-off calculate, if assayed in duplicate, the mean
OD value (OD). The data below show typical results for the test.
These data are intended as an example only and should not be used
to calculate results from another run.
Negative Control
Cut-off Calibrator
Positive Control
Sample A
Sample B
Sample C
1ª OD
0.062
0.334
1.135
0.129
0.498
0.888
2ª OD
0.068
0.337
1.186
0.138
0.515
0.918
O.D.
0.065
0.335
1.160
0.133
0.506
0.903
A.I.
0.19
3.46
0.40
1.51
2.69
INTERPRETATION OF RESULTS
Results from our clinical trials, performed on samples representative
of the European population, suggest the following interpretative
criteria:
A.I.
INTERPRETATION
> 1.05
Sample should be considered POSITIVE for the presence of
anti-Mumps IgM antibodies.
< 0.95
Sample should be considered NEGATIVE for the presence of
anti-Mumps IgM antibodies.
0.95  1.05
GREY ZONE: Sample should be considered BORDERLINE for
the presence of anti-Mumps IgM antibodies.
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Please consider that:
- the test only detects specific IgM antibodies. It cannot per se and
univocally be referred to as evidence of infection;
- a medical decision cannot be made on the basis of a single test
result but should be grounded on all the available clinical data;
discrepancies in clinical data should be clarified prior to final
decisions, also, if necessary, by confirmatory or 2nd level tests;
- results within grey zone should be made clear: re-testing the same
sample; testing a sample from another collection from the same
patient; comparing the results with those of a reference test.
PERFORMANCE DATA
Warning: Data below do not represent the performance
specifications of the kit, but only experimental evidence that the
performance of the kit is within such specifications, as intended by
the manufacturer.
SPECIFICITY AND SENSITIVITY
The sensitivity and specificity were evaluated comparing the BEIA
Mumps IgM Mab Capture results versus an established EIA
commercial kit (EIA Mumps IgM) with acceptable performances.
EIA Mumps IgM
+
BEIA
17
2
+
Mumps IgM Mab
1
134
Capture
From which the following table can be calculated:
Relative Sensitivity
94.4 %
Relative Specificity
98.5 %
Agreement
98.0 %
ANALYTICAL SPECIFICITY
No interference has been observed in samples with hemoglobin up
to 10 mg/mL, bilirubin up to 1 mg/mL, triolein up to 30 mg/mL.
Lipemic, turbid or hemolyzed samples, however, should not be
used.
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REPEATABILITY
The within-run and run-to-run variability were determined using
one negative sample with A.I. of 0.5 and two positive samples,
containing value of Antibody Index (A.I) : 1.5 and 3.0. These
samples were tested 6 times per single run in 12 different analytical
runs. Coefficients of variation lower than 20% have been obtained
for the negative sample and 10% for the two positive samples.
LIMITATIONS
Bacterial contamination or repeated freeze-thaw cycles of specimens
may affect the detectable levels of specific IgM
GENERAL DIRECTIONS FOR A SAFE USE

Keep the laboratory clean and tidy and strictly follow the
procedural directions.

Do not eat, drink, smoke or apply cosmetics in a clinical lab.

Do not pipette solutions or samples by mouth.

Wear disposable gloves and overalls when handling reagents and
samples. Avoid direct contact.

Wash hands thoroughly after assay.

Thoroughly clean working area with proper detergent solutions.

Collect solid and liquid waste material in proper containers and
provide for disposal according to the local regulations.

Periodically check contamination level of operators and rooms.
Reagents containing serum

All components of human origin have been tested and found
negative for HBsAg, anti-HCV and anti-HIV antibodies. Since no
known test can guarantee, however, that products derived from
human blood will not transmit Hepatitis, AIDS or other infectious
diseases, these reagents should be handled as hazardous material.
Hazardous Reagents

Stop Solution (Council Directive 88/379/EEC)
R36/38
Irritating to eyes and skin.
S26
In case of contact with eyes, rinse immediately with
plenty of water, and seek for medical advice.
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SUMMARY OF PROTOCOL



Prepare reagents
Pre-dilute samples 1:81 with Sample Diluent
Dispense:
100L of Negative Control (single/duplicate)
100L of Cut-off Calibrator (duplicate)
100L of Positive Control (single/duplicate)
100 L of pre-diluted samples in single or duplicate
Incubate 60 minutes at R.T. (18-25°C)
Perform 4 washing cycles
Dispense 100 L of the Complex Ags- Mab- Conjugate
Incubate 60 minutes at R.T. (18-25°C)
Perform 4 washing cycles
Dispense 100 L of Substrate-TMB
Incubate 30 minutes at R.T. (18-25°C)
Dispense 100 L of Stop Solution
Read the O.D. at 450/620nm









A
B
C
D
E
F
G
H
1
NC
CC
CC
PC
P1
P2
P3
P4
2
P5
…
…
…
..
..
..
3
4
5
6
..
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BIBLIOGRAFIA / REFERENCES
- Aase JM,Noren GR, Reddy V, St. Geme JM. Mumps-virus infection
in pregnant women and the immunologic response of their
offspring. N Engl J Med 1972; 286 : 1379-1382
- Center for Disease Control. Mumps- United States, 1985-1986.
MMWR 1987; 36: 151-155
- Donald PR, Burger PJ, Becker WB. Mumps meningo encephalitis.
S Afr Med J 1987; 71: 283-285
- Freeman R, Hambling MH. Serological studies on 40 cases of
mumps virus infection. J Clin Pathol 1980 ; 33 : 28-32
- Gilkmann G, Pedersen M, Mondhorst CH. Detection of specific
IgM to mumps virus from patients with acute mumps infection,
using an antibody-capture enzyme immunoassay. Acta Pathol
Immunol Scand 1986; 94: 145-156
- Julkunen I, Vaananen P, Penttinen K. Antibody responses to
mumps virus proteins in natural infection and after vaccination with
live and inactivated mumps virus vaccines. J Med Virol 1984; 14:
209-219
- Robertson CM, Bennett VJ, Jefferson N, Mayon-White RT.
Serological evaluation of a measles,mumps and rubella
vaccine.
Arch Dis Child 1988; 63: 612-616
- Werner CA. Mumps orchitis and testicular
atrophy. II. A factor
in male sterility. Ann Intern Med 1950; 32 : 1075-1086
Pag. 24 - 24 BEIA Mumps IgM Mab Capture Ed. 20-04-2013