“I parametri
spermatici non
convenzionali:
indicazioni a
una
diagnostica di
II livello”
Rosita A. Condorelli
Andrologia ed Endocrinologia
Policlinico “G.Rodolico”, Università di Catania
Perché eseguire i parametri di II livello?
• Forniscono dati sulla
“funzionalità”
nemaspermica
• Sede e natura del danno
• Spiegano quei casi di
infertilità definiti idiopatici
Evidenze della letteratura
Parametri II livello
Compattazione della cromatina nemaspermica
Frammentazione del DNA nemaspermico
Funzione mitocondriale (MMP)
Apoptosi nemaspermica (esternalizzazione della PS)
Conta dei leucociti nel liquido seminale
8-idrossi,2-desossiguanosina
Perossidazione lipidica
Compattazione della cromatina
• Il processo di compattazione della cromatina è
importante per l’adeguato impacchettamento
del materiale genetico e quindi per il suo sicuro
trasferimento all’oocita
• Infatti, tale processo ha inizio durante la
spermiogenesi (spermatidi in spermatozoi
maturi), dove oltre alla forma delle cellule
(espulsione del citoplasma, formazione del
flagello e dell’acrosoma, riarrangiamento dei
mitocondri), anche i nuclei assumono diversa
conformazione
• Inizialmente si formano i nucleosomi, DNA
complessato con proteine denominate istoni
collegati da regioni di DNA di collegamento
(aspetto a “collana di perle”)
• Successivamente gli istoni subiscono un
processo di acetilazione che riducendo l’affinità
di questi per il DNA ne permette il distacco da
essi
Compattazione della cromatina
• Queste ultime sono sostituite dalle protamine il cui
ruolo principale è quello di provvedere alla
condensazione finale della cromatina e alla sua
stabilizzazione
• La stabilità della cromatina è determinata dal
numero di legami disolfuro (ossidazione dei gruppi
tiolici) della cisteina presente in protamine adiacenti
• Si formano così, subunità toroidali contenenti
ciascuna circa 50 kb di DNA. Al termine del
processo il DNA sarà formato da 50.000 strutture
toroidali all’interno del nucleo dello spermatozoo
• La valutazione del numero di legami disolfuro delle
protamine ha permesso di dimostrare che la
stabilizzazione della cromatina ha inizio nel testicolo
e continua nell’epididimo durante il passaggio degli
spermatozoi lungo tale tratto
Tecniche
Le tecniche per la determinazione dell’integrità
cromatinica finora adottate sono:
• Test con arancio di acridina
• Test con ioduro di propidio
• Test con blu di anilina
• Test con cromomicina A3
• Test con blu di toluidina
Compattazione della cromatina
Test con ioduro di propidio
Soggetto con normale
compattazione cromatinica
Soggetto con alterata
compattazione cromatinica
PI entra all’interno delle cellule dopo adeguata
permeabilizzazione della membrana cellulare e tanto più la
cromatina è compatta tanto meno esso potrà legarsi ad essa
Frammentazione del DNA spermatico
Perché il DNA si frammenta?
Il processo con cui ciò avviene non è del tutto chiaro
•
Persistenza degli istoni che determinano instabilità cromatinica durante la
spermiogenesi
Quando il DNA è complessato alle protamine e quindi molto stabile,
diventa resistente agli enzimi digestivi. McPherson e Longo nel 1992,
hanno osservato la presenza di filamenti di DNA danneggiato e hanno
proposto che essi potrebbero essere dovuti a un’errata sostituzione degli
istoni con le protamine. Tali filamenti devono essere di nuovo compattati e
legati per azione degli enzimi nucleari come la topoisomerasi II e se
questo non ha luogo il DNA rimane frammentato
Infatti è nota la correlazione fra DNA frammentato e alterata
compattazione della cromatina (Manicardi et al, 1998) e un aumento della
sensibilità alla denaturazione
Topoisomerasi II
Frammentazione del DNA spermatico
Perché il DNA si frammenta?
Il processo con cui ciò avviene non è del tutto chiaro.
•
Persistenza degli istoni che determinano instabilità cromatinica durante la
spermiogenesi
Quando il DNA è complessato alle protamine e quindi molto stabile,
diventa resistente agli enzimi digestivi. McPherson e Longo nel 1992,
hanno osservato la presenza di filamenti di DNA danneggiato e hanno
proposto che essi potrebbero essere dovuti a un’errata sostituzione degli
istoni con le protamine. Tali filamenti devono essere di nuovo compattati e
legati per azione degli enzimi nucleari come la topoisomerasi II e se
questo non ha luogo il DNA rimane frammentato.
Infatti è nota la correlazione fra DNA frammentato e alterata
compattazione della cromatina (Manicardi et al, 1998) e un aumento della
sensibilità alla denaturazione
Tecniche
Le tecniche finora utilizzate per la
valutazione della frammentazione del
DNA spermatico sono:
• Comet
• TUNEL
• SCSA
Esiste una mancanza di consenso, non
tanto sulla tecnica da utilizzare quanto
sui valori di riferimento da adottare
(TUNEL)
TUNEL
Il test TUNEL è basato sulla capacità dell’enzima TdT di
riconoscere e legare le estremità 3’OH libere che si trovano
a livello dei filamenti di DNA liberi e quindi interrotti. Tale
enzima viene omesso nel controllo negativo che ci permette
di rilevare la esatta % di cellule con DNA frammentato
Due metodi possono essere adottati sulla base del controllo
negativo:
• Threshold-setting (fissando una soglia sul controllo
negativo)
• Subtraction-blank (sottraendo l’istogramma del controllo
negativo da quello del campione in esame)
TUNEL
DNA-fragmentation
DNA-fragmentation
Soggetto con normale frammentazione del DNA
(controllo negativo sovrapponibile al campione in esame)
TUNEL
DNA-fragmentation
DNA-fragmentation
Soggetto con elevata frammentazione del DNA
(controllo negativo e campione in esame)
Conseguenze di DNA alterato
• Spermatozoi eiaculati con DNA alterato, indipendentemente dall’entità del
danno, fertilizzano gli oociti allo stesso modo di spermatozoi normali (Ahmadi
and Ng, 1999)
• Anche se l’oocita ha la capacità di riparare danni pre-esistenti del DNA
spermatico, al di sopra di una certa soglia la sua capacità riparativa diventa
inadeguata (Ahmadi and Ng, 1999)
• Se il DNA non è capace di decondensarsi dopo essere entrato nel citoplasma
dell’oocita la fertilizzazione potrebbe fallire o arrestarsi (Tomsu et al, 2002);
inoltre esiste anche il rischio che all’aumentare del grado di danno del DNA
aumenti la probabilità di perdere una gravidanza
Conseguenze di DNA alterato
… e sui parametri spermatici?
• Studi animali indicano che la frammentazione del DNA valutata con SCSA è
scarsamente correlata ai parametri convenzionali del liquido seminale
(Everson et al, 1999)
• Altri studi hanno sottolineato l’associazione fra la presenza di danno al DNA
spermatico e alterati parametri convenzionali (Sun et al, 1997; Lopes et al,
1998; Irvine et al, 2000)
Gli spermatozoi con tali anomalie sono meno mobili, più immaturi e
meno responsivi al test ipo-osmotico, e ciò sta ad indicare una scarsa
funzionalità e integrità della membrana (Jeyendan et al, 1984)
Inoltre la presenza di DNA frammentato è associata con la presenza di
residui citoplasmatici nelle cellule spermatiche (Muratori et al, 2000)
Correlazione fra frammentazione del DNA (TUNEL) si ha con:
- età, motilità totale, motilità progressiva rapida, vitalità, forma normali
Nessuna correlazione invece si riscontra con:
- densità, volume, pH, alterazioni della testa e dell’acrosoma, leucociti e
neutrofili (Cohn-Bacrie et al, 2009)
Dunque …
• Un basso DFI non assicura una fertilità normale
• Allo stesso modo, un DFI elevato non preclude la
possibilità di avere una gravidanza normale a termine.
• Anche se gli spermatozoi con DNA alterato fertilizzano
l’oocita, esiste la possibilità che si sviluppino anomalie
genetiche nel nascituro
Funzione mitocondriale
• La motilità spermatica e quindi il movimento
del flagello sono il risultato di un processo
molecolare complesso (ossidazione dei
substrati energetici, fosforilazione della
proteine, conversione dell’energia da chimica
a meccanica)
• L’ATP, indispensabile per tale processo, viene
prodotto in differenti regioni del flagello
attraverso la fosforilazione ossidativa
(mitocondri) e la glicolisi
• La quota più rilevante di ATP viene però
prodotta attraverso la fosforilazione
ossidativa
• L’MMP, è il parametro che meglio riflette la
funzione mitocondriale e rappresenta un
importante indicatore dello stato energetico
del mitocondrio
Funzione mitocondriale
• Vari studi hanno evidenziato la correlazione fra alterata
funzionalità mitocondriale , dimostrata da una riduzione
dell’MMP e la riduzione della motilità spermatica e la
capacità riproduttiva (Troiano et al, 1998; Kasai et al,
2002; Wang et al, 2003)
• Gallon et al, 2006 hanno dimostrato che spermatozoi con
MMP elevato presentavano una maggiore % di forme
normali, motilità più elevata, migliore capacità di realizzare
la reazione acrosomiale
• Recentemente Paoli et al, 2011, hanno mostrato una
correlazione positiva fra MMP e motilità totale in 230
soggetti. Inoltre, la % di spermatozoi con elevato MMP
correlava positivamente con la vitalità spermatica
JC-1
•
Il JC-1 (5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide) è
la sonda più affidabile e specifica per la valutazione del potenziale di membrana
mitocondriale (Lugli et al, 2007)
•
Nelle cellule con potenziale di membrana conservato, si trova in forma monomerica
nel citosol (verde) e si accumula inoltre come aggregato nei mitocondri (all’interno
dei quali penetra grazie alla carica negativa del potenziale di membrana intatto ed
essendo lipofilica) dove emette in arancio.
•
Nelle cellule con potenziale di membrana alterato resta, invece, in forma monomerica
nel citosol (verde) in quanto non può accumularsi all’interno del mitocondrio a causa
del potenziale danneggiato
JC-1
Soggetto con più elevato
numero di cellule con
potenziale di membrana
ridotto
Soggetto con assenza di
cellule con potenziale di
membrana ridotto
Conseguenze di MMP alterato
• Un studio recente ha esaminato 91 coppie che si
sottoponevano PMA e messo in correlazione il
potenziale di membrana degli spermatozoi con i
risultati ottenuti
• Da tale studio emerge che il potenziale di membrana
è in correlazione con il tasso di fertilizzazione e con la
motilità spermatica
• Nessuna relazione con la qualità embrionale
• Nessuna coppia raggiungeva la gravidanza se più del
64% degli spermatozoi presentava potenziale
danneggiato
Marchetti et al, 2011
Apoptosi nemaspermica
ANN-V
Conta dei leucociti nel liquido
seminale
 Recentemente, la valutazione delle sottopopolazioni leucocitarie
nell’eiaculato sembra acquisire una rilevanza clinica sempre maggiore
(Seshadri et al., 2011)
 Leucociti nell’eiaculato: procedura istochimica che identifica l’enzima
perossidasi, caratteristico dei granulociti
 Questa tecnica non individua i polimorfonucleati attivati che hanno rilasciato
i loro granuli e tutti gli altri tipi di leucociti (linfociti, macrofagi e monociti)
che non contengono perossidasi, né la presenza di altre sottoclassi di
leucociti
 Infezione/infiammazione presente o meno, senza definire la causa di essa
(batterica, virale, acuta o cronica)
 “Formula leucocitaria” nel liquido seminale
Importanza diagnostica e terapeutica
Conta dei leucociti nel liquido
seminale
Leucociti
Linfociti T-helper
Neutrofili, macrofagi e monociti
Linfociti T-suppressor
Stress ossidativo
8-idrossi,2-desossiguanosina
Perossidazione lipidica
M540 bodies
Conclusioni
A chi richiedere i parametri di II livello del liquido seminale?
• Aborti ripetuti
• Età avanzata
• Chemioterapie o altri trattamenti
• Patologie sistemiche determinanti stress ossidativo (DM, IR, ecc..)
Ma non solo …
Flow-chart: indicazioni alla diagnostica di II livello
ROS
Esame del liquido
seminale
Motilità
Numero leucociti
Normale
Elevato
Vitalità
Spermiocoltura
positiva
Viscosità
pH
Agglutinazioni/aggregazioni
Macrofagi, spermiofagi ecc..
8-idrossi,2desossiguanosina
Spermiocoltura
negativa
Funzionalità
mitocondriale
Apoptosi
nemaspermica
Compattazione
cromatinica
Frammentazione
DNA
Terapia
pro-cinetica
Perossidazione
lipidica
Terapia
antiossidante
Terapia
antibiotica
Conta leucocitaria
Terapia
antinfiammatoria
Terapia antivirale
Flow-chart: indicazioni alla diagnostica di II livello
ROS
Esame del liquido
seminale
Motilità
Numero leucociti
Normale
Elevato
Vitalità
Spermiocoltura
positiva
Viscosità
pH
Agglutinazioni/aggregazioni
Macrofagi, spermiofagi ecc..
8-idrossi,2desossiguanosina
Spermiocoltura
negativa
Funzionalità
mitocondriale
Apoptosi
nemaspermica
Compattazione
cromatinica
Frammentazione
DNA
Terapia
pro-cinetica
Perossidazione
lipidica
Terapia
antiossidante
Terapia
antibiotica
Conta leucocitaria
Terapia
antinfiammatoria
Terapia antivirale
Conclusioni
A chi richiedere i parametri non convenzionali del liquido seminale?
•Aborti ripetuti
•Età avanzata
•Chemioterapie o altri trattamenti
•Patologie sistemiche determinanti stress ossidativo (DM, IR, ecc..)
Ma non solo…
nei casi di “infertilità idiopatica”
Ringraziamenti
Prof. Aldo E. Calogero
Prof. Sandro La Vignera
Prof. Enzo Vicari
Prof. Maurizio Di Mauro
Prof. Salvatore Tumino
Dr. Filippo Giacone
Specializzandi
Biologi e tecnici di laboratorio
Dott.ssa Dr.ssa Laura Cimino
Dott.ssa Laura Mongioì
Dott.ssa Ylenia Duca
Dr. Giovanni Burgio
Dr.ssa Nunziata Barone
Dr.ssa Nunziatina Burrello
Sig. Domenico Recupero
Dottorandi
Dr.ssa Concetta Costa
Dr.ssa Caterina Leone
Sig.ra Laura Pappalardo
Dr.ssa Linda Iacoviello
Dr. Carmelo Puglisi
Personale infermieristico
Citofluorimetria
FLUOROCROMO
ANTICORPO
La citometria a flusso è
una metodica che
permette di valutare
parametri fisici e chimici di
particelle biologiche o
cellule contenute in una
sospensione che passano
attraverso un sistema di
rilevazione otticoelettronico
ANTIGENE
Analizza le
fluorescenze
emesse
Vantaggi
•




analisi di un alto numero di eventi
bassi tempi di analisi (sec)
scelta della popolazione da analizzare “gating“
analisi di eventi rari
acquisizione contemporanea di 10 parametri per cellula
Svantaggi
• non associa il dato derivato dall’analisi a quello morfologico
I nostri dati..
L’oligozoospermia e la astenozoospermia si
associano ad un aumento della % di
spermatozoi con danno mitocondriale, della
cromatina e in apoptosi
La teratozoospermia si associa ad un aumento
della % di spermatozoi con danno mitocondriale
e della cromatina