Laurea Specialistica in Biologia
Cellulare e Molecolare
Bioinformatica
RNA non codificanti ed
RNA regolatori
Alessandro Laganà
20 maggio 2008
RNA non codificanti ed RNA regolatori
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Piccoli RNA non codificanti
RNA regolatore
microRNA
RNAi e siRNA
Piccoli RNA non codificanti
• Gli RNA non codificanti (ncRNA) giocano un ruolo
fondamentale nei sistemi biologici complessi, pur
non codificando alcuna proteina.
• Tra i ncRNA maggiormente caratterizzati troviamo i
tRNA (RNA transfer) e gli rRNA (RNA ribosomiali).
• Recenti studi hanno però rivelato diverse altre classi
di ncRNA, aventi funzioni catalitiche e strutturali.
• Questi RNA sono componenti essenziali di complessi
riboproteici (RNP), all’interno dei quali svolgono il
ruolo di guida e riconoscimento di sequenze
nucleotidiche target attraverso il meccanismo di
complementarità delle basi.
Alcuni tipi di ncRNA
• snoRNA (Piccoli RNA nucleolari): sono
implicati nel processamento e nella
maturazione degli RNA ribosomali e di altri
tipi di RNA, aumentandone l’attività.
• miRNA e siRNA: sono piccoli RNA in grado di
regolare l’espressione genica a livello posttrascrizionale, silenziando specifiche molecole
di mRNA.
• piRNA: sono coinvolti nel silenziamento
trascrizionale dei retrotrasposoni nelle cellule
germinali.
RNA non codificanti ed RNA regolatori
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Piccoli RNA non codificanti
RNA regolatore
microRNA
RNAi e siRNA
Regolazione genica post-trascrizionale
• L’espressione genica può essere regolata a livello posttrascrizionale.
• Non è detto che tutto l’mRNA che viene trascritto a
partire da un certo gene venga utilizzato per sintetizzare
la relativa proteina.
Trascrizione
Traduzione
RNA regolatore
• La regolazione post-trascrizionale dell’espressione
avviene per mezzo di molecole di RNA regolatore.
genica
• L’RNA regolatore è una molecola di RNA in grado di legarsi ad
una molecola di mRNA impedendone la traduzione.
• L’RNA regolatore riconosce il suo bersaglio in base al principio
di appaiamento complementare delle basi.
• Gli RNA regolatori sono solitamente piccole molecole di RNA
con una certa struttura secondaria, ma con una regione a
singolo filamento complementare ad una regione a singolo
filamento dell’mRNA bersaglio.
• Nella regolazione basata su small RNA è importante anche la
struttura secondaria della molecola di RNA target.
RNA regolatore e inibizione della
traduzione
• L’appaiamento di una molecola di RNA
regolatore ad una regione a singolo
filamento di mRNA può provocare:
– L’inibizione
della
traduzione
senza
distruzione della molecola di mRNA
– La degradazione della molecola di mRNA
• In entrambi i casi si ha il “silenziamento”
del gene, il cui effetto è la mancata
produzione della proteina corrispondente.
• Perché un RNA regolatore possa legarsi ad
una molecola di mRNA bersaglio:
– La regione di legame sul bersaglio deve
essere accessibile, ovvero meno stabile
(deve contenere una regione, anche piccola,
a singolo filamento).
– Il legame con l’RNA regolatore deve essere
energeticamente favorevole.
Accessibile
Non accessibile
RNA antisenso
• Un gene antisenso codifica per un RNA la cui sequenza è
complementare a quella di un RNA bersaglio:
Target RNA
5’-AGGACTACCGACTAGCATA-3’
3’-TCCTGATGGCTGATCGTAT-5’
Antisense RNA
• A volte il gene antisenso si trova sul filamento opposto a quello
del gene bersaglio, pertanto i due RNA saranno perfettamente
complementari.
• Altre volte gli RNA antisenso vengono trascritti da altre regioni
del genoma, per cui si potrebbe avere una parziale
complementarità delle loro basi.
RNA non codificanti ed RNA regolatori
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Piccoli RNA non codificanti
RNA regolatore
microRNA
RNAi e siRNA
I microRNA
• I microRNA (miRNA) sono piccole molecole di RNA in
grado di regolare negativamente l’espressione di
geni target a livello post-trascrizionale.
• Sono dei piccoli RNA antisenso che mostrano
complementarità parziale (quasi sempre) o totale
(più raramente) delle loro basi rispetto a quelle dei
loro mRNA bersaglio.
• I miRNA sono in grado di impedire la traduzione dei
loro
target
preservandone
la
stabilità
o
provocandone la distruzione.
• Un miRNA può avere più target ed uno stesso mRNA
può essere target di diversi miRNA.
Biogenesi dei miRNA
• I trascritti primari dei geni
miRNA sono chiamati primiRNA.
• I pri-miRNA vengono
tagliati da un enzima
chiamato Drosha in
molecole più piccole, a
doppio filamento,
chiamate pre-miRNA.
• I pre-miRNA vengono esportati nel citoplasma e tagliati in RNA
doppio filamento più piccoli da un altro enzima chiamato Dicer.
• Uno dei due filamenti contiene il miRNA maturo, lungo
solitamente tra i 19 e i 25 nucleotidi, che viene incorporato in
un complesso proteico chiamato RISC.
miRNA
• I miRNA nei RISC sono in grado di legarsi a siti
specifici di mRNA provocandone il silenziamento:
• L’appaiamento della sequenza del miRNA con il suo
sito bersaglio non è perfetto, ma può contenere
bulge e loop.
• Dalle
coppie
miRNA/target
individuate
sperimentalmente emergono alcune regolarità nelle
modalità di appaiamento.
Osservazioni sulle modalità di
appaiamento
• La regione iniziale (5’) del miRNA è chiamata seed e
sembra essere la regione più importante nel
silenziamento.
• E’ lunga solitamente tra i 7 e i 10 nucleotidi, ma
esistono casi di seed più corti o più lunghi.
• Tale regione è solitamente appaiata in modo
perfettamente complementare al suo target:
• Il primo nucleotide del miRNA non è determinante e
può non essere appaiato.
Osservazioni sulle modalità di
appaiamento
• La regione a valle del seed contiene solitamente un bulge
o un loop:
• La regione 3’ del miRNA mostra solitamente una
complementarità imperfetta al suo target.
• Le coppie G:U nella regione del seed sembrano essere
sfavorevoli al silenziamento, sebbene siano ammesse,
mentre sono abbastanza comuni nella regione 3’.
• Infine, le regioni di legame dei miRNA si trovano nella
regione 3’ UTR degli mRNA bersaglio.
Funzioni dei miRNA
• I miRNA svolgono un ruolo centrale nel controllo di numerosi
processi fisiologici:
– Sviluppo
– Differenziamento cellulare
– Apoptosi
• Aberrazioni nella loro espressione (mancanza, sotto o sovra
espressione) sono correlate a diversi tipi di patologie:
– Cancro
– Malattie neurodegenerative
– Malattie cardiache
• Si tratta dunque di molecole molto importanti, il cui studio è
fondamentale nella comprensione dei processi biologici, dei
fenotipi patologici e, di conseguenza, nel design di terapie
innovative.
miRBase
• miRBase è la banca dati ufficiale dei miRNA:
http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/
• Contiene le sequenze dei miRNA maturi e
degli stem-loop precursori, oltre a riferimenti
bibliografici ed informazione sui target.
miRBase
• Cliccando su Browse si può
database organizzato per specie:
sfogliare
l’intero
miRBase
• Per ogni miRNA sono riportati:
Lo stem-loop…
…ed il miRNA maturo
Un problema bioinformatico: la ricerca di
target per i miRNA
• Sebbene si conoscano già quasi 500 miRNA
nell’uomo (e molti altri in altre specie), solo per il
10% di essi è stato individuato almeno un target.
• Problema:
– Dato un miRNA, determinare i suoi possibili mRNA target
• Esistono numerosi tool su web che offrono servizi di
predizione di target per miRNA:
–
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–
TargetScan
PicTar
miRanda
…
• Molti di essi offrono dei database di predizioni già
effettuate da consultare.
RNA non codificanti ed RNA regolatori
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Piccoli RNA non codificanti
RNA regolatore
microRNA
RNAi e siRNA
I siRNA
• I siRNA sono piccole molecole di RNA simili ai
miRNA.
• Non sono codificati da sequenze genomiche ma
derivano da altre molecole di RNA più grandi, spesso
di origine esogena (es. virus).
• Come i miRNA vengono tagliati dal Dicer ed
incorporati nel RISC.
• Si appaiano con complementarità totale a siti
specifici sui loro target (in CDS o UTR)
provocandone la degradazione.
siRNA ed RNA Interference
• I siRNA sono le principali molecole utilizzate nell’RNA
Interference (RNAi) artificiale.
• I siRNA vengono disegnati ad hoc sulla base del sito
di legame scelto sul trascritto da silenziare ed hanno
generalmente complementarità totale al loro target.
• Le molecole di siRNA vengono solitamente introdotte
nelle
cellule
mediante
vettori
virali,
virus
ingegnerizzati che trasportano l’informazione per la
codifica dei siRNA nel loro genoma.
• Un uso tipico dell’RNAi è il knock-out artificiale dei
geni, ovvero il silenziamento dell’espressione di uno
più geni per studiarne gli effetti e le conseguenze e
di conseguenza le funzioni svolte.
RNA interference
• Premio Nobel 2006 per la Medicina
Craig Mello ed Andrew Fire