Il checkpoint del fuso mitotico
(Pietro Perini-gruppo ciclo cellulare)
1) Prima di approfondire la funzione del checkpoint del fuso mitotico, è
opportuno ricordare quali sono le caratteristiche e le funzioni principali del
fuso mitotico. La sua funzione è quella di permettere la corretta segregazione
dei cromatidi fratelli. Essi restano attaccati per mezzo del cinetocoro fino alla
metafase, e la loro segregazione decreta l’inizio dell’anafase. La formazione
del fuso avviene comunque in modo graduale sin dall’inizio del processo
mitotico. Passando alla struttura del fuso mitotico, è opportuno ricordare che in
metafase i microtubuli originano dai poli mitotici e si legano al centromero dei
cromatidi fratelli per mezzo dei cinetocori.
2) Dopo l’introduzione relativa al fuso mitotico, si passa ora ad analizzare nello
specifico l’argomento che approfondirò: il checkpoint del fuso mitotico. Esso
avviene tra la fine della metafase e l’inizio dell’anafase ovvero, come ricordato
poc’anzi, all’inizio del processo di separazione dei cromatidi fratelli verso i
corrispettivi poli mitotici. In altre parole, il checkpoint del fuso controlla il
corretto svolgimento della segregazione cromosomica, aspetto fondamentale
per garantire alle due cellule figlie lo stesso assetto cromosomico. La funzione
del checkpoint viene esplicata grazie alla generazione del segnale di wait
anaphase, qualora si fosse in presenza di alterazioni a carico del processo di
segregazione cromosomica. Il segnale di wait anaphase viene mantenuto finche
non siano state ripristinate le corrette condizioni per procedere verso l’anafase,
ovvero finché non sia possibile una corretta segregazione dei cromatidi fratelli.
E’ perciò abbastanza intuitivo dedurre che ogni alterazione a carico del
checkpoint del fuso mitotico porti ad aneuploidia, ovvero ad alterazioni del
numero dei cromosomi: infatti, se la segregazione dei cromatidi fratelli non
avvenisse nel modo corretto, e la cellula non venisse informata di questa
anomalia, l’anafase potrebbe procedere anche in assenza delle migliori
condizioni, e a ciò conseguirebbe un aumento della percentuale di errore del
numero dei cromosomi.
3) Ma quali sono gli aspetti controllati dal checkpoint del fuso mitotico? Gli studi
effettuati sino a questo punto ne hanno evidenziati due: l’attaccamento dei
microtubuli ai cinetocori e la tensione esercitata sui cinetocori dopo
l’attaccamento bipolare dei microtubuli. Per attaccamento bipolare si intende il
legame tra microtubuli di un fuso polare e un solo cinetocoro del centromero.
E’ opportuno ricordare che il primo aspetto è l’unico dei due ad essere stato
comprovato grazie ad esprimenti inconfutabili, mentre il secondo aspetto è
stato ipotizzato, ma mancano prove certe relative alla sua importanza nel
processo.
4) Dopo aver trattato gli aspetti generali è opportuno analizzare con maggiore
precisione gli aspetti del checkpoint, partendo dagli elementi che lo
costituiscono. La tabella illustrata sulla slide mette in evidenza che le proteine
che intervengono nel checkpoint sono molteplici, e lo stesso si può affermare
riguardo alle loro funzioni. La proteina meglio caratterizzata è Mad2, ritenuta
ad oggi uno degli elementi più importanti del checkpoint. Il processo però non
vede coinvolte solo le singole proteine, ma anche i complessi che tra esse si
formano. In quest’ottica è importante ricordare che il complesso Bub3-BubR1
svolge la stessa funzione di Mad2, sebbene non siano ancora chiare le modalità
della sua attività. Le funzioni dei diversi elementi verranno trattate in modo più
specifico nelle prossime slides.
5) Focalizzandosi sulla funzione di Mad2 (e di riflesso sul complesso Bub3BubR1 che, come detto in precedenza, ha funzione analoga a quella di Mad2),
la figura permette di comprendere come viene generato il segnale di wait
anaphase: se uno od entrambi i microtubuli del fuso non sono attaccati ai
cinetocori corrispondenti, Mad2 e Bub3-BubR1 formano un complesso con
Cdc20 inattivandolo. Quest’ultimo è un fattore attivante APC (anaphase
promoting complex), un’ubiquitina ligasi che è responsabile della
degradazione di alcuni elementi implicati nel controllo della progressione in
anafase. In particolare, APC legato a Cdc20 poliubiquitina la Securina che in
wait anaphase è legata alla Separasi. La rottura del complesso securinaSeparasi permette alla Separasi stessa di degradare la Coesina, proteina che, se
presente in forma fosforilata, mantiene assemblato il cinetocoro. Questo evento
disassembla il cinetocoro permettendo la separazione dei cromatidi fratelli, e
ciò corrisponde appunto all’inizio dell’anafase.
6) A questo punto è lecito chiedersi come viene regolata la formazione del
complesso Mad2/Bub3-BubR1/Cdc20. Che cosa sta alla base del processo?
Come ho già accennato nel punto 3, un aspetto fondamentale regolato dal
checkpoint del fuso mitotico è l’attaccamento dei microtubuli del fuso ai
cinetocori. A livello molecolare avviene un turnover di Mad2 (illustrato in
figura A), che accoppia questo aspetto con l’attivazione di APC. Mad2 è
presente nel citoplasma cellulare in forma inattiva. Quando il cinetocoro non è
legato al microtubulo, Mad2 inattivo può legarsi ad esso grazie all’interazione
con Mad1, proteina del cinetocoro. La conseguenza del legame è la formazione
ed il rilascio di Mad2 attivato che può complessare con Cdc20, rendendo
quest’ultimo fattore non disponibile per il legame con APC. Nella Figura B è
invece illustrato ciò che avviene in presenza del legame microtubulocinetocoro: Mad2 inattivo non può legarsi al cinetocoro, che è occupato dal
microtubulo. Questo aspetto impedisce la formazione di Mad2 attivato, e
perciò Cdc20 è libero di interagire con Apc attivandolo. Ciò determina l’inizio
dell’anafase.
7) Due interazioni di Mad2 sono il cuore del checkpoint del fuso mitotico: la
prima è l’interazione con Mad1, che permette il reclutamento di Mad2 nei
cinetocori. La seconda è l’interazione con cdc20 che, come si è già detto in
precedenza, genera il segnale di wait anaphase. La figura espone ciò che
avviene a livello molecolare. Il primo passo verso la comprensione di questo
meccanismo è coinciso con la scoperta dell’ altissima omologia di sequenza
che caratterizza una porzione legante di Mad2 delle molecole Mad1 e Cdc20.
Per spiegare l’interazione con esse, e dunque il funzionamento di Mad2 è stato
proposto il seguente modello molecolare, denominato safety belt (cintura di
sicurezza): Mad2 ha una sequenza particolare nella porzione C-terminale.
Questa porzione agisce come una cintura di sicurezza, permettendo prima
l’entrata delle molecole che interagiscono con Mad2, e in seguito l’uscita delle
stesse vincolata a determinate condizioni. In riferimento al ciclo di Mad2, ciò
che avviene inizialmente è che la cintura di sicurezza si apra permettendo
l’interazione con Mad1 (ovvero il reclutamento di Mad2 da parte del
cinetocoro non legato al microtubulo). La chiusura della porzione C-terminale
di Mad2 impedisce l’allontanamento da Mad1, ed avviene una modificazione
conformazionale che porta alla chiusura di Mad2. In presenza di Cdc20, con un
processo ancora da chiarire, avviene apertura della tasca di Mad2, rilascio di
Mad1 e interazione con Cdc20, che rimpiazza Mad1. Si verifica una nuova
chiusura di Mad2 che rende Cdc20 inaccessibile per APC. E’ ben evidente la
doppia funzione di Mad2: esso è un componente sia del segnale di wait
anaphase, sia della macchina catalica richiesta per generare lo stesso .
8) Dopo avere esposto i processi generali e molecolari che stanno alla base del
segnale di wait anaphase, è opportuno elencare quali sono i fattori responsabili
del suo silenziamento. E’ intuitivo, infatti, che qualora esistano le condizioni
sufficienti per la progressione in anafase del processo mitotico, il suddetto
segnale debba essere interrotto. La conseguenza di ciò è la separazione dei
cromatidi fratelli che coincide con l’inizio dell’anafase. Il fattore più
importante che permette l’interruzione del segnale di wait anaphase è
indubbiamente l’avvenuto attaccamento bipolare tra i microtubuli e i
cinetocori. In altre parole, entrambi i cinetocori devono essere attaccati ai
cinetocori. Il secondo fattore è un’ulteriore implementazione del primo
(esporrò nelle prossime slides il perché): dev’essere presente la tensione
esercitata dai microtubuli sui cinetocori, dopo che sia avvenuto l’attaccamento
bipolare. Esiste poi un terzo fattore che non è stato ancora caratterizzato al
meglio: dopo l’avvenuto contatto tra microtubuli del fuso e cinecori, alcune
molecole del cinetocoro migrano verso il polo generatore del fuso, agendo da
regolatori della sua attività.
9) Il primo fattore è già stato esposto in precedenza. In aggiunta a quanto detto, è
utile ricordare che le molecole costituenti la porzione del cinetocoro che
interviene nell’attaccamento ai microtubuli sono da considerare come vere e
proprie costituenti del checkpoint del fuso, in quanto sono influenzate da
attività regolatoria. Tra esse, particolarmente importante è la dineina. Sono
presenti due piattaforme, e i microtubuli interagiscono esclusivamente con la
piattaforma esterna.
10)
Il secondo fattore importante per l’interruzione del segnale di wait
anaphase è la tensione esercitata dai microtubuli. Sebbene non esistano prove
dirette che ne confermino l’esistenza, l’ipotesi della sua importanza resta
valida: potrebbe infatti avvenire che un microtubulo si leghi ad entrambi i
cinetocori, ed è intuitivo che da ciò deriverebbe aneuploidia in quanto entrambi
i cromatidi fratelli migrerebbero verso lo stesso polo mitotico. La tensione
esercitata che determini il segnale di stop deve essere perciò di intensità
sufficiente, ma soprattutto deve avvenire in due direzioni opposte tra loro:
ciascuna di esse permette l’avvicinamento ad un polo del fuso mitotico.
11)
Il terzo fattore che interviene nel silenziamento del segnale è la
migrazione dal cinecoro al polo del fuso di alcune molecole facenti parte del
checkpoint del fuso mitotico, sfruttando il microtubulo come binario per il
movimento dineinico. Come evidenziato dalla figura, le proteine coinvolte
sono molteplici: Zw10 e Rod sono coinvolte nella localizzazione della dineina
a livello del cinetocoro, CENP-E interagisce con BubR1 e con i microtubuli, ed
infine è interessante notare che avviene una migrazione anche di Mad2, la
molecola centrale del checkpoint. Intuitivamente, ciò potrebbe essere spiegato
come un up-take della stessa Mad2 per diminuirne la disponibilità a livello dei
cinetocori.
12)
In conclusione, risulta evidente che il checkpoint del fuso mitotico
ricopre una notevole importanza all’interno del ciclo cellulare e della sua
regolazione, in quanto a controlla un processo fondamentale quale è la mitosi.
La conoscenza del processo rimane però limitata, e sono in corso attualmente
diversi studi che cercano di ampliare le conoscenze attualmente note. In primis,
è lecito chiedersi se il segnale di wait anaphase agisca solo su APC oppure se
esso venga anche inviato ad un centro di controllo. La domanda è giustificata
dal fatto che un solo segnale di wait anaphase (a carico di un solo cromosoma)
è sufficiente per interrompere l’anafase in tutta la cellula. Un altro aspetto da
chiarire è poi come venga stabilizzato il complesso Cdc20, vale a dire come
avvengono i meccanismi molecolari del processo (si ricordino i punti in ombra
del modello a cintura di sicurezza). Un altro passaggio importante
consisterebbe nel fare luce sulla vera natura del complesso Mad2/BubR1Bub3/Cdc20. Mad2 e Bub3-BubR1 agiscono in competizione o si forma
effettivamente un complesso a 4 molecole? Chiarire questi aspetti potrebbe
permettere di capire a fondo i meccanismi del checkpoint del fuso mitotico, e
ciò potrebbe essere un aiuto per risolvere, almeno in parte, l’aneuploidia,
alterazione che a volte ha conseguenze gravi per l’organismo, come
testimoniano diverse patologie che da essa derivano.
Checkpoint del Fuso Mitotico
Il fuso mitotico
• La funzione del fuso mitotico è di
permettere la corretta segregazione dei
cromatidi fratelli
• La sua attività viene esplicata durante la
metafase e soprattutto durante l’anafase
• E’ composto dai microtubuli, che originano
dai poli mitotici e si legano al centromero
dei cromatidi per mezzo dei cinetocori
Il checkpoint del fuso mitotico
• Avviene nei cinetocori tra la metafase e
l’anafase
• Controlla il corretto svolgimento della
segregazione cromosomica
• In presenza di alterazioni genera il segnale di
“wait anaphase”
• Il segnale di “wait anaphase” viene mantenuto
finchè non ci siano le condizioni per procedere
all’anafase
• Una qualsiasi alterazione a carico del
checkpoint causa aneuploidia
Aspetti controllati dal checkpoint
• L’attaccamento dei microtubuli ai
cinetocori
• La tensione esercitata sui cinetocori dopo
l’attaccamento bipolare dei microtubuli
Elementi del checkpoint
Ruolo di Mad2 nel checkpoint
Il turnover di Mad2 nel checkpoint
Interazione di Mad2 con i suoi partner
Cosa determina il silenziamento
del segnale di “wait anaphase”?
•L’avvenuto attaccamento bipolare tra
microtubuli e cinetocori
•La tensione esercitata dai microtubuli
dopo l’attaccamento bipolare
•La migrazione di alcune molecole del
checkpoint dai cinetocori al polo del
fuso
Attaccamento microtubulocinetocoro
La tensione esercitata dai
microtubuli nel checkpoint
Migrazione di molecole del
checkpoint verso il polo del fuso
Aspetti del checkpoint da chiarire
• Il segnale di “wait anaphase” inibisce
direttamente APC o viene inviato ad un
“centro di controllo”?
• Come viene stabilizzato il complesso
Mad2-Cdc20?
• Mad2 e BubR1-Bub3 complessano con
cdc20 o agiscono su esso in modo
separato?