U.O. ANATOMIA PATOLOGICA
Il percorso del campione
dal prelievo al referto
Diagnosi cito-istologica
e
Marcatori biomolecolari
Rossana Culli
08/06/2013
Il percorso del campione
dal prelievo al referto
FASE PRE-ANALITICA
FASE ANALITICA
FASE POST-ANALITICA
FASE PRE-ANALITICA
PRELIEVO DEL MATERIALE DA ESAMINARE
ALLESTIMENTO
inizia al momento del prelievo e
si completa in laboratorio a opera
del personale tecnico di Anatomia Patologica
TRASPORTO
dal punto di prelievo al laboratorio
In questa fase si annidano numerosi punti critici :
* insufficienza del materiale prelevato
* presenza di una quantità eccessiva di sangue o di
flogosi,che offuscano il preparato
* contaminazione con talco che può mimare la presenza
cellule neoplastiche
* scorretto allestimento dei preparati(vetrini mal striscia
mal fissati in cui le cellule si presentano danneggia
e non valutabili)
* trasporto ritardato del materiale fresco.
Molte di queste criticità sono superabili usando
procedure e metodiche corrette.
flogosi-necrosi
Brushing bronchiale:
Inquinamento da cristalli di talco
TECNICA CORRETTA ALLESTIMENTO AGOASPIRATI
TECNICHE DI FISSAZONE CON CITOSPRAY
Agoaspirato polmonare:
Artefatti di allestimento
Caso precedente
Strato sottile su lavaggio dell’ago
ESAMI ISTOLOGICI
• BIOPSIE DA SEDI DIVERSE IN CORSO DI
FIBROBRONCOSCOPIA
• AGOBIOPSIE POLMONARI TC GUIDATE
BIOPSIA:
fissazione in formalina
inclusione in paraffina
allestimento di sezioni microscopiche
colorazione con ematossilina-eosina
ESAMI CITOLOGICI
In corso di broncoscopia
Broncoaspirato-lavaggio-espettorato
Metodica “ CITOINCLUSO”
Fissazione in alcool 95°
Inclusione in paraffina
Allestimento sezioni microscopiche
Colorazione con ematossilina –eosina
Vantaggi: conservazione di tutto il materiale
possibilità di allestire preparati per
immunocitochimica e di eseguire metodiche
di biologia molecolare
Brushing
il materiale prelevato viene strisciato sul vetrino,
fissato con citospray e colorato con Papanicolaou
Agoaspirato transcarenale/intralesionale
striscio convenzionale
strato sottile
lo strato sottile offre un fondo pulito,
permette di conservare il materiale per 30 giorni,
di allestire preparati per immunocitochimica e
di eseguire metodiche di biologia molecolare.
ESAMI CITOLOGICI
in corso di agobiopsia percutanea
TC guidata
Agoaspirato (FNA)
Striscio convenzionale
Strato sottile
Valutazione estemporanea adeguatezza del materiale
si esegue su uno o due vetrini convenzionali inviati
immediatamente dopo il prelievo e colorati con una
metodica rapida.
ESAMI CITOLOGICI
in corso di toracentesi
Liquido pleurico
Dal materiale inviato “a fresco”
* si allestiscono 6 vetrini con citocentrifuga
si colorano con Papanicoleau, MGG, PAS
(colorazioni diverse permettono di valutare diverse
caratteristiche cellulari)
*se si forma o è presente un coagulo si allestisce un citoincluso
* il materiale rimanente viene lasciato
nel fissativo liquido per strato sottile
per eventuali ulteriori indagini
(immunocitochimica –biologia molecolare)
FASE ANALITICA
OSSERVAZIONE AL MICROSCOPIO OTTICO
DEL MATERIALE OPPORTUNAMENTE
PROCESSATO
DIAGNOSTICA IMMUNOISTOCHIMICA
ESAMI DI BIOLOGIA MOLECOLARE
FASE POST-ANALITICA
Referto istologico / citologico
descrizione e
conclusione diagnostica
FASE POST-ANALITICA
Referto citologico
1.
INADEGUATO (vedi fase pre-analitica)
2.
NEGATIVO PER CELLULE MALIGNE
3.
4.
DUBBIO
SOSPETTO
5.
POSITIVO PER CELLULE MALIGNE
In ogni tipo di patologia oncologica ,ma in modo
particolare nella diagnostica delle neoplasie toraciche,
due sono le questioni fondamentali da affrontare
• LA NEOPLASIA IN ESAME E ‘ PRIMITIVA ?
SE METASTATICA DA DOVE VIENE ?
• QUAL E’ L’ISTOTIPO DELLA NEOPLASIA ?
In entrambi i casi, oltre all’osservazione delle
caratteristiche citoarchitetturali della neoplasia ,che
rimane il punto fondamentale della diagnostica ,sono di
aiuto le metodiche immumocitochimiche .
IMMUNOCITOCHIMICA
Si ricercano antigeni presenti nelle cellule
tumorali, diversi da neoplasia a neoplasia,
tramite anticorpi specifici ai quali è legato
un segnale colorato.
Se la reazione antigene-anticorpo avviene,
cioè se nelle cellule è presente l’antigene
cercato, il segnale colorato è visibile al
microscopio ottico.
CASI ESEMPLIFICATIVI
1) liquido pleurico con cellule chiaramente maligne le cui
caratteristiche pongono il problema della diagnosi
differenziale fra adenocarcinoma metastatico e
mesotelioma
Si eseguono indagini mmunocitochimiche usando il
pannello costituito dagli anticorpi CEA e Calretinina
Risultati possibili:
CEA+ Calretinina – …….. Adenocarcinoma
CEA- calretinina + ………. Mesotelioma
Nel caso adenocarcinoma si pone il quesito
dell’origine della neoplasia che può derivare dal
polmone, dal colon,dall’ovaio……..
Può essere di aiuto un pannello costituito da
citocheratina 20 ,citocheratina 7,ttf1
Risultati possibili
ttf1+ citocheratina 7+citotocheratina 20 –
Depone per carcinoma del polmone
ttf1 –citocheratina 7-citocheratina 20+
Depone per carcinoma del colonretto
2) Carcinoma primitivo del polmone con alterazioni
cellulari poco differenziate,del quale si vuole determinare
con la maggiore accuratezza possibile l’istotipo.
Cd56 + neoplasie neuroendocrine
Citocheratina 7+ adenocarcinoma
P63+
carcinoma squamoso
3) Cellule da microcitoma versus linfociti
Lca - CD56 + microcitoma
Lca+ CD56- linfociti
Liquido pleurico mesotelioma
MGG citocentrifuga
Mesotelioma Liquido pleurico Citocentrifuga Calretinina
Mesotelioma liquido pleurico citoincluso calretinina
Adenocarcinoma del polmone espettorato citocheratina 7
Stesso caso P63
LIMITI DELLA METODICA
1)Tumori diversi hanno antigeni in comune
(Ck 7+ /20- caratterizza carcinoma del polmone ,ma anche di
mammella,endometrio e pancreas)
2) Non sempre i tumori esprimono gli antigeni che
dovrebbero caratterizzarli ( il ttf1 caratteristico degli
adenocarcinomi del polmone è espresso nel 70% circa dei casi)
3) La presenza di necrosi altera l’antigenicità dei tessuti.
4) Lo stesso effetto è prodotto da non corretta fissazione e
conservazione del materiale .
5) Cellule della stessa origine maligne o benigne
esprimono gli stessi antigeni (la calretinina non è di aiuto nel
distinguere fra mesoteli attivati e mesoteli maligni ,il cui aspetto
citologico è in parte sovrapponibile)
L’accuratezza diagnostica nella determinazione dell’istotipo
neoplastico si riflette su terapia e prognosi,poiché i percorsi
terapeutici sono diversi per neoplasie diverse.
E’ quindi doverosa la distinzione fra fra neoplasie
neuroendocrine(microcitoma),adenocarcinoma e carcinoma
squamoso.
Anche all’interno dello stesso istotipo neoplastico si sono
individuati trattamenti farmacologici differenziati,in base a
alterazioni genetiche e mutazioni presenti o meno nella
neoplasia.
L’evidenziazione di queste alterazioni richiede l’uso di
tecniche di biologia molecolare
.
Indagini di biologia molecolare
Analisi molecolare mediante PCR e
sequenziamento diretto per ricerca mutazioni
esoni 19 e 21 del gene EGFR
Adenocarcinoma
Analisi mediante metodica di ibridazione in situ
flourescente (FISH) per riarrangiamento gene
ALK
Carcinoma non piccole cellule pre-trattato
KRAS BRAF ROS1
quando non sono presenti altre alterazioni geniche
Frequency of EGFR mutations
and its subtypes.
Tanaka et al.
Int J Cancer. 126:651-5, 2010.
Cases examined N= 1117
30%
Mutated
N= 335
Wild type
Exon 18
N= 9 (3%)
Exon 21
(L858R/Q)
N= 143
(41%)
Exon 19
Deletions
N= 192
(56%)
14
16
Frequency of EGFR mutations
In Italy.
13%
Cases examined N= 1390
Mutated
N= 174
Wild type
384
Exon 18
N= 6 (3%)
348
394
264
Exon 21
(L858R/Q)
N= 82
(47%)
Exon 19
Deletions
N= 86
(49%)
19
ESONE 19 MUTATO
Dott.ssa
Francesca Castiglione
ESONE 19 WT
Dott.ssa
Francesca Castiglione
Dott.ssa
Francesca Castiglione
Centro di riferimento
DIPARTIMENTO DAI BIOMEDICINA
SOD ISTOLOGIA PATOLOGICA E DIAGNOSTICA
MOLECOLARE
DIRETTORE GL.TADDEI
Dott.ssa
Dott.ssa
Francesca Castiglione
Milena Paglierani
UN FATTORE LIMITANTE NELLA DIAGNOSTICA
DELLE NEOPLASIE TORACICHE
E’ RAPPRESENTATO DALLA QUANTITA’
DI MATERIALE A DISPOSIZIONE.
Si deve infatti ricordare che in questo tipo di diagnostica
i campioni prelevati consistono o di piccole biopsie o, molto
più spesso ,di materiale citologico costituito talvolta da un
numero scarso di elementi cellulari.
Ne conseguono sia difficoltà nella diagnostica classica sia
nella applicazione di pannelli immunocitochimici ottimali,
sia nel reperire materiale per biologia molecolare.
LA FASE POST-ANALITICA
ALTRI REPERTI
•QUADRI CITOLOGICI RICONDUCIBILI A TBC
•ALTERAZIONI CITOLOGICHE DA VIRUS
•PRESENZA DI PARASSITI
•PRESENZA DI FUNGHI
•PRESENZA DI BATTERI
Agoaspirato polmonare: tubercolosi
BAL Pneumocystis carinii
Stesso caso immunocitochimica
Aspergillo . agoaspirato polmonare .strato sottile
Mucor . Lavaggio bronchiale
Mucor .lavaggio bronchiale
espettorato alterazioni cellulari da Herpes virus
Brushing tracheale alterazioni citologiche da HPV
Biologia molecolare HPV 16
Lavaggio bronchiale actinomiceti
Lavaggio bronchiale actinomiceti
Un sincero grazie allo staff tecnico
della U.O.di Anatomia Patologica