Sistema LightScanner Rilevazione delle mutazioni e genotipizzazione ad alta resa Distributore per l’Italia ® Sistema LightScanner • La caratteristica che contraddistingue il sistema LightScanner è la tecnica High Resolution Melting (Hi-Res Melting™). – Hi-Res Melting è una tecnica post PCR per la rilevazione e lo scanning delle mutazioni omogenee. VELOCE – risultati in meno di 5 minuti. SEMPLICE – nessun procedimento post PCR. ECONOMICO – costi nettamente inferiori rispetto alla concorrenza Distributore per l’Italia Scanning con Hi-Res Melting • Tubo-chiuso – dye dsDNA prima della PCR – Nessun processamento, aggiunte o separazioni – Nessuna esposizione esterna • Rapido – 5-10 min per 96/384 campioni • Non distruttivo – Se necessario, è possibile eseguire procedimenti downstream (ex: sequenziamento) • Manutenzione minima – Smaltimento dei rifiuti non dispendioso Distributore per l’Italia Componenti essenziali della Hi-Res Melting • Dye specifico per DNA a doppio filamento • LCGreen Plus™, specifico per la rilevazione degli eteroduplex che si formano durante la PCR, è prodotto esclusivamente da Idaho Technology. • Strumentazione ad alta risoluzione • Lo strumento LightScanner è progettato specificatamente per le applicazioni Hi-Res melting Distributore per l’Italia Dye LCGreen® Plus • LCGreen Plus rileva gli eteroduplex, a differenza dei dye usati tradizionalmente per la real-time PCR (ex: SYBR Green I) 50 50 45 45 LCGreen Plus -dF/dT 40 SYBR® Green I 40 35 35 30 30 Heteroduplexes 25 25 20 20 15 15 10 10 5 5 0 0 72 74 76 78 80 82 Temperature (°C) 84 86 72 74 76 78 wild type Distributore per l’Italia 80 82 84 heterozygote 86 LC Green – un dye “di saturazione” Dye non saturante Dye saturante Distributore per l’Italia Strumento LightScanner • Disponibile per piastre da 96 o da 384 pozzetti • Uniformità sulla piastra +/- 0.15°C • 100 punti di rilevamento raccolti per °C a 0.10 °C/sec Distributore per l’Italia Tecnica Hi-Res Melting 1. Amplificazione dei campioni con il dye LCGreen • 2. 2 ore inclusa la preparazione della PCR Melting dei campioni • 3. 5-10 minuti Analisi dei dati • 4. 5-10 minuti Recupero dei campioni per il sequenziamento (se necessario) • 30-60 minuti Distributore per l’Italia Melting Curves Heterozygote Amplification Observed Combination of 4 Duplexes Two Heteroduplexes Two Homoduplexes T A C A C G T G Temperature Distributore per l’Italia Analisi di melting Distributore per l’Italia Analisi di melting Distributore per l’Italia Analisi di melting SNP 1 homozygote SNP 1 + 2 SNP 1 SNP 2 Distributore per l’Italia Analisi di melting SNP 1 + 2 SNP 1 SNP 2 SNP 1 homozygote Distributore per l’Italia Prodotto di 100 bp C/C Omozigote C/G Eterozigote C/T Eterozigote C/A Eterozigote • Gli omozogoti vengono facilmente distinti dagli eterozigoti • Eterozigoti diversi tra loro tracciano profili di melting unici Distributore per l’Italia Rilevazione delle varianti omozogotiche Distributore per l’Italia “Blinded Samples” di tumore Distributore per l’Italia Dosaggio del target Distributore per l’Italia Utilizzo di un “toolbox” DNA come sistema modello per l’individuazione delle mutazioni • Highsmith et al., Electrophoresis (1999) • Plasmidi costruiti con un contenuto in GC di 40%, 50%, e 60% e con A, C, G, o T in posizione uno • Primers di PCR spaziati di 50 bp su ogni filamento X Distributore per l’Italia Reed and Wittwer Clin. Chem. 2004, 50(10): 1748-54 Sensibilità e specificità Sensibilità e specificità in funzione della lunghezza del prodotto •N=1248, ogni strumento •Tre target differenti •Tutti gli SNPs e i WTs possibili Clin Chem. 2004;50:1748-54. Distributore per l’Italia Benefici del sistema Hi-Res Melting • Hi-Res Melting utilizzando strumenti per real-time PCR – Gli strumenti per real-time PCR in commercio non permettono il controllo preciso della temperatura, l’acquisizione della totalità dei dati e non sono dotati di un software di analisi che garantisca un corretto sviluppo del metodo. Caratterisica LightScanner Piattaforme Real-time Alta Bassa Software di analisi specifico per la Hi-Res Melting Sì No Compatibilità con la fluorescenza Sì Non tutti sono compatibili con il dye LCGreen 5 minuti >30 minuti Risoluzione Risultato in Distributore per l’Italia Benefici del sistema Hi-Res Melting • La capacità dell’analisi di melting dipende direttamente dalla risoluzione dello strumento utilizzato • La precisione delle curve di melting permette l’identificazione di campioni genotipicamente diversi tra loro HR-1 Instrument Commercial Real-Time PCR Instrument Curve melting normalizzate di un amplicone di 110-bp in presenza del dye LCGreen Plus. I dati mostrano i vantaggi del sistema Hi-Res Melting. I profili reali di Hi-Res Melting permettono la distinzione tra campioni wild type (AA) in verde, mutanti eterozigoti (AT) in blu e mutanti omozigoti (TT) in rosso. Distributore per l’Italia Processamento del campione Tempo necessario per processare 96 campioni Presupposti: DHPLC a 2 temperature Sequenziamento in una direzione con utilizzo del sequenziatore a 48 capillari e del software per la rilevazione Data Taken from Dr C Taylor: Cancer Research UK Clinical Centre, St James's University Hospital, Leeds, UK Distributore per l’Italia Costi Costi per DHPLC, FSSCP e sequenziamento basati sui costi reali per campioni processati nel biennio 2002-2003. Costi per la Hi-Res Melting basati sul costo reale e stimato dei consumabili Data Taken from Dr C Taylor: Cancer Research UK Clinical Centre, St James's University Hospital, Leeds, UK Distributore per l’Italia È possibile eliminare il 99% dei sequenziamenti? ~ 90% Normale Scanning dei frammenti di PCR per le varianti Wild type ~10% Anomalo Genotipizzazione con sonda non marcata delle varianti note ~ 9% Identificato ~1% Non identificato Sequenziamento del DNA Distributore per l’Italia Variante genotipizzata Conclusioni • Nel sistema LightScanner sono già incluse tutte le componenti necessarie al successo nelle applicazioni Hi-Res Melting – Dye LCGreen Plus – Master Mix per LightScanner – Strumento LightScanner • Software disponibile per la progettazione di test, la rilevazione delle mutazioni e la genotipizzazione – Protocolli on-line • Risparmio di tempo e denaro • Alta resa nella rilevazione delle mutazioni e nello scanning dei geni Distributore per l’Italia Per maggiori informazioni sul sistema LightScanner Vi preghiamo di contattare: Labogen S.r.l. (distributore per l’Italia) Tel.: 02.9390.7515 – Fax: 02.9390.9417 [email protected] Distributore per l’Italia