POLIMORFISMI DEL DNA
Il polimorfismo rs7799039 della Leptina
UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI GENOVA
GENETICA MOLECOLARE
IRCCS GASLINI
POLIMORFISMO
=
esistenza di forme diverse
è definito polimorfico un locus per il quale esistono più alleli,
ciascuno dei quali è presente in una determinata popolazione
con una frequenza maggiore di quella attesa
in base a mutazione ricorrente.
POLIMORFISMO PROTEICO
variabilità genetica
POLIMORFISMO DEL DNA
Il polimorfismo del DNA
Per convenzione
se l’allele meno frequente ha, nella popolazione, una frequenza:
- Superiore all’1%
si parla di locus polimorfico
- Inferiore all’1%
si parla di variante rara
( come la maggior parte delle mutazioni deleterie che causano
malattie genetiche)
La differenza tra due individui, in media, è di 1 ogni 1000 nucleotidi.
In una popolazione esiste quindi grande diversità genetica.
unicità genetica di ciascun individuo
TIPI DI POLIMORFISMI DEL DNA
1. RESTRICTION FRAGMENTS LENGHT
POLYMORPHISM
( RFLP)
2. SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM
( SNP )
3. VARIABLE NUMBER TANDEM REPEATS
(VNTR)
1. POLIMORFISMI DI LUNGHEZZA DEI FRAMMENTI
DI RESTRIZIONE
( RFLP, Restriction Fragment Lenght Polymorphisms )
A seguito di una mutazione si determina l’abolizione o la creazione
di un sito di restrizione per un enzima di restrizione, con
conseguente variazione (polimorfismo) nella lunghezza dei frammenti di
restrizione per un dato enzima di restrizione.
Sono polimorfismi di un singolo locus e biallelici.
Le differenze nella sequenza del DNA che si rilevano attraverso la
diversa lunghezza dei frammenti di restrizione, possono essere
equiparate ad alleli codominanti di un locus mendeliano:
la presenza o assenza di uno o dell’altro allele può venire riconosciuta in
ogni individuo e gli individui omozigoti possono essere distinti dagli
eterozigoti.
Sono comuni nelle regioni non codificanti del DNA.
2. POLIMORFISMI DI SINGOLI NUCLEOTIDI
( SNP, Single Nucleotide Polymorphisms )
Sono variazioni di singole coppie di basi nel genoma,
es. in una determinata posizione vi è una T e in un altro individuo
nella stessa popolazione vi è una C.
Alcuni RFLP sono causati da SNPs,
anche se non tutti gli SNPs coinvolgono siti di restrizione.
Sono polimorfismi biallelici
Sono presenti in numero elevato nel genoma umano, almeno 3 milioni
sono utili marcatori genetici
3. POLIMORFISMI DI RIPETIZIONE
(VNTR, Variable Number Tandem Repeats)
a.
Il sito di restrizione viene lasciato intatto, ma la lunghezza del
frammento di restrizione varia a seconda del numero di
ripetizioni in tandem, testa-coda, tra i due siti di restrizione
posti alle due estremità.
b. Si distinguono in :
- minisatelliti ( ripetizioni di qualche decina di basi)
- microsatelliti (ripetizioni di 2,3,4 basi,tipo (AC), (CAG), (AAAT),
c. Si identificano mediante PCR
d. Sono polimorfismi multiallelici,essendo molto variabile il numero
di ripetizioni
e. È molto probabile che due individui non imparentati abbiano
genotipi diversi
utili in medicina legale
Struttura del gene ob umano
Dal SITO NCBI :
Official Symbol LEP and Name: leptin [Homo sapiens]
Chromosome: 7; Location: 7q31.3
This gene encodes a protein that is secreted by white adipocytes, and
which plays a major role in the regulation of body weight. This protein,
which acts through the leptin receptor, functions as part of a signaling
pathway that can inhibit food intake and/or regulate energy expenditure
to maintain constancy of the adipose mass. This protein also has several
endocrine functions, and is involved in the regulation of immune and
inflammatory responses, hematopoiesis, angiogenesis and wound
healing. Mutations in this gene and/or its regulatory regions cause severe
obesity, and morbid obesity with hypogonadism. This gene has also been
linked to type 2 diabetes mellitus development.
Struttura del gene ob umano
Gene ob
5’
3’
QuickTi me™ e un
decompressore
sono necessari per visualizzare quest'immagine.
Esone 1
Esone 3
Esone 2
cDNA ob
Sequenza codificante
ATG
504 pb
Poly(A)
TGA
Il gene ob umano è composto di 3 esoni separati da 2 introni
-Esone 1 (1-29)
-Esone 2 (172 pb)
viene trascritto, ma non tradotto
viene trascritto tutto, ma viene tradotto
solo in parte
-Esone 3 (3225 pb) viene trascritto tutto,ma tradotto solo in parte
Regolazione della trascrizione
PROMOTORE
gene ob
enhancer
sito d’inizio
della trascrizione
+1
ATG
-2548
GT
POLIMORFISMO
Rs 7799039
5’UTR
ESONE 1 introne ESONE 2
introne
ESONE 3
3’UTR
trascrizione
Precursore dell’mRNA
29
172
3225
Splicing
RNA maturo
Nella regione del promotore,di lunghezza variabile,si trova una serie di brevi sequenze che vengono
riconosciute e legate da fattori di trascrizione. Accanto a sequenze comuni a molti promotori vi sono
elementi che sono riconosciuti da fattori di trascrizione tessuto-specifici
RNAm trascritto dal gene ob ( 1-163519 )
GTAGGAATCGCAGCGCCAACGGTTGCAAG
GCCCAAGAAGCCCATCCTGGGAAGGAAAATGCATTGGGGAACCCTGTGCGGATTCTTGTGGCTTTGGCCCTATCTTTTCTATGTCCAAGCTGTGCCCATCCAAAA
AGTCCAAGATGACACCAAAACCCTCATCAAGACAATTGTCACCAGGATCAATGACATTTCACACACG
CAGTCAGTCTCCTCCAAACAGAAAGTCACCGGTTTGGACTTCATTCCTGGGCTCCACCCCATCCTGACCTTATCCAAGATGGACCAGACACTGGCAGTC
TACCAACAGATCCTCACCAGTATGCCTTCCAGAACGTGATCCAAATATCCAACGACCTGGAGAACCTCCGGGATCTTCTTCACGTGCTGGCCTTCTCTA
AGAGCTGCCACTTGCCCTGGGCCAGTGGCCTGGAGACCTTGGACAGCCTGGGGGGTGTCCTGGAAGCTTCAGGCTACTCCACAGAGGTGGTGGCCCT
GAGCAGGCTGCAGGGGTCTCTGCAGGACATGCTGTGGCAGCTGGACCTCAGCCCTGGGTGCTGAGGCCTTGAAGGTCACTCTTCCTGCAAGGACTACG
TTAAGGGAAGGAACTCTGGCTTCCAGGTATCTCCAGGATTGAAGAGCATTGCATGGACACCCCTTATCCAGGACTCTGTCAATTTCCCTGACTCCTCTAA
GCCACTCTTCCAAAGGCATAAGACCCTAAGCCTCCTTTTGCTTGAAACCAAAGATATATACACAGGATCCTATTCTCACCAGGAAGGGGGTCCACCCAG
CAAAGAGTGGGCTGCATCTGGGATTCCCACCAAGGTCTTCAGCCATCAACAAGAGTTGTCTTGTCCCCTCTTGACCCATCTCCCCCTCACTGAATGCCT
CAATGTGACCAGGGGTGATTTCAGAGAGGGCAGAGGGGTAGGCAGAGCCTTTGGATGACCAGAACAAGGTTCCCTCTGAGAATTCCAAGGAGTTCCAT
GAAGACCACATCCACACACGCAGGAACTCCCAGCAACACAAGCTGGAAGCACATGTTTATTTATTCTGCATTTTATTCTGGATGGATTTGAAGCAAAGC
ACCAGCTTCTCCAGGCTCTTTGGGGTCAGCCAGGGCCAGGGGTCTCCCTGGAGTGCAGTTTCCAATCCCATAGATGGGTCTGGCTGAGCTGAACCCATT
TTGAGTGACTCGAGGGTTGGGTTCATCTGAGCAAGAGCTGGCAAAGGTGGCTCTCCAGTTAGTTCTCTCGTAACTGGTTTCATTTCTACTGTGACTGATG
TTACATCACAGTGTTTGCAATGGTGTTGCCCTGAGTGGATCTCCAAGGACCAGGTTATTTTAAAAAGATTTGTTTTGTCAAGTGTCATATGTAGGTGTCTG
CACCCAGGGGTGGGGAATGTTTGGGCAGAAGGGAGAAGGATCTAGAATGTGTTTTCTGAATAACATTTGTGTGGTGGGTTCTTTGGAAGGAGTGAGATC
ATTTTCTTATCTTCTGCAATTGCTTAGGATGTTTTTCATGAAAATAGCTCTTTCAGGGGGGTTGTGAGGCCTGGCCAGGCACCCCCTGGAGAGAAGTTTC
TGGCCCTGGCTGACCCCAAAGAGCCTGGAGAAGCTGATGCTTTGCTTCAAATCCATCCAGAATAAAACGCAAAGGGCTGAAAGCCATTTGTTGGGGCA
GTGGTAAGCTCTGGCTTTCTCCGACTGCTAGGGAGTGGTCTTTCCTATCATGGAGTGACGGTCCCACACTGGTGACTGCGATCTTCAGAGCAGGGGTCC
TTGGTGTGACCCTCTGAATGGTCCAGGGTTGATCACACTCTGGGTTTATTACATGGCAGTGTTCCTATTTGGGGCTTGCATGCCAAATTGTAGTTCTTGTC
TGATTGGCTCACCCAAGCAAGGCCAAAATTACCAAAAATCTTGGGGGGTTTTTACTCCAGTGGTGAAGAAAACTCCTTTAGCAGGTGGTCCTGAGACCT
GACAAGCACTGCTAGGCGAGTGCCAGGACTCCCCAGGCCAGGCCACCAGGATGGCCCTTCCCACTGGAGGTCACATTCAGGAAGATGAAAGAGGAGG
TTTGGGGTCTGCCACCATCCTGCTGCTGTGTTTTTGCTATCACACAGTGGGTGGTGGATCTGTCCAAGGAAACTTGAATCAAAGCAGTTAACTTTAAGAC
TGAGCACCTGCTTCATGCTCAGCCCTGACTGGTGCTATAGGCTGGAGAAGCTCACCCAATAAACATTAAGATTGAGGCCTGCCCTCAGGGATCTTGCAT
TCCCAGTGGTCAAACCGCACTCACCCATGTGCCAAGGTGGGGTATTTACCACAGCAGCTGAACAGCCAAATGCATGGTGCAGTTGACAGCAGGTGGGA
AATGGTATGAGCTGAGGGGGGCCGTGCCCAGGGGCCCACAGGGAACCCTGCTTGCACTTTGTAACATGTTTACTTTTCAGGGCATCTTAGCTTCTATTA
TAGCCACATCCCTTTGAAACAAGATAACTGAGAATTTAAAAATAAGAAAATACATAAGACCATAACAGCCAACAGGTGGCAGGACCAGGACTATAGCC
CAGGTCCTCTGATACCCAGAGCATTACGTGAGCCAGGTAATGAGGGACTGGAACCAGGGAGACCGAGCGCTTTCTGGAAAAGAGGAGTTTCGAGGTA
GAGTTTGAAGGAGGTGAGGGATGTGAATTGCCTGCAGAGAGAAGCCTGTTTTGTTGGAAGGTTTGGTGTGTGGAGATGCAGAGGTAAAAGTGTGAGCA
GTGAGTTAC
AGCGAGAGGCAGAGAAAGAAGAGACAGGAGGGCAAGGGCCATGCTGAAGGGACCTTGAAGGGTAAAGAAGTTTGATATTAAAGGAGTTAAGAGTAG
CAAGTTCTAGAGAAGAGGCTGGTGCTGTGGCCAGGGTGAGAGCTGCTCTGGAAAATGTGACCCAGATCCTCACAACCACCTAATCAGGCTGAGGTGTC
TTAAGCCTTTTGCTCACAAAACCTGGCACAATGGCTAATTCCCAGAGTGTGAAACTTCCTAAGTATAAATGGTTGTCTGTTTTTGTAACTTAAAAAAAAAA
AAAAAAGTTTGGCCGGGTGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCAAGGTGGGGGGATCACAAGGTCACTAGATGGCGAGCATC
CTGGCCAACATGGTGAAACCCCGTCTCTACTAAAAACACAAAAGTTAGCTGAGCGTGGTGGCGGGCGCCTGTAGTCCCAGCCACTCGGGAGGCTGAG
ACAGGAGAATCGCTTAAACCTGGGAGGCGGAGAGTACAGTGAGCCAAGATCGCGCCACTGCACTCCGGCCTGATGACAGAGCGAGATTCCGTCTTAA
AAAAAAAAAAAAAAAAGTTTGTTTTTAAAAAAATCTAAATAAAATAACTTTGCCCCCTG
Nucleotide Sequence (504 nt)
cDNA
ATGCATTGGGGAACCCTGTGCGGATTCTTGTGGCTTTGGCCCTATCTTTTCTATGTCCAACTGTGCCCATCCAA
AAAGTCCAAGATGACACCAAAACCCTCATCAAGACAATTGTCACCAGGATCAATGACATTTCACACA
CGCAGTCAGTCTCCTCCAAACAGAAAGTCACCGGTTTGGACTTCATTCCTGGGCTCCACCCCATCCTGACCT
TATCCAAGATGGACCAGACACTGGCAGTCTACCAACAGATCCTCACCAGTATGCCTTCCAGAAACGTGATCCA
AATATCCAACGACCTGGAGAACCTCCGGGATCTTCTTCACGTGCTGGCCTTCTCTAAGAGCTGCCACTTGCCC
TGGGCCAGTGGCCTGGAGACCTTGGACAGCCTGGGGGGTGTCCTGGAAGCTTCAGGCTACTCCACAGAGG
TGGTGGCCCTGAGCAGGCTGCAGGGGTCTCTGCAGGACATGCTGTGGCAGCTGGACCTCAGCCCTGGGTG
CTA
Blue highlighting indicates alternate exons.
Translation (167aa):
MHWGTLCGFLWLWPYLFYVQAVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHT
QSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDL
LHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPG
C
LEPTIN SNP rs 7799039
(-2548 G/A)
•
•
Questo polimorfismo è stato associato ad alti livelli di leptina in soggetti
obesi e in sovrappeso.
Si trova nella regione del Promotore in posizione - 2548.
•
Una GUANINA può essere sostituita con una ADENINA
1.
2.
3.
Il genotipo di un individuo potrà quindi essere :
G/G omozigote wilde type
A/A omozigote per il polimorfismo
G/A eterozigote
Nella popolazione europea le tre condizioni si presentano con
la
frequenza di:
G/G = 0,259
A/A= 0,276
A/G = 0,466
PRIMER
Per individuare il polimorfismo rs 7799039 sono stati disegnati due primer:
•
Forward
F : TGGAGGAATCAATGTGCAATG
•
Reverse
R:
AAAAATACGGACAGAAAC
R = G A (purina)
Y = T C (pirimidina)
5’
3’
F- --->
TGGAGGAATCAATGTGCAATG….………. ….. G……………….. TTTTTATGCCTGTCTTTG
3’
ACCTCCTTAGTTACACGTTAC…………………….A……………….AAAAATACGGACAGAAAC 5’
<----R
La riuscita della PCR è strettamente legata alla scelta dei Primer che selezionano i
frammento di DNA che rappresenta il bersaglio dell’amplificazione.
E’ importante che:
- non contengano basi complementari
- la T di fusione di entrambi sia identica o quasi
Enzima di restrizione Hha1
5’
GCGC
3’
3’
CGCG
5’
Il taglio prodotto dall’’enzima HhaI
genera estremità sporgenti 3’ protruding
Che cosa ci aspettiamo di vedere con
l’elettroforesi ?
A/A
A/G
HhaI non taglia
HhaI taglia l’allele G
Hha1 non taglia l’allele A
525
181
264
525
181
G/G
HhaI taglia entrambi gli alleli
264